CN110964845B - 一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的方法及InDel分子标记 - Google Patents
一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的方法及InDel分子标记 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子标记及分子育种技术领域，尤其是一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的方法及InDel分子标记，包括以下步骤：1)提取所有父本、母本及待检混合授粉杂交种叶片DNA；2)利用父本及母本的DNA筛选能够建立指纹图谱的分子标记；3)利用筛选的分子标记对步骤1)的DNA模板进行PCR扩增，记录父本、母本及待检混合授粉杂交种的基因型；4)根据获得的父本、母本的基因型推导所有可能的杂交种基因型；5)步骤3)获得的待检混合授粉杂交种基因型与步骤4)推导的所有杂交种基因型进行比对，记录相同基因型的位点数量；若某一待检混合授粉杂交种与某一推导杂交种具有最大的相同基因型位点数，则该推导杂交种的亲本为该待检混合授粉杂交种的亲本来源。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记及分子育种技术领域，具体为一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的方法。
背景技术
玉米是我国种植面积最大的粮饲作物，对保证粮食安全及提高人民生活质量具有重要作用。随着我国耕地总量的降低，玉米播种面积也随之减少。因此，玉米单产的提高是确保玉米总产的关键。除优化栽培措施外，玉米品种的升级也是玉米单产提升的有效途径。我国每年投入大量的经费用于玉米新品种培育。
目前，玉米新品种的培育依赖于自交系的大量组配及多年多点的组合鉴定。一般来说，一个育种单位每年需要组配几千到上万个组合。该过程由于采用单株杂交的方式因此需要在父本散粉期内做数千乃至数万次杂交，消耗大量的人力。由于自交系及杂交组合数量大，过程管理困难，常会造成一些目标组合没有成功组配，影响整个育种进程。如果一株母本雌穗接受多个父本花粉产生混合授粉杂交种则可极大地降低组配数量，进而降低组配风险及组配成本。但由于同一母本雌穗上存在多个父本的杂交籽粒，因此需要对不同籽粒的杂交组合进行亲本追溯以确定杂交种的来源。
研究表明，玉米基因组存在着广泛的遗传变异。其中，每309bp出现一个小的插入缺失变异(Insertion/Deletion，InDel)。这些高密度的遗传变异为分子标记的开发提供了丰富的资源。含有InDel的核苷酸序列长度差异通常较大，通过普通PCR及琼脂糖凝胶电泳很容易检测到这些片段差异。由于InDel分子标记具有数量丰富、检测方便以及不受环境影响的优点，因此，该标记是追溯玉米混合授粉杂交种来源的最佳技术选择。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的方法及InDel分子标记，能够对多个自交系产生的混合授粉杂交种来源进行快速鉴定。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的方法，包括以下步骤：
(1)提取所有父本、母本及待检混合授粉杂交种的叶片DNA；
(2)利用父本及母本的DNA筛选能够建立指纹图谱的分子标记；其中，同一分子标记应至少在两个亲本间存在基因型差异；
(3)利用筛选的分子标记对步骤(1)的DNA模板进行PCR扩增，记录父本、母本及待检混合授粉杂交种的基因型；
(4)根据步骤(3)获得的父本、母本的基因型推导所有可能的杂交种基因型；
(5)利用步骤(3)获得的待检混合授粉杂交种基因型与步骤(4)推导的所有杂交种基因型进行比对，记录相同基因型的位点数量；
若某一待检混合授粉杂交种与某一推导杂交种具有最大的相同基因型位点数，则该推导杂交种的亲本为该待检混合授粉杂交种的亲本来源；
根据待检混合授粉杂交种母本，即可由确定的推导杂交种亲本得到待检混合授粉杂交种父本。
其中，所述的玉米混合授粉杂交种是指同一母本雌穗接受多个父本花粉而得到的一批同母异父的杂交种以及由不同母本接受多个父本花粉后所得的一批异母异父的杂交种。
或者，步骤(1)-(4)中的推导杂交种基因型的步骤，可替换为：提前准备推导的杂交种基因型。
一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的InDel分子标记，包括37个位点所对应的74个引物序列，其序列表如SEQ ID：NO.1-74所示。
其中，所述InDel分子标记为共显性标记，具有二态性、高多态性信息含量(PIC)及位点专化性。
本发明所述的InDel分子标记在玉米基因分型中的应用，具体包括但不限于：DNA指纹图谱构建、杂种优势群划分、分子标记辅助选择、基因组芯片、群体结构鉴定、进化树分析或全基因组选择中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的InDel分子标记具有共显性、二态性及位点专化性的特点，检测结果稳定、准确且不受环境影响，检测成本低，检测方便、快捷，特别适合高通量样本检测。
(2)本发明提供的用于可追溯玉米混合授粉杂交种来源方法可快速获得杂交种来源信息，为杂交种大量混粉组配解决了鉴定难题。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的InDel分子标记的开发与验证：
从maizeGDB(https://www.maizegdb.org/)网站上下载B73参考基因组序列(V4)，并从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站下载205个玉米自交系基因组重测序数据(PRJNA82843，SRP011907及PRJNA260788)。基因组重测序数据通过SoleaQ软件包进行Q20(Phred-Score≥20即1％的错误率)质量控制及测序长度过滤(L20，长度≥20bp)。清理后的测序数据通过SOAPdenovo2软件进行从头(de novo)组装。
利用mInDel软件鉴定组装序列与B73参考基因组间的InDel变异并设计引物序列。按照InDel基因组位置唯一、InDel差异大、引物设计打分高的条件挑选引物，通过PCR及琼脂糖凝胶电泳筛选B73与Mo17间共显性的分子标记。经过分析，共获得37个条带清晰的高质量二态性InDel分子标记。该37个位点所对应的74个引物序列，其序列表如SEQ ID：NO.1-74所示。
B73与Mo17的幼苗叶片DNA是利用上海浦迪DNA试剂盒提取的。PCR反应总体系为25μl，含有2mmol/L MgCl2，100μmol/L dNTP，0.2μmol/L引物，1U Taq酶及50ng DNA。PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，58℃35s，72℃45s，38个循环；72℃3min。PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶上以100V电压电泳90min，EB染色后在紫外透射仪上观察结果。
实施例2
一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的方法，包括以下步骤：
(1)待测杂交种的组配：
在试验田里种植25个亲本自交系，母本行在抽雄前去掉雄穗。授粉方式为田间自然开放授粉。授粉后的雌穗挂牌收获，脱粒后单粒种植，同时种植亲本。来自同一雌穗的种子种植在一起，以便后期通过表型比较鉴定杂交种父本。
(2)亲本及待测杂交种基因型的获得：
利用实施例1验证的37个高质量InDel分子标记通过琼脂糖凝胶电泳对25份亲本自交系及随机挑选的49株待测杂交种进行基因分型。每个分子标记的短条带记录为A，长条带记录为B，双条带记录为H。结果显示，这些分子标记至少在两个亲本间的基因型上存在差异。
其中，DNA提取、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳过程与实施例1相同。
(3)所有可能杂交种基因型的推导：
理论上，只考虑正交的情况下25份自交系可组配300个杂交种。这些杂交种37个分子标记的基因型按照如下标准推定：当同一分子标记的双亲基因型同为A时，该分子标记的杂交种基因型为A；当同一分子标记的双亲基因型同为B时，该分子标记的杂交种基因型为B；当同一分子标记的双亲基因型互为A或B时，该分子标记的杂交种基因型为H。
(4)待测杂交种亲本来源的鉴定：
49个待测杂交种基因型与300个推导杂交种基因型进行两两比较，记录相同基因型的分子标记数量。当某一推导杂交种具有最多相同基因型分子标记数量时，则该推导杂交种与相应待测杂交种为同一杂交种。由于待测杂交种的母本已知，则推导杂交种的另一亲本应为待测杂交种的父本。
结果发现，49个待测杂交种均匹配到唯一的推导杂交种。经过待测杂交种去重分析，共得到35个非重复待测杂交种(每个母本对应1～5个父本)，匹配位点数为27～37(如表1)。
唯一匹配的结果经过育种专家对杂交种与亲本的特征表型比对鉴定得到确认。
表1 35个非重复待测杂交种表型鉴定及与推导杂交种的位点匹配结果(只列出相同位点数最大的前两个)
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种可追溯玉米混合授粉杂交种来源的方法及其InDel分子标记
<160> 74
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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ggatacttgt tgaagttagc catc 24
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cattgagcct gtacctgtac tgg 23
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catgccggaa catagtacct c 21
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tcacagtcgc ataaatccac ag 22
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tgaagatcca tgcaagacca acg 23
Claims (3)
1.一种追溯玉米混合授粉杂交种来源的InDel分子标记组合作为被检测靶标在玉米基因分型中的应用，其特征在于：所述InDel分子标记组合为37个InDel分子标记位点，扩增所述37个InDel分子标记位点的引物序列如SEQ ID：NO.1-74所示。
2.扩增分型权利要求1所述的InDel分子标记组合的引物在玉米基因分型中的应用，所述引物的序列如SEQ ID：NO.1-74所示。
3.扩增分型权利要求1所述的InDel分子标记组合的引物在玉米DNA指纹图谱构建中的应用，所述引物的序列如SEQ ID：NO.1-74所示。
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