CN108416189A - 一种基于分子标记技术的农作物品种杂种优势模式鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于分子标记技术的农作物品种杂种优势模式鉴定方法，包括以下步骤：(1)建立农作物对照自交系指纹信息库；(2)构建虚拟杂交组合指纹库并确定杂种优势模式权重库和阈值；(3)建立待测杂交种指纹库；(4)分析待测杂交种的杂种优势模式：计算杂交种在每个杂种优势模式的得分值，通过与已建立的权重库和阈值的比对判断待测杂交种的杂种优势模式，分值最高的杂种优势模式即为该杂交种的杂种优势模式。本发明的鉴定方法可以快速有效的鉴定玉米杂交种的杂种优势模式，进而可以应用于鉴定亲本、品种识别、品种纯度及品种保护等各个方面，节约时间和人力财力，便于种企、育种家及种子管理部门进行监督和管理，应用前景广阔。

Description

一种基于分子标记技术的农作物品种杂种优势模式鉴定方法
技术领域
本发明涉及农作物杂交种鉴定与育种技术领域，特别是涉及农作物品种生物信息学分析技术领域，具体地涉及一种基于分子标记技术的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法。
背景技术
20世纪植物遗传学对发展农业生产最突出的贡献就是开发利用杂种优势。孟德尔遗传规律被重新发现之后，提出了自交系间杂交种的概念，育种家选育了大量的自交系，配制出大量杂交组合，使玉米杂交种的商业利用有了突飞猛进地发展。杂种优势育种是当今玉米育种的主流，推广种植强优势杂交种在玉米增产中起着关键性的作用。在国内外农作物育种中，选择合理的杂交优势利用模式可以提高育成品种的成功率。近20年来，育种家逐步认识到，在未能完全认识杂种优势遗传机理的情况下，合理划分亲本材料的杂种优势类群、建立有效的杂优模式是进一步提高育种效果的有效措施。
所谓杂种优势群(Heterosis Group)是指遗传基础广阔，遗传变异丰富，具有较多的有利基因，多来自同一品种或群体，且具有该群体的种性的一组自交系的集合，是在自然选择和人工选择作用下经过反复重组种质互渗而形成的活基因库。从中可不断分离筛选出高配合力的优良自交系。而杂种优势模式(Heterosis Pattern)指两个对应的杂种优势群之间具有较高的基因互作效应，具有较高的特殊配合力(Special Combining Ability,SCA)，相互配对而成为产生强杂种优势的模式。从配对的两个优势群分别选出的优系之间，出现强优势杂交种的几率也相应较高。杂种优势群不是泛指一般的人工合成群体或开放授粉品种群体，也不是任何杂种优势群之间均能组配成杂种优势模式。
在杂种优势模式鉴定中，过去常用的方法有：1.完全系谱法。完全系谱法根据杂交种的系谱即血缘关系推断该杂交种的杂种优势模式。通过查询品种审定公告或者其他渠道的信息，得知杂交种的系谱信息(父母本)；对于父母本，再通过已有的信息得知父母本的杂种优势类群，进而得知该杂交种的杂种优势模式(王懿波等，中国玉米主要种质杂交优势利用模式研究，中国农业科学，1997，30(4)：16-24)。2.分子标记技术结合系谱法。随着分子生物技术的发展，在农作物杂种优势模式方面的应用也进一步增多。例如，RAPD分析技术。首先通过系谱信息得知杂交种的父母本，然后对父母本的自交系进行RAPD分子标记，再通过聚类分析方法进行杂种优势类群的划分(彭泽斌等，玉米自交系杂种优势类群与杂优模式构建的初步研究，作物学报，1998，24(6)：711-717)；SSR分析技术。首先通过系谱信息得知杂交种的父母本，然后对父母本的自交系进行SSR分子标记，再通过聚类分析方法进行杂种优势类群的划分(王庆东，用SSR标记对玉米优良自交系血缘类群及杂优模式的研究，河南农业大学，硕士学位论文，2004)。利用分子技术进行杂种优势模式鉴定具有更直接、准确和快速等优势，尤其是在农艺性状上无法区分时更为有效，鉴定结果更为可靠，因而具有广阔的应用前景。
SSR、SNP及InDel标记是目前遗传育种中应用比较广泛的分子标记方法，科技工作者可根据不同的基础条件、需求和不同的数据特征进行对应的针对性的选择。SSR指纹技术扩增产物的检测方法主要包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光毛细管电泳等。根据文献资料发现，琼脂糖凝胶电泳的分辨率较低，其次是非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，两种方法均对较小的差异不易区分，因此在构建DNA指纹库中不推荐使用；变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术已经成熟，并且操作简单，成本低廉，是一种常见的检测方法；毛细管电泳结合多色荧光检测方法是近年来发展起来的一种快速、准确、高效率的SSR标记检测方法，它利用如ABI3730XL等遗传分析仪，以FAM、VIC、NED、PET、LIZ五种不同的荧光，其中LIZ作为分子量内标的颜色，其余4种荧光标记微卫星引物，将4种不同荧光标记的PCR产物和分子量内标在同一泳道中电泳，通过毛细管电泳、SSR Analyser软件进行数据的收集和分析，精确计算出各SSR等位基因扩增片段的大小。由于荧光毛细管电泳检测平台具有自动化程度高、高通量、省时省力等优势，因而被认为是主流检测平台。
SNP基因分型检测平台较多，如SNPlex、SNaPshot、TaqMan、光纤微珠芯片平台等，综合比较，各个检测平台中Illumina公司推出的SNP芯片检测技术在农作物品种真实性鉴定方面有一定位点通量优势。SNP标记的一般流程是待提取的基因组DNA与激活的生物素充分结合后，通过离心沉淀使DNA纯化；将探针与纯化的目的DNA链杂交，漂洗杂交产物除去非特异结合试剂或过量试剂后进行延伸连接反应；延伸后产物经漂洗变性后作为模板进行PCR扩增，PCR产物与磁珠结合后过滤纯化；将纯化的PCR产物与芯片杂交，杂交结束后进行芯片清洗、真空抽干；风干后的芯片立刻在iScan仪上进行扫描。
InDel标记是基于基因组中插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，目前大多是利用电泳平台进行分型，该分型平台快捷经济，不需要复杂的实验设备，可操作性强。电泳分型平台有琼脂糖凝胶电泳、变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳。当InDel位于某种限制性内切酶的酶切位点上时，可转化为扩增片段酶切长度多态性(CAPS)，先用该限制性内切酶酶切后再电泳分型。InDel长度变化较大，选择InDel位点时，应优先选择多态性差异3—20bp的InDel，这类InDel设计的成功率高，而且便于检测。
在农作物品种杂种优势模式鉴定中，传统的系谱分析法利用了已知的信息进行杂种优势模式鉴定：首先根据杂交种的血缘关系和对应自交系的类群信息进行杂种优势模式鉴定，但是如果不知道杂交种的系谱信息和对应自交系的类群信息则无法对杂交种杂种优势模式进行判断；除此之外，对于多元复合种质衍生群的品种杂种优势模式鉴定也会表现出明显的局限性。分子标记技术结合系谱法可以利用现代分子技术准确的进行杂种优势模式的鉴定，但在由杂交种寻找对应的自交系时，也必须利用已知的系谱信息。一般情况下品种审定公告中提供了品种的来源，但这个信息有可能是出于商业秘密保护目的而被加密，极大程度降低了获得准确系谱信息的可能性。
综上所述，传统的方法需要已知杂交种的系谱信息和系谱对应的自交系类群的信息，这样就给鉴定过程增加了束缚条件，上述条件如若未知则无法进行试验鉴定。因此，现有的方法受到诸多因素的制约因而存在着一定的局限性。在农作物育种中，新品种的培育离不开杂种优势模式的选择；同时，鉴定农作物品种的杂种优势模式可以对品种研究、监管和保护等方面起到重要作用，因此现有技术迫切需要一种不需要将杂交种的系谱信息或者系谱对应的自交系类群的信息设为已知条件，就能够根据相近杂交组合的杂种优势模式确定待测杂交种的杂种优势模式的新的简单、方便、准确率高的鉴定方法以辅助种子企业、育种家及种子管理部门进行监督和管理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、准确率高、可信度高的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法。
本发明提供的一种基于分子标记技术的农作物品种杂种优势模式鉴定方法，包括以下步骤：
(1)建立农作物对照自交系指纹信息库；
(2)构建虚拟杂交组合指纹库并确定杂种优势模式权重库和阈值；
(3)获取待测杂交种的分子信息包括该杂交种在不同位点上的基因型信息，建立待测杂交种指纹库；
(4)分析待测杂交种的杂种优势模式：计算杂交种在每个杂种优势模式的得分值，通过与已建立的权重库和阈值的比对判断待测杂交种的杂种优势模式，分值最高的杂种优势模式即为该杂交种的杂种优势模式。
上述农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法的步骤(1)建立农作物对照自交系指纹信息库包括以下步骤：
S1、选择不少于100个样品组成对照自交系，所述样品为公认的、种质资源广泛的样品或与待测杂交种有亲缘关系的自交系样品；
S2、根据不同的基础条件、需求和不同的数据特征选择不同的分子标记检测平台；当选择SSR分子标记检测平台时，可用的位点数不少于30个；当选择SNP分子标记检测平台时，选择位点数不少于300个；当选择InDel分子标记检测平台时，可用的位点数不少于300个；
S3、对对照自交系样品的指纹数据质量进行控制，包括位点数据质量的控制和样品指纹质量的控制；
所述位点数据质量从四个方面进行控制，分别是等位基因频率、多态性信息量、位点的样品缺失率、位点的样品纯合率；
所述样品指纹质量从两个方面进行控制，分别是样品的位点缺失率和样品的位点纯合率；
S4、基于对照自交系的指纹信息对该自交系进行类群划分。
其中，在步骤(1)的S3位点数据质量控制中，
等位基因频率的控制方面，
最小等位基因频率(Minor Allele Frequency，MiAF)是指一个突变位点的最小突变频率，在实际应用中数值越大则越有研究价值，通常认为一个位点的最小等位基因频率大于0.05才有研究的意义，否则说明这个位点的突变频率很低，很可能无法做出突变基因。以SNP标记数据为例，其计算公式为：
if SAA＜SBB then MiAF＝pA
if SAA＞SBB then MiAF＝pB
其中，SAA为该位点的基因型是AA的样品数目，SAB为该位点的基因型是AB的样品数目，SBB为该位点的基因型是BB的样品数目。
最大等位基因频率(Major Allele Frequency，MaAF)是指一个突变位点的最大突变频率。
if S44＜SBB then MaAF＝pB
if SAA＞SBB then MaAF＝pA
其中，SAA为该位点的基因型是AA的样品数目，SAB为该位点的基因型是AB的样品数目，SBB为该位点的基因型是BB的样品数目。
本发明经过大量试验研究后认为若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系样品指纹数据最大等位基因频率小于0.90；若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系样品指纹数据最小等位基因频率大于0.15。
多态性信息量的控制方面，
多态性一般用多态性信息量(Polymorphism Information Content，PIC)来评估。PIC是指一个标记依靠其可检测的等位基因数和它们的分布频率，从而得到该标记在一个群体中检测的多态性大小值，其计算公式为：
其中，pi代表分析位点的第i个等位基因的频率，pj代表分析位点的第j个等位基因的频率，m代表分析位点的等位基因数量。
本发明经过大量试验研究后认为若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系样品指纹数据的多态性信息量的值大于0.30；若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系样品指纹数据多态性信息量的值大于0.20；
位点的样品缺失率控制方面，
位点的样品缺失率(Locus of Samples Miss Rate，LSMR)是指当前位点在给定样品群体中数据缺失的比例，其计算公式为：
其中，Sn是该位点数据缺失的样品数目，St是给定群体的样品总数。
本发明经过大量试验研究后认为若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系样品的指纹数据的位点的样品缺失率小于0.20；若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系样品指纹数据的位点的样品缺失率小于0.10；
位点的样品纯合率控制方面，
位点的样品纯合率(Locus of Samples Homozygote Rate,LSHR)是指当前位点在给定样品群体中纯合样品数占所有不缺失数据样品的比例，其计算公式为：
Sh+Si＝St-Sn
其中，Sh是该位点基因型为杂合类型的样品数目，Si是该位点基因型为纯合类型的样品数目，St是给定群体的样品总数，Sn是该位点数据缺失的样品数目。
纯合样品比例高可以保证位点集合符合孟德尔遗传定律。本发明经过大量试验研究后认为若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系样品的指纹数据的位点的样品纯合率的值大于0.75；若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系样品的指纹数据位点的样品纯合率的值大于0.90。
进一步地，本发明提供的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法的步骤(1)的S3样品指纹质量控制中，样品的位点缺失率(Sample of Loci Miss Rate，SLMR)是指当前样品在给定的位点集合中数据缺失的比例，其计算公式为：
其中，Ln代表数据缺失的位点数目，Lt代表给定集合的位点总数。
本发明为保证结果的准确性，结合已有的知识及操作经验，若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系指纹质量的样品的位点缺失率小于0.20；在若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系指纹质量的样品的位点缺失率小于0.10。
进一步地，本发明提供的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法的步骤(1)的S3样品指纹质量控制中，样品的位点纯合率(Sample of Loci Homozygote Rate，SLHR)是指当前样品的纯合位点占数据不缺失位点总数目的比例，其计算公式为：
Lh+Li＝Lt-Ln
其中，Lh代表杂合的位点数目，Li代表纯合的位点数目，Ln代表数据缺失的位点数目，Lt代表给定集合的位点总数。
本发明为保证结果的准确性，结合已有的知识及操作经验，若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系指纹质量的样品的位点纯合率大于0.70；在若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系指纹质量的样品的位点纯合率大于0.90。
本发明提供的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法步骤(1)的S4中对该对照自交系进行类群划分的方法为计算自交系样品两两之间的遗传距离，基于分类单元间的进化距离，采用非加权分组平均法或邻近归并法对聚类结果进行类群划分，构建系统发生树。
具体的，计算自交系样品两两之间的遗传距离(Genetic Distance，GD)。遗传距离是一种用来估算两个个体或群体之间基因差异的度量，常用的遗传距离的计算公式有：
(1)Nei’s(1973)遗传距离
Nei’s1973遗传距离(Nei’s1973 Minimum Genetic Distance，Nei1973_GD)，也叫Nei’s 1973最小遗传距离，其计算公式为：
其中，pij代表在X群体(或个体)内第j个位点的第i个等位基因的频率，qij代表在Y群体(或个体)内第j个位点的第i个等位基因的频率，aj代表第j个位点的等位基因数量，m代表进行比较的位点数量；JX代表在X群体两个随机选出的基因相同概率的平均数，JY代表在Y群体两个随机选出的基因相同概率的平均数，JXY代表从X、Y两个群体随机选出的两个基因相同概率的平均数。
(2)Rogers’s(1972)遗传距离
Rogers’s遗传距离(Rogers’s 1972 Minimum Genetic Distance，Roger1972_GD)计算公式为：
其中，pij代表在X群体(或个体)内第j个位点的第i个等位基因的频率，qij代表在Y群体(或个体)内第j个位点的第i个等位基因的频率，aj代表第j个位点的等位基因数量，m代表进行比较的位点数量。
计算遗传距离：基于SSR分子平台计算遗传距离时选用Roger’s 1972遗传距离计算方法；基于SNP或InDel分子平台计算遗传距离时优先选用Nei’s1973遗传距离计算公式；
进一步地，基于上述遗传距离的计算数据，进行系统发生分析。
系统发生(或种系发生、系统发育，Phylogeny)是指生物形成或进化的历史，系统发生学(Phylogenetics)研究物种之间的进化关系，其基本思想是比较物种的特征，并认为特征相似的物种在遗传学上接近。系统发生研究的结果往往以系统发生树(PhylogeneticTree)来表示，用它描述物种之间的进化关系。在分子水平上进行系统发生分析具有许多优势，所得到的结果更加科学、可靠。
分子系统发生分析主要分成三个步骤：(1)分子序列或特征数据的分析；(2)系统发生树的构造；(3)结果的检验。其中，第一步的作用是通过分析，产生距离或特征数据，为建立系统发生数提供依据。
系统发生树的构建方法很多种。根据所处理数据的类型，可以将系统发生树的构建方法大体上分为两大类。一类是基于距离的构建方法，利用所有物种或分类单元间的进化距离，依据一定的原则及算法构建系统发生树。基本思路是列出所有可能的序列对，计算序列之间的遗传距离，选出相似程度比较大或非常相关的序列对，利用遗传距离预测进化关系。这类方法有非加权组平均法(Unweighted Pair Group Method with Arithmeticmeans)、邻近归并法(Neighbor Joining Method)、Fitch-Margoliash法、最小进化方法(Minimum Evolution)等。另一类方法是基于离散特征的构建方法，利用的是具有离散特征状态的数据，如DNA序列中的特定位点的核苷酸。建树时着重分析分类单位或序列间每个特征(如核苷酸位点)的进化关系等。属于这一类的方法有最大简约法(Maximum ParsimonyMethod)、最大似然法(Maximum Likelihood Method)、进化简约法(EvolutionaryParsimony Method)、相容性方法(Compatibility)等。对相似性和距离数据，在重建系统发生树时只能利用距离法。离散特征数据通过适当的方法可转换成距离数据，因此，对于这类数据在重建系统发生树时既可以用距离法，亦可以采用离散特征法。
本发明中，推荐使用的方法为非加权分组平均法和邻近归并法：
(1)非加权分组平均法
具体划分方法为非加权分组平均法(Unweighted Pair Group Method withArithmetic means，UPGMA)，UPGMA算法的执行过程如下：
一、初始化：使每个物种自成一类，如果有n个物种，则开始时共有n个类，每个类的大小为1，分别用n个叶节点代表每个类；
二、重复执行下列循环，直到仅剩一个类为止：
①寻找具有最小距离Dij的两个类i、j；
②建立一个新的聚类(ij)；
③连接i和j形成新节点(ij)，生长两个新的分支，将i和j连接到(ij)，分支的长度为Dij/2；
④计算新分类到其它类的距离
其中ni、nj、(ni+nj)分别为i类、j类、(ij)类的元素个数；
⑤在距离矩阵中删除与类i和类j相应的行和列，为类(ij)加入新的行和列。
根据聚类结果进行类群的划分。
(2)邻近归并法
邻近归并法(Neighbor Joining，NJ)的具体算法如下：
(1)初始化(同UPGMA)
(2)循环
①对于所有的分类单元x，计算dx＝∑x≠y(Dxy/(n-2))；
②选择一对分类单元x和y，使Dxy-dx-dy最小；
③将x和y归并为新的类(xy)，在树中添加一个新的节点，代表新生成的分类，计算从x和y到新节点的分支长度；
dx，(xy)＝1/2Dx，y+1/2(dx-dy)，
dy，(xy)＝1/2Dx，y+1/2(dy-dx)
④计算新类与其它类的距离；
D(xy)，z＝1/2(Dx，z+Dy，z-Dx，y)
⑤删除聚类x和y，添加新类(xy)；
⑥如果有两个以上的分类存在，则继续执行循环；否则用长度为Dx，y的分支连接剩余的两个类。
上述步骤是本发明农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法中，关于步骤(1)的建立农作物对照自交系指纹信息库的具体操作方法与要点。
进一步，在本发明提供的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法的步骤(2)中，所述构建虚拟杂交组合指纹库并确定杂种优势模式权重库和阈值的方法为：
A1、将对照自交系划分为不同的杂种优势群后，根据杂种优势群确定可能的杂种优势模式，不同杂种优势群样品之间正交、反交的差别忽略不计；在实际操作过程中，还可根据已有的经验去掉使用可能性较低的杂种优势模式。
杂种优势群是根据育种需要人为划分的群体，是指遗传基础广阔、遗传变异丰富、具有较多的有利基因、较高的一般配合力、种性优良的育种群体。杂种优势模式指两个对应的杂种优势群之间具有较高的基因互作效应，具有较高的特殊配合力，相互配对而成为产生强杂种优势的模式。
A2、对分组后两两杂种类群之间的自交系进行虚拟杂交，得到各个杂种优势模式中对应给类群的所有F1的集合，根据步骤(1)获得的对照自交系的分子信息，通过指纹信息技术推断出各个杂种优势模式中所有虚拟杂交F1在全部位点上的基因型信息，从而得到不同杂种优势模式的F1指纹信息；
A3、统计不同杂种优势模式下所有的F1在各个位点上的基因型频率，构建每个杂种优势模式的分子指纹权重库；
各个杂种优势模式中，虚拟杂交得到的F1在各个位点上的基因型信息不尽相同。因此，本步骤统计不同杂种优势模式下所有的F1在各个位点上的基因型频率。某一杂种优势模式下某一位点上某一基因型的基因型频率计算公式为：
其中：p为某个杂种优势模式下某一位点上i基因型的基因型频率；ni为某一杂种优势模式下某一位点上出现该基因型的F1的个数；N为某一杂种优势模式下某一位点上所有F1的个数。以此类推，可以求出所有的杂种优势模式下在各个位点上的基因型频率值。
A4、根据统计分布设定每个杂种优势模式的置信阈值。
具体地，在步骤(2)的A4步骤中，每个杂种优势模式下的置信阈值的设定方法为：将不同的杂种优势模式下自交系之间两两杂交得到该杂种优势模式的所有F1作为训练样品，计算F1在对应的杂种优势模式下所有位点上的基因型频率值，然后将所有位点上的频率值累加求和，得出F1在对应杂种优势模式中的得分；以此类推，将该杂种优势模式中的所有F1逐一进行计算得出分值，计算该杂种优势模式所有分值的平均值和标准差s，将将作为该杂种优势模式阈值的下限，阈值的上限不设限制。
本发明提供的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法中，步骤(3)建立待测杂交种指纹库的数据获取方法与步骤(1)农作物对照自交系指纹信息库的方法一致，选择相同的位点和相同的分子检测平台进行检测，构建待测杂交种指纹库；对待测的杂交种控制样品的位点缺失率，若采用SSR分子标记检测平台，则待测杂交种样品的指纹质量的位点缺失率小于0.20；在若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则待测杂交种样品的指纹质量的样品的位点缺失率小于0.10；本步骤对样品的位点纯合率不做限制。
本发明提供的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法中，步骤(4)计算杂交种在每个杂种优势模式的得分值，通过与已建立的权重库和阈值的比对判断待测杂交种的杂种优势模式，分值最高的杂种优势模式即为该杂交种的杂种优势模式。具体方法为：通过对杂交种分子检测得出该杂交种在不同位点上的基因型。由权重库可知各个位点在不同的杂种优势模式下不同基因型的频率，由此可知该杂交种在不同的杂种优势模式下所有位点的基因型频率值，将杂种优势模式下的所有位点上的频率值累加，即可获得该杂交种在该杂种优势模式下的一个累加值，该累加值即为该杂交种在对应杂种优势模式下的得分。根据某一杂种优势模式下某一位点上某一基因型的基因型频率(p)计算公式，累加值的计算公式如下：
其中，P为某个杂种优势模式下杂交种的得分；m为位点的个数；pi为该杂种优势模式下i位点上与待测杂交种基因型相同的基因型频率。
进一步，通过待测杂交种在某个杂种优势模式下的得分值，遍历所有杂种优势模式，计算出所有的杂种优势模式的分值并排序，分值最高的杂种优势模式即为该杂交种的杂种优势模式。
在此基础上，步骤(4)还包括对分析结果的可信度进行评价，对得分最高的杂种优势模式进行阈值判断，筛选出得分最高的杂种优势模式所对应的阈值，并将最高分与杂种优势模式的阈值进行比较，如果最高分值在阈值范围内，则说明该分析结果可靠，并且十分可信；如果最高分值不在阈值范围内，则说明该杂种优势模式的鉴定相对来说比较可靠，结果可供参考。
本发明提供了所述农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法在农作物亲本鉴定中的应用。
本发明提供了所述农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法在农作物品种识别中的应用。
本发明提供了所述农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法在农作物品种纯度鉴定中的应用。
本发明还提供了所述农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法在农作物品种保护中的应用。
本发明的有益效果在于，本发明提出的基于分子标记技术的农作物品种杂种优势模式鉴定的技术方案不需要将杂交种的系谱信息或者系谱对应的自交系类群的信息设为已知条件，通过选择自交系进行虚拟杂交构建对照数据库，根据统计杂交种与对照数据库的基因型频率进行最相近杂交种选择，并根据阈值判断选择的合理性，最终根据相近杂交种的杂种优势模式确定待测杂交种的杂种优势模式，本发明方法可以快速有效的鉴定农作物杂交种的杂种优势模式，具有作物普适性，适用于玉米、小米、水稻等农作物的亲本鉴定、品种识别、品种纯度及品种保护等各个方面的要求，节约大量的时间和人力财力，可以有效地辅助种子企业、育种家及种子管理部门进行监督和管理，将本发明鉴定方法推广应用将取得良好的社会效益和经济价值。
附图说明
图1为本发明基于分子标记技术的农作物品种杂种优势模式鉴定方法的流程图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品，所用的生物材料均为本领域技术人员通过常规方式能够获得的。
实施例1
本实施例通过基于SSR分子标记的玉米杂种优势模式鉴定来说明其具体实施方式。
选取的实验对象中，对照样品为135个国内玉米自交系40个SSR的分子标记数据(FengGe Wang et al,Development and characterization of a core set of SSRmarkers for fingerprinting analysis of Chinese maize varieties,Maydica,2011,56-1693.以下简称论文1)，待测样品为10个国内有很大推广面积的玉米杂交种与论文1相同位点的40个SSR的分子标记数据(王凤格等，中国328个玉米品种(组合)SSR标记遗传多样性分析，中国农业科学，2014,47(5):856-864.以下简称论文2)，对本发明所提出的基于分子标记技术的农作物杂种优势模式鉴定方法进行验证，具体实施过程如下：
1.建立对照指纹库并分类
135个国内玉米品种自交系40个SSR的分子标记数据作为对照样品构建对照样品的指纹信息库。具体试验操作步骤参见论文1。分析对照样品的指纹数据质量，样品指纹质量参见表1，位点数据质量参见表2。
表1 对照自交系的样品指纹质量
通过上述表中对照自交系的样品指纹质量数据进行统计，发现样品的位点缺失率大多数小于10％，纯合率大多数大于90％，基本符合本发明的要求。
表2 对照样品的位点数据质量
从表2看出，所有位点的最大等位基因频率(MaAF)均小于0.900；所有位点的多态性信息量(PIC)均大于0.300；全部位点的样品缺失率均小于0.200；全部位点的样品纯合率全部大于0.750。综合来说，位点指纹数据符合试验设计要求。
2.构建虚拟杂交组合指纹库并确定杂种优势模式权重库和阈值
权重库数值结果较多，本案例表3只列举位点P01的所有基因型在15个杂种优势模式的权重分数，每种杂种优势模式的列名采用表4杂种优势模式编号，计算结果如下：
表3 杂种优势模式权重库
计算杂种优势模式下所有分值的平均值和标准差s，本发明将将作为该杂种优势模式阈值的下限，阈值的上限本发明不设限制，具体结果见表4。
表4 15个杂种优势模式阈值
3.建立待测杂交种指纹库
待测玉米自交系指纹信息的获取方法参照步骤1，可采用不同的分子平台进行最终指纹信息的获取，注意的是本步骤选择的方法应与步骤1选择的方法一致，即选择相同的位点和相同的分子检测平台进行试验。待测杂交种样品的指纹质量的位点缺失率小于0.20，本步骤对样品的位点纯合率不做限制，具体情况参见表6的位点缺失率。
4.分析待测杂交种的杂种优势模式
通过对杂交种分子检测得出该杂交种在不同位点上的基因型。由权重库可知各个位点在不同的杂种优势模式下不同基因型的频率，由此可知该杂交种在不同的杂种优势模式下所有位点的基因型频率值，将杂种优势模式下的所有位点上的频率值累加，即可获得该杂交种在该杂种优势模式下的一个累加值，该累加值即为该杂交种在对应杂种优势模式下的得分。
具体计算结果见表5。
表5 待测样品对应各个杂种优势模式的分值
通过对表5待测样品最高分的杂种优势模式的筛选，从而确定其杂种优势模式，具体结果见表6，并通过表4的阈值对结果进行检验。结果表明，待测样品最高分值在阈值范围内；通过查询品种审定报告等已有的资料，说明本发明方法获得的鉴定结果准确可靠。
表6 待测样品最高分对应的杂种优势模式及阈值判断结果

Claims (10)

1.一种基于分子标记技术的农作物品种杂种优势模式鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)建立农作物对照自交系指纹信息库；
(2)构建虚拟杂交组合指纹库并确定杂种优势模式权重库和阈值；
(3)获取待测杂交种的分子信息包括该杂交种在不同位点上的基因型信息，建立待测杂交种指纹库；
(4)分析待测杂交种的杂种优势模式：计算杂交种在每个杂种优势模式的得分值，通过与已建立的权重库和阈值的比对判断待测杂交种的杂种优势模式，分值最高的杂种优势模式即为该杂交种的杂种优势模式。
2.根据权利要求1所述的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法，其特征在于，步骤(1)建立农作物对照自交系指纹信息库包括以下步骤：
S1、选择不少于100个样品组成对照自交系，所述样品为公认的、种质资源广泛的样品或与待测杂交种有亲缘关系的自交系样品；
S2、根据不同的基础条件、需求和不同的数据特征选择不同的分子标记检测平台；当选择SSR分子标记检测平台时，可用的位点数不少于30个；当选择SNP分子标记检测平台时，选择位点数不少于300个；当选择InDel分子标记检测平台时，可用的位点数不少于300个；
S3、对对照自交系样品的指纹数据质量进行控制，包括位点数据质量的控制和样品指纹质量的控制；
所述位点数据质量从四个方面进行控制，分别是等位基因频率、多态性信息量、位点的样品缺失率、位点的样品纯合率；
所述样品指纹质量从两个方面进行控制，分别是样品的位点缺失率和样品的位点纯合率；
S4、基于对照自交系的指纹信息对该自交系进行类群划分。
3.根据权利要求2所述的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法，其特征在于，步骤(1)的S3位点数据质量控制中，
等位基因频率的控制方面，若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系样品指纹数据最大等位基因频率小于0.90；若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系样品指纹数据最小等位基因频率大于0.15；
多态性信息量的控制方面，若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系样品指纹数据的多态性信息量的值大于0.30；若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系样品指纹数据多态性信息量的值大于0.20；
位点的样品缺失率控制方面，所述位点的样品缺失率的计算公式为：
其中，Sn是该位点数据缺失的样品数目，St是给定群体的样品总数；若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系样品的指纹数据的位点的样品缺失率小于0.20；若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系样品指纹数据的位点的样品缺失率小于0.10；
位点的样品纯合率控制方面，所述位点的样品纯合率的计算公式为：
其中，Sh是该位点基因型为杂合类型的样品数目，Si是该位点基因型为纯合类型的样品数目，St是给定群体的样品总数，Sn是该位点数据缺失的样品数目；若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系样品的指纹数据的位点的样品纯合率的值大于0.70；若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系样品的指纹数据位点的样品纯合率的值大于0.90。
4.根据权利要求2所述的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法，其特征在于，步骤(1)的S3样品指纹质量控制中，在样品的位点缺失率控制方面，所述样品的位点缺失率的计算公式为：
其中，Ln代表数据缺失的位点数目，Lt代表给定集合的位点总数；若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系样品的指纹质量的位点缺失率小于0.20；在若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系样品的指纹质量的样品的位点缺失率小于0.10；
在样品的位点纯合率控制方面，所述样品的位点纯合率的计算公式为：
其中，Lh代表杂合的位点数目，Li代表纯合的位点数目，Ln代表数据缺失的位点数目，Lt代表给定集合的位点总数；若采用SSR分子标记检测平台，则对照自交系样品的指纹质量的样品的位点纯合率大于0.70；在若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则对照自交系样品的指纹质量的样品的位点纯合率大于0.90。
5.根据权利要求2所述的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法，其特征在于，步骤(1)的S4中对该对照自交系进行类群划分的方法为计算自交系样品两两之间的遗传距离，基于分类单元间的进化距离，采用非加权分组平均法或邻近归并法对聚类结果进行类群划分，构建系统发生树。
6.根据权利要求1-5任一所述的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法，其特征在于，步骤(2)构建虚拟杂交组合指纹库并确定杂种优势模式权重库和阈值的方法为：
A1、将对照自交系划分为不同的杂种优势群后，根据杂种优势群确定可能的杂种优势模式，不同杂种优势群样品之间正交、反交的差别忽略不计；
A2、对分组后两两杂种类群之间的自交系进行虚拟杂交，得到各个杂种优势模式中对应给类群的所有F1的集合，根据步骤(1)获得的对照自交系的分子信息，通过指纹信息技术推断出各个杂种优势模式中所有虚拟杂交F1在全部位点上的基因型信息，从而得到不同杂种优势模式的F1指纹信息；
A3、统计不同杂种优势模式下所有的F1在各个位点上的基因型频率，构建每个杂种优势模式的分子指纹权重库；
A4、根据统计分布设定每个杂种优势模式的置信阈值。
7.根据权利要求6所述的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法，其特征在于，步骤(2)的A4步骤中，每个杂种优势模式下的置信阈值的设定方法为：将不同的杂种优势模式下自交系之间两两杂交得到该杂种优势模式的所有F1作为训练样品，计算F1在对应的杂种优势模式下所有位点上的基因型频率值，某一杂种优势模式下某一位点上某一基因型的基因型频率计算公式为：
其中：p为某个杂种优势模式下某一位点上i基因型的基因型频率；ni为某一杂种优势模式下某一位点上出现该基因型的F1的个数；N为某一杂种优势模式下某一位点上所有F1的个数；
然后将所有位点上的频率值累加求和，得出F1在对应杂种优势模式中的得分；以此类推，将该杂种优势模式中的所有F1逐一进行计算得出分值，计算该杂种优势模式所有分值的平均值和标准差s，将将作为该杂种优势模式阈值的下限，阈值的上限不设限制。
8.根据权利要求1-5任一所述的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法，其特征在于，步骤(3)建立待测杂交种指纹库的数据获取方法与步骤(1)农作物对照自交系指纹信息库的方法一致，选择相同的位点和相同的分子检测平台进行检测，构建待测杂交种指纹库；对待测的杂交种控制样品的位点缺失率进行控制，若采用SSR分子标记检测平台，则待测杂交种样品的指纹质量的位点缺失率小于0.20；在若采用SNP或InDel分子标记检测平台，则待测杂交种样品的指纹质量的样品的位点缺失率小于0.10；本步骤对样品的位点纯合率不做限制。
9.根据权利要求1-5任一所述的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法，其特征在于，步骤(4)还包括对分析结果的可信度进行评价，对得分最高的杂种优势模式进行阈值判断，筛选出得分最高的杂种优势模式所对应的阈值，并将最高分与杂种优势模式的阈值进行比较，如果最高分值在阈值范围内，则说明该分析结果可靠，并且十分可信；如果最高分值不在阈值范围内，则说明该杂种优势模式的鉴定相对来说比较可靠，结果可供参考。
10.权利要求1-9任一所述的农作物杂交种杂种优势模式鉴定方法在鉴定农作物亲本、农作物品种识别、鉴定农作物品种纯度或农作物品种保护中的应用。
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