CN110079632A - 一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒 - Google Patents

一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种玉米品种陕单609纯度检测InDel分子标记试剂盒，涉及一种分子标记检测试剂盒，利用父母本双亲互补特异性InDel引物对玉米品种陕单609进行纯度检测，以玉米品种陕单609及父母本双亲的基因组DNA为摸板，通过对全基因组的InDel引物进行筛选，获得两对双亲互补、特异性强、重复性高、结果稳定的InDel引物，由其两对特异性引物和Taq酶等试剂开发出针对玉米品种陕单609纯度检测的试剂盒。该试剂盒的开发，可以快速检测玉米种子的纯度，为玉米品种的市场监管提供科学技术支撑，对提高农作物种子质量，保障粮食安全生产具有重要意义。

Description

一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒
技术领域
本发明属于分子标记试剂盒，具体涉及一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒。
背景技术
InDel插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失，根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物。InDel作为高通量分子标记，兼具各类遗传标记的优点。传统分子标记开发一般仅基于一份序列，而InDel标记开发完全基于序列差异，所以开发过程中无多型位点较少，突变几率极低，所以InDel标记准确性更高、变异稳定，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。
玉米品种陕单609是西北农林科技大学于2011年通过陕西省夏玉米审定的品种，陕审玉2011005号、2012年通过陕西省春玉米审定的品种，陕审玉2012018号、2016年通过国审玉米品种，国审玉2016001号，是以91227为母本，以昌7-2为父本组配而成的。幼苗叶鞘紫色、叶片深绿色。株型半紧凑，株高286厘米，花丝紫红色，花药浅紫色，穗轴白色，籽粒黄色。玉米品种陕单609种子的质量直接影响其产量水平，而其纯度是评价种子质量的重要指标之一。在传统农业生产的实践中，玉米种子纯度鉴定以籽粒形态鉴定、幼苗鉴定和田间小区种植鉴定为主，辅以生化同工酶和蛋白质电泳技术，但随着玉米种质资源同质化问题的严峻化，上述两种方法已经无法满足玉米种子纯度的检测需求。
针对现有技术的缺陷，本发明首次开发一种玉米品种陕单609纯度检测InDel分子标记试剂盒，利用InDel分子标记技术鉴定玉米品种纯度的优越性在于：
1)InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多，作为高通量分子标记，兼具各类分子标记的优点；
2)InDel分子标记准确性高、通用性强；
3)InDel分子标记共呈显性遗传，检测简单方便，对仪器设备和技术要求较低；
4)利用InDel分子标记鉴定品种，扩增产物带型清晰、稳定，易于分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，用以检测玉米品种陕单609的纯度，本试剂盒具有快速、准确、简便等优点，准确的检测出种子纯度，保证农业生产用种的质量和安全性。
本发明的技术方案概述如下：
一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，以玉米品种陕单609及父母本双亲的全基因组DNA为模板，通过对覆盖全基因组300对InDel引物进行筛选，获得两对双亲互补、特异性强、重复性高、结果稳定的InDel引物：序列1和序列2及序列3和序列4：
序列1：5’-AACATGCACGCTACTTGTGCG-3’；
序列2：5’-GTTGTACGCATCTGTTTGTGCT-3’；
序列3：5’-ACCGCAACTTCGTTTCAGTTT-3’；
序列4：5’-GAGAATTGGCAGCTACGATGG-3’。
所述的一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，以玉米品种陕单609的基因组DNA为模板，2.以序列1和2或序列3和4为特异性引物进行PCR扩增。
所述的一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，PCR反应体系总体积15μL，包括10.2μL超纯水、1.5μL10倍PCR缓冲液、1.2μLdNTPs(2.5mmol/L)、1.0μLInDel引物(0.25μmol/L)、0.15μL Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)、1μL DNA，混匀。
所述的一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，其特征在于，反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸10min；4℃保存。
所述的一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，种子纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子数目占检测样品种子数目的百分率表示。
本试剂盒中还可包括抽提样品DNA所需的各种试剂。这些试剂是本领域技术人员周知的。
附图说明
图1为本发明的序列1和2扩增玉米品种陕单609及父母本结果图；
图2为本发明的序列3和4扩增玉米品种陕单609及父母本结果图。
本发明的有益效果：
(1)本发明在对覆盖全基因组300对InDel引物进行筛选，获得两对双亲互补、特异性强、重复性高、结果稳定的InDel引物，由其两对特异性引物和Taq酶等试剂开发出针对玉米品种陕单609纯度检测的试剂盒，可以快速、准确、简便的检测出玉米品种陕单609的纯度，保证粮食生产的安全性，为品种市场管理提供技术支撑，对保证粮食生产的产量和质量具有重要的意义。
(2)相比于其他分子标记开发，InDel作为高通量分子标记，准确性更高、通用性强、变异稳定，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊，同时，InDel分子标记共呈显性遗传，检测简单方便，对仪器设备和技术要求较低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明的检测过程为：
(1)玉米品种陕单609基因组DNA提取随机数取150粒种子，采取CTAB法进行基因组DNA提取；
(2)PCR扩增以序列1和2或序列3和4为InDel特异性引物，配制15μLPCR反应体系；
(3)PCR反应体系总体积15μL，包括10.2μL超纯水、1.5μL10倍PCR缓冲液、1.2μLdNTPs(2.5mmol/L)、1.0μLInDel引物(0.25μmol/L)、0.15μL Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)、1μL DNA，混匀；
(4)反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸10min；4℃保存；
(5)电泳检测扩增产物，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(6)纯度结果通过带型统计，种子纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子数目占检测样品种子数目的百分率表示：
实施例1
本实施例中用玉米品种陕单609纯度检测InDel分子标记试剂盒，检测玉米品种陕单609样品A的纯度，操作流程如下：
(1)随机数取玉米品种陕单609样品A150粒种子，采取CTAB法进行DNA提取；
(2)PCR扩增以序列1和2为InDel特异性引物，配制15μL PCR反应体系；
(3)PCR反应体系总体积15μL。包括10.2μL超纯水、1.5μL10倍PCR缓冲液、1.2μLdNTPs(2.5mmol/L)、1.0μLInDel引物(0.25μmol/L)、0.15μL Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)、1μL DNA，混匀；
(4)反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸10min；4℃保存；
(5)电泳检测扩增产物，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(6)纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子数目占检测样品种子数目的百分率表示；
具有本品种特异带型的种子粒数为147，按公式：
玉米品种陕单609样品A纯度为＝147/150×100％＝98％。
实施例2
本实施例中用玉米品种陕单609纯度检测InDel分子标记试剂盒，检测玉米品种陕单609样品B的纯度，操作流程如下：
(1)随机数取玉米品种陕单609样品B200粒种子，采取CTAB法进行DNA提取；
(2)PCR扩增以序列3和4为InDel特异性引物，配制15μL PCR反应体系；
(3)PCR反应体系总体积15μL，包括10.2μL超纯水、1.5μL10倍PCR缓冲液、1.2μLdNTPs(2.5mmol/L)、1.0μL InDel引物(0.25μmol/L)、0.15μL Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)、1μL DNA，混匀；
(4)反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸10min；4℃保存；
(5)电泳检测扩增产物，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(6)纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子数目占检测样品种子数目的百分率表示；
具有本品种特异带型的种子数目为188，按公式：
玉米品种陕单609样品B纯度为＝188/200×100％＝94％.
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (5)

1.一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有2对双亲互补、特异性强、重复性高、结果稳定的InDel引物：序列1和序列2及序列3和序列4：
序列1：5’-AACATGCACGCTACTTGTGCG-3’；
序列2：5’-GTTGTACGCATCTGTTTGTGCT-3’；
序列3：5’-ACCGCAACTTCGTTTCAGTTT-3’；
序列4：5’-GAGAATTGGCAGCTACGATGG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，其特征在于：所述试剂盒以玉米品种陕单609全基因组DNA为模板，以序列1和2或序列3和4为特异性引物进行PCR扩增。
3.根据权利要求1所述的一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，其特征在于：所述PCR反应体系总体积15μL，包括10.2μL超纯水、1.5μL10倍PCR缓冲液、1.2μLdNTPs(2.5mmol/L)、1.0μL InDel引物(0.25μmol/L)、0.15μL Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)、1μL DNA，混匀。
4.根据权利要求1所述的一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，其特征在于：反应程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸40s，循环35次；72℃延伸10min；4℃保存。
5.根据权利要求1所述的一种玉米品种陕单609纯度检测的InDel分子标记试剂盒，其特征在于：种子纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子数目占检测样品种子数目的百分率表示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110964845A (zh) * 2020-01-03 2020-04-07 江苏省农业科学院 一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的方法及InDel分子标记
CN114480717A (zh) * 2022-03-04 2022-05-13 广东省科学院南繁种业研究所 玉米籽粒颜色相关的InDel标记及其应用

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