CN111540408B - 一种全基因组多态性ssr分子标记的筛选方法 - Google Patents

一种全基因组多态性ssr分子标记的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，包括：1)基于物种基因组挖掘潜在SSR标记；2)基于待选样本二代测序数据计算每个潜在SSR标记指标；3)随机挑取若干个潜在SSR标记并分别针对每个SSR标记设计引物；分别以每一对引物对待测样本DNA模板进行PCR扩增，获得SSR标记片段及其多态性信息；4)以步骤2)获得的SSR标记指标为特征，以步骤3)获得的多态性信息为分类结果，使用支持向量机人工智能算法构建SSR多态性特征判别模型。本发明显著降低了多态性SSR标记的开发周期和成本，同时还可用于功能基因定位、遗传多样性调查和群体遗传结构分析；该方法稳定可靠，理论上可以在任何生物的多态性SSR标记筛选上发挥作用，使用面广泛。

Description

一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因组学分子标记开发的技术领域，更具体地，涉及一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法。
背景技术
遗传标记是指物种内或者物种间不同个体存在遗传多态性的标志。从遗传标记的发展历史来看，主要有形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记等四种类型，其中分子标记是生物个体间或种群间基因组序列上的差异。随着近些年分子生物学和基因组学技术的发展，分子标记在遗传学的使用地越来越多，对于生物遗传学研究和应用的作用越来越大。目前通过基因组序列获得分子标记主要有RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism)，RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)，AFLP(Amplified FragmentLength Polymorphism),SSR(Simple Sequence Repeat)和SNP(single-nucleotidepolymorphism)等。由于RFLP，RAPD和AFLP技术操作繁琐和复杂，难以明确具体的序列信息和位置信息等缺点，这些类型的标记已用得越来越少；SSR是生物体基因组中短片段模块(一般1到6个碱基构成)的重复造成的，主要由核心片段和二端的侧翼序列构成。实验中可以利用SSR二端侧翼的保守型进行基因组扩增，研究个体与群体的多态性；SNP标记是全基因组单个碱基的变化导致的群体个体的多态性的标记，存在密度高分布均匀的优点。虽然SNP有着很多优点，但是SNP多态性检测成本仍然偏高。由于SSR具有检测方便，基因组内部分布广泛，多态性高等特点，在SSR在遗传学研究中发挥着越来越重要的作用。目前，SSR标记仍然是应用最多的分子标记，并且已经成功并广泛的应用于重要经济物种的群体和遗传结构研究、遗传图谱构建、重要性状QTL定位和全基因组关联分析中。
传统的SSR筛选方法包含以下步骤：1)使用的是通过全基因组序列挖掘得到潜在的SSR侧翼序列；2)使用侧翼序列设计引物；3)使用测序引物进行序列扩增和电泳实验；4)通过电泳条带判断SSR标记是否具有多态性。这种方法最大的问题是利用侧翼序列设计引物扩增的条带大部分都没有多态性，大大降低了多态性SSR标记筛选的效率，不仅使得标记验证的实验周期过长，而且实验的成本也非常高。
以Illumina为代表的第二代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)的出现和发展大大提高了测序的通量，降低了全基因组测序的成本。理论上，我们可以对任何物全基因组的序列进行测序，并获得其全基因组的潜在多态性SSR信息。由于NGS测序的数据能够对基因组某个片段进行多次覆盖，进而我们可以利用该数据评估SSR具备多态性的可能性。近些年已经发表了一些可以鉴定SSR多态性的方法，但是这些方法只能输出每个SSR标记的特征，然后由分析人员基于测序深度、序列长度、可能的插入序列等特点判断SSR的多态性。由于每一种判断方法往往具有片面性，目前SSR的筛选效率仍然不是特别高。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提出了一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，该方法在进行大规模实验之前先利用高通量测序数据评估SSR标记的多态性，排除没有明显多态性的标记信息，从而提高多态性SSR标记筛选效率，大大降低多态性SSR标记筛选的周期和成本。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，包括如下步骤：
(1)基于物种基因组挖掘潜在SSR标记；
(2)基于待选样本二代测序数据计算每个潜在SSR标记指标；
(3)随机挑取若干个潜在SSR标记并分别针对每个SSR标记设计引物；分别以每一对引物对待测样本DNA模板进行PCR扩增，获得SSR标记片段及其多态性信息；
(4)以步骤(2)获得的SSR标记指标为特征，以步骤(3)中获得的多态性信息为分类结果，使用支持向量机人工智能算法构建SSR多态性特征判别模型。
进一步地，步骤(2)计算每个潜在SSR标记指标的方法为：使用BWA比对软件将二代测序数据比对到核酸序列上，然后利用Lobster软件分析比对结果获取每个潜在SSR标记指标。
更进一步地，所述步骤(2)中潜在SSR标记指标包括测序深度、重复次数、重复单元序列、比对分数。
进一步地，步骤(3)中引物设置参数为：Tm为55～65℃，引物序列长度为18～28nt，产物预期长度为100～450bp，GC量为40％～65％。
更进一步地，步骤(3)中引物设置参数为：Tm为60℃，引物序列长度为23nt，产物预期长度为100～450bp，GC量为50％。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增体系为：1×PCR buffer、1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，0.25mmol/L的上下游引物，1.0U DNA polymerase及4.5ng DNA模板，加双蒸水至20μL。
进一步地，步骤(3)中PCR扩增程序为：94℃5min；94℃45s，55-60℃40s，72℃1min，35个循环；72℃10min。
传统的SSR标记开发方法是使用序列分析获得潜在的SSR标记后，进行大规模群体验证SSR的多态性，耗时耗力，成本高。本发明针对SSR标记筛选效率低、成本高的问题，提供一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明结合全基因组测序数据和人工智能算法，利用机器学习的策略对SSR多态性的各个指标进行综合判断，在进行大规模实验之前先利用高通量测序数据评估SSR标记的多态性，排除没有明显多态性的标记信息，从而提高多态性SSR标记筛选效率，大大降低传统基因组多态性SSR标记筛选的周期和成本。
(2)本发明的方法只需要研究物种的核酸序列(基因组或者转录组序列)和相应的二代测序数据即可利用该方法进行多态性SSR标记挖掘，该方法稳定可靠，理论上可以在任何生物的多态性SSR标记筛选上发挥作用，使用面广泛。
(3)本发明提出的全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法不仅可以用于相关种质资源的品种溯源，也可以用于功能基因定位、遗传多样性调查和群体遗传结构分析。
附图说明
图1为本发明全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法流程示意图；
图2为实施例1中利用支持向量机构建的黑斑原SSR多态性特征预测的效果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
图1为本发明全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法流程示意图，如图1所示，本发明提供的一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，包括对样本DNA提取及以下步骤：
S1：利用MISA软件在物种基因组中挖掘潜在SSR标记。利用后缀树算法，在核酸序列(基因组或者转录组序列)上挖掘潜在SSR标记。对挖掘的SSR的标记的长度和种类进行统计分析，作为后续SSR标记验证，筛选和应用的对象。进一步的，要求重复序列单元长度小于6bp，重复次数大约10次。
S2：基于待选样本二代测序数据计算每个潜在SSR标记指标。在S1的基础上，使用BWA比对软件将二代测序数据比对到核酸序列上。具体地，利用Lobster软件分析比对结果并对每个潜在SSR位点的测序深度、重复次数、重复单元序列、比对分数等特征，并收集每个潜在SSR标记的上述指标作为下一步骤的输入。
S3：随机挑取若干个潜在SSR标记并分别针对每个SSR标记设计引物；分别以每一对引物对待测样本DNA模板进行PCR扩增，对扩增产物使用Qsep100全自动核酸分析系统(Bioptic.ins)进行毛细管电泳检测，记录多态性信息。具体地，引物设置参数为：Tm为55～65℃，引物序列长度为18～28nt，产物预期长度为100～450bp，GC量为40％～65％；进一步优选的引物设置参数为：Tm为60℃，引物序列长度为23nt，产物预期长度为100～450bp，GC量为50％。PCR扩增体系为：1×PCR buffer、1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，0.25mmol/L的上下游引物，1.0U DNA polymerase及4.5ng DNA模板，加双蒸水至20μL。PCR扩增程序为：94℃5min；94℃45s，55-60℃40s，72℃1min，35个循环；72℃10min。
S4：以S2获得的SSR标记指标为特征，以S3中获得的多态性信息为分类结果，使用支持向量机(SVM)人工智能算法构建SSR多态性特征的分类器模型，从而辅助提升多态性SSR标记的开发效率。
为了进一步的验证本方法的实用性，本发明以西藏鱼类黑斑原鮡作为研究对象进行多态性SSR标记的筛选和SSR标记的验证。
实施例1：黑斑原鮡多态性SSR标记的筛选
1、基于黑斑原鮡基因组挖掘潜在SSR位点
利用MISA工具(http//pgrc.ikp-gatersleben.de/misa)对黑斑原鮡全基因组序列中挖掘SSR位点。MISA软件的具体参数配置文件具体内容为：1-10 2-6 3-54-5 5-5 6-5。即1个碱基重复10次及10次以上，2个碱基重复6次及6次以上，3个碱基重复5次及5次以上，4个碱基重复5次及5次以上，5个碱基重复5次及5次以上，6碱基重复5次及5次以上，这样的碱基重复序列才算是微卫星序列。对挖掘的SSR位点的长度和种类进行统计分析，作为后续SSR标记验证，筛选和应用的对象。
2、实验材料预处理
本实验采用一种西藏高原特有鱼类黑斑原鮡作为研究对象。在雅鲁藏布江流域不同海拔区域获得西藏高原特色鱼类黑斑原鮡样本，取肌肉组织用于后续提取基因组DNA样本。记录样本信息后，组织样品迅速放入液氮中速冻1小时，然后置于-80℃冰箱保存。
3、黑斑原鮡基因组DNA提取和测序
将冷冻的黑斑原鮡肌肉组织在液氮中用研钵研磨成粉末，使用苯酚法提取基因组DNA序列信息。具体方法如下：缓缓地将研磨的粉末加入到1ml消化缓冲液中，使其在缓冲液的表面均匀浸湿，然后摇动使样品浸没，并在37℃下消化5hr，每半小时振摇一下。待溶液冷却至室温，分装成两管，每管吸取0.5ml平衡苯酚轻轻混合，直到形成乳状3000-5000×g离心10min，用大孔吸管移出水相。用0.5ml(相同体积)苯酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)再提取两次，将水相转移到洁净的管中，加入NaCl至浓度0.3M(3M NaCl加50μL)。轻轻沿管壁注入2.5倍体积的乙醇。轻轻摇动管子，直至溶液完全混合。可以很清楚的看见DNA快速沉淀下来。3000×g离心10min后，用适量70％乙醇漂洗两次，离心，弃上清液，晾干。样本在0.5ml TE中再悬浮，加入NaCl至终浓度100mM(3M NaCl加16.7μL)，加入(DNAse free)RNAseA至浓度100μg/ml(10mg/ml RNAse A加5ul)。在37℃下保持3hr后，加入SDS至最终浓度0.2％(10％SDS加10μL)，并用相同体积苯酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)提取两次，将水相转移到洁净的管中，加入NaCl至浓度0.3M(3M NaCl加50μL)。轻轻沿管壁注入2.5倍体积的乙醇。轻轻摇动管子，直至溶液完全混合，可以很清楚的看见DNA快速沉淀下来。将DNA放在0.5ml浓度为10mM TE中再悬浮。最后样本在260nm下测定OD值用以确定浓度。提取的DNA样本置于-20℃下保存备用。按照Illumina的建库和测序流程构建高通量测序文库，并利用Illumina Xten平台进行测序。
4、基于待测西藏鱼类样本二代测序数据计算每个潜在SSR位点特征指标
使用BWA比对软件和默认参数将黑斑原鮡二代测序数据比对到核酸序列上，利用Lobster软件和默认参数分析比对结果并对每个潜在SSR位点的测序深度、重复次数、重复单元序列、比对分数等特征。
5、SSR标记扩增与验证
在全基因组随机挑选100个SSR序列，并使用软件Primer3对SSR重复单元前后的侧翼序列设计引物。主要的引物设置参数如下：扩增产物长度100～450bp，引物序列长度18～28nt(最适宜长度为23nt)，退火温度为55～65℃(最佳退火温度为60℃)，GC量为40％～65％(最适宜为50％)。设计出来的引物利用Oligo软件进行引物评估，避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发生，并合成相应的SSR核心序列扩增引物。
使用Eppendorf公司生产的Mastercycler普通梯度PCR仪进行引物最佳复性温度的筛选，并进行SSR的序列的PCR扩增。PCR反应体系为20μL，其中包括：1×Buffer，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，0.25mmol/L的上下游引物，1.0U的DNA polymerase，以及4.5ng的DNA模板。反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性45s，复性(55—60℃)40s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。PCR反应产物利用Qsep100全自动核酸分析系统(Bioptic.ins)进行毛细管电泳，分离不同长度的SSR片段，分析各个SSR标记在个体间的等位基因多态性，并将100个SSR标记的多态性记为二种状态：有多态性记为1，无多态性记为0。
6、构建SSR多态性特征判别模型
将步骤4的每个潜在SSR标记的测序深度、重复次数、重复单元序列、比对分数等特征作为支持向量机(SVM)的特征，步骤5的SSR标记的多态性状态作为结果，训练获得最优的对SSR标记多态性进行判别的模型。利用该模型对全基因组的SSR标记进行判别，对SSR标记的多态性进行打分(百分比概率)。SVM工具调用的是R统计学软件中的svm命令。
实施例2：基于SVM模型鉴定的SSR标记的验证
本实施例分别取两组SSR标记，第一组为20个经过SVM模型鉴定具有明显多态性的黑斑原鮡SSR标记，第二组为20个从黑斑原鮡全基因组随机挑选的20个SSR标记。使用软件Primer3对上述40个SSR标记重复单元前后的侧翼序列设计引物，按照实施例1中步骤5进行多态性验证。
分析上述两组SSR标记多态性的效果。分析结果发现，第一组20个标记中17个具有明显的多态性，但是第二组中20个标记只有5个具有明显的多态性，表明基于SVM模型的SSR多态性鉴定具有明显的优势。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)基于物种基因组挖掘潜在SSR标记；
(2)基于待选样本二代测序数据计算每个潜在SSR标记指标；
(3)随机挑取若干个潜在SSR标记并分别针对每个SSR标记设计引物；分别以每一对引物对待测样本DNA模板进行PCR扩增，获得SSR标记片段及其多态性信息；
(4)以步骤(2)获得的SSR标记指标为特征，以步骤(3)中获得的多态性信息为分类结果，使用支持向量机人工智能算法构建SSR多态性特征判别模型。
2.根据权利要求1所述的一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤(2)计算每个潜在SSR标记指标的方法为：使用BWA比对软件将二代测序数据比对到核酸序列上，然后利用Lobster软件分析比对结果获取每个潜在SSR标记指标。
3.根据权利要求1所述的一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)中潜在SSR标记指标包括测序深度、重复次数、重复单元序列、比对分数。
4.根据权利要求1所述的一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中引物设置参数为：Tm为55～65℃，引物序列长度为18～28nt，产物预期长度为100～450bp，GC量为40％～65％。
5.根据权利要求4所述的一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中引物设置参数为：Tm为60℃，引物序列长度为23nt，产物预期长度为100～450bp，GC量为50％。
6.根据权利要求1所述的一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增体系为：1×PCR buffer、1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP，0.25mmol/L的上下游引物，1.0U DNA polymerase及4.5ng DNA模板，加双蒸水至20μL。
7.根据权利要求1所述的一种全基因组多态性SSR分子标记的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增程序为：94℃5min；94℃45s，55-60℃40s，72℃1min，35个循环；72℃10min。
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