CN106367496B - 一套猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记及其检测引物组和应用 - Google Patents
一套猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记及其检测引物组和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一套猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记及其检测引物组和应用。本发明是利用猕猴桃基因组数据库存在的不同猕猴桃物种的测序序列，通过序列比对参考基因组的方式寻找高多样性的单核苷酸变异区域并形成单核苷酸分子标记初选集，在此基础上利用新型质谱仪基因分型平台对单核苷酸变异位点进行实验验证和基因型获取，通过与物种的关联分析筛选物种关联特异的单核苷酸标记，最终得到一套用于猕猴桃杂交资源亲本物种来源鉴定的分子标记，形成本发明的技术方案。猕猴桃杂交资源亲本的鉴定可促进对杂交资源性状和生物特性形成的理解，加速杂交资源的遗传评价和开发利用，有着重要的理论学术意义和较高的经济应用价值。
Description
技术领域
本发明属于植物遗传资源评价和生物技术领域，具体涉及一套猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记及其检测引物组和应用，即用于猕猴桃自然杂交资源亲本来源的分析鉴定，以提高猕猴桃杂交种质的筛选评价和遗传育种利用效率，减少土地和人力成本，促进新品种的快速培育。
背景技术
猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.)是原产我国的世界重要新兴水果，因富含维生素C等多种营养成分而受到消费者的广泛喜爱。猕猴桃属野生物种资源丰富，包括54个种约75个分类单元。由于猕猴桃雌雄异株、多年生等生物学特性，在自然界中种间杂交异常频繁，存在大量的野生杂交种质资源。人工杂交育种一直是大田农作物进行种质资源创新和品种改良的重要手段，但多年生作物如猕猴桃等的人工杂交育种效率低下、费时费力且通常难以得到预期的结果。相反，猕猴桃野生杂交种质资源丰富，对这些自然种质进行有效的遗传鉴定和评价利用一直是猕猴桃杂交育种的重要方向。目前在猕猴桃野生杂交资源的发掘利用过程中，由于缺乏可用的物种关联特异分子标记，对杂交种质的基因组遗传组成和杂交亲本来源的鉴定存在较大困难，从而影响杂交资源发掘利用的效率。
单核苷酸变异标记即单碱基突变标记，是生物基因组上存在的最广泛也最原始可靠的标记方式。近年来，结合相关遗传学和基因组学研究成果，基于单核苷酸变异发展起来的基因分型技术和研究平台日新月异，其中Sequenom公司的MassARRAY质谱仪平台是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱来区分不同的单核苷酸变异，由于具有通量高且精确性好而在医学和人类学研究领域得到广泛应用，但在植物资源评价中利用仍然较少。利用这一新型研究平台，开展猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的开发，促进精准高效的猕猴桃野生杂交资源的发掘应用，是当前我国猕猴桃遗传育种的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于针对目前猕猴桃自然杂交种质亲本资源鉴定利用效率低下的问题，提供一套猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记，其能用于野生杂交资源发掘及育种应用。
本发明的猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记，适用于阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃、长叶猕猴桃等常见猕猴桃自然杂交亲本的特异性鉴别，特别适用于质谱仪分型平台的应用，其包括：
A、阔叶猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AL-1，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AL-1标记获取引物F：5’-ATGGAAGGTAGATGTTGCCG-3’(SEQ ID No.1)，
AL-1标记获取引物R：5’-GTCAGATGAGACTGAAGAAG-3’(SEQ ID No.2)，
AL-1标记延伸引物：5’-ggTGAAGAAGATTTATTCTCAATGTA-3’(SEQ ID No.3)；
在此位点扩增得到的阔叶猕猴桃物种特异基因型为碱基C/T型组合，其他猕猴桃物种基因型均为C/C型；
B、葛枣猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AP-2，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AP-2标记获取引物F：5’-TGTGGCGATTGCCATAATGC-3’(SEQ ID No.4)，
AP-2标记获取引物R：5’-GGAAGCGATTTGCATCTCTC-3’(SEQ ID No.5)，
AP-2标记延伸引物：5’-aGTTGAGACACCTTCGATATA-3’(SEQ ID No.6)；
在此位点扩增得到的葛枣猕猴桃物种特异基因型为碱基C/C型组合，其他猕猴桃物种基因型均为T/T型；
C、软枣猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AA-3，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AA-3标记获取引物F：5’-CTGCTCTCCCGATTTCTATC-3’(SEQ ID No.7)，
AA-3标记获取引物R：5’-CATCAAATTAGTGGAAGTCCC-3’(SEQ ID No.8)，
AA-3标记延伸引物：5’-catccAATTAGTGGAAGTCCCTACAAC-3’(SEQ ID No.9)；
在此位点扩增得到的软枣猕猴桃物种特异基因型为碱基A/G型组合，其他猕猴桃物种基因型均为G/G型；
D、刺毛猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AS-4，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AS-4标记获取引物F：5’-GCACTTAGTTGCAAGCAATC-3’(SEQ ID No.10)，
AS-4标记获取引物R：5’-GTTCTCGTATGTTAGCTTTGG-3’(SEQ ID No.11)，
AS-4标记延伸引物：5’-ccccAGCTTTGGCTTTTTAGTAA-3’(SEQ ID No.12)；
在此位点扩增得到的刺毛猕猴桃物种特异基因型为碱基A/A型组合，其他猕猴桃物种基因型均为G/G型；
E、中华猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AC-5，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AC-5标记获取引物F：5’-GAGTGTTCTGGCCTAGAAAG-3’(SEQ ID No.13)，
AC-5标记获取引物R：5’-TACGGGTCAAAACCAAACCT-3’(SEQ ID No.14)，
AC-5标记延伸引物：5’-gcaacACCAAACCTTTATTGCACCAA-3’(SEQ ID No.15)；
在此位点扩增得到的中华猕猴桃物种特异基因型为碱基C/T型组合，其他猕猴桃物种基因型均为C/C型；
F、长叶猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AH-6，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AH-6标记获取引物F：5’-GTGCAAAAGGCTTACGGTTG-3’(SEQ ID No.16)，
AH-6标记获取引物R：5’-TCAAGTCCTGAGGTTGGTTC-3’(SEQ ID No.17)，
AH-6标记延伸引物：5’-ggCCATAAATATTATGGACGGATT-3’(SEQ ID No.18)；
在此位点扩增得到的长叶猕猴桃物种特异基因型为碱基C/C型组合，其他猕猴桃物种基因型均为G/G型。
本发明的第二个目的是提供上述猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的检测引物组在鉴别阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃和长叶猕猴桃中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种鉴别阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃和长叶猕猴桃的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测猕猴桃的基因组DNA，分别利用上述猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记中各分子标记的检测引物组中的获取引物R和F扩增，扩增产物再用相对应的延伸引物延伸获得延伸产物，对延伸产物进行基因分型，确定待测猕猴桃的特异基因型，然后根据基因型鉴别待测猕猴桃的种类。
所述的基因分型可以是将延伸引物用MassARRAY质谱仪平台进行基因分型或者对延伸产物进行测序获得测序结果，基于测序结果确定待测猕猴桃的特异基因。
本发明的第四个目的是提供一种用于鉴别阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃和长叶猕猴桃的试剂盒，其特征在于，包括上述猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的检测引物组。
单核苷酸是植物基因组最广泛多样的变异单元，一部分位点存在高度的物种间特异性。由于单核苷酸变异位点侧翼序列通常具有一定的物种间保守性，因而可以利用其来设计引物进行聚合酶链式反应扩增和基因分型分型。通过单核苷酸变异等位基因组成的基因型组合的差异，以此来作为物种鉴定的特异性分子标记。
本发明是利用猕猴桃基因组数据库存在的不同猕猴桃物种的测序序列，通过序列比对参考基因组的方式寻找高多样性的单核苷酸变异区域并形成单核苷酸分子标记初选集，在此基础上利用新型质谱仪基因分型平台对单核苷酸变异位点进行实验验证和基因型获取，通过与物种的关联分析筛选物种关联特异的单核苷酸标记，最终得到一套用于猕猴桃杂交资源亲本物种来源鉴定的分子标记，形成本发明的技术方案。猕猴桃杂交资源亲本的鉴定可促进对杂交资源性状和生物特性形成的理解，加速杂交资源的遗传评价和开发利用，有着重要的理论学术意义和较高的经济应用价值。
利用该猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记，对二十份随机选择的猕猴桃物种资源进行评价鉴定，得到的基因分型结果与物种材料表型特征类型完全一致，利用猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记可以清晰的区分阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃和长叶猕猴桃。
相比于现有技术，本发明有益效果如下：
①本发明利用整基因组最原始的单核苷酸变异信息使得鉴定结果非常准确，目前已有鉴定结果的准确率达到了100％；
②使用该套猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的检测引物组，在不熟悉物种形态特征的情况下可在短时间内完成快速分子鉴定，有利于自然杂交种质的亲本来源确定，大大提高资源发掘利用效率；
③本猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的检测引物组的使用可结合新型基因分型质谱仪，使得单核苷酸变异的检测具有高通量特征，可一次检测至少96份不同的样本。
附图说明：
图1是猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的获得流程图；
图2是猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的应用流程图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
若未特别说明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段，同时所有单核苷酸变异的实验检测和基因分型均使用Sequenom公司的MassARRAY质谱仪分型技术平台。
实施例1：
一、一套猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的获得
公共序列数据库资源：美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,简称NCBI)，猕猴桃参考基因组数据库(KiwifruitInformation Resource,简称KIR)，国家猕猴桃种质资源圃(武汉)内部数据库资源，具体步骤如图1所示，包括：
①在数据库获取猕猴桃物种测序序列
利用猕猴桃属所有物种拉丁名作为关键词，在公共序列数据库和内部数据库中搜索并获取十多个猕猴桃物种的序列数据资源。
②同源序列比对获取物种关联特异单核苷酸初步变异信息
对所获得的数据序列运用Cross Match软件去除载体等无用序列，运用Gmap软件将过滤后的序列比对到猕猴桃参考基因组获取单核苷酸变异信息，对变异信息进行物种特有关联分型，获取初步的物种关联特异单核苷酸变异集。
③利用变异位点侧翼序列设计获取引物
针对所获得的单核苷酸变异信息，运用Primer5.0软件对变异位点的侧翼序列设计符合MassARRAY质谱仪分型的两条单核苷酸变异获取引物和一条变异位点特异延伸引物。
④对变异位点进行物种样本的质谱仪实验验证
利用每个变异位点的引物序列，在基因分型质谱仪平台进行初步物种关联特异单核苷酸变异位点的实验验证。
⑤筛选物种关联特异单核苷酸分子标记
基于实验验证结果，通过基因型比对分析和获取变异的物种表型相关性得到实际可用的一套共六个猕猴桃物种的物种关联特异单核苷酸变异分子标记。包括六个猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记，具体为：阔叶猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AL-1、葛枣猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AP-2、软枣猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AA-3、刺毛猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AS-4、中华猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AC-5、长叶猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AH-6。六个分子标记可以用于阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃、长叶猕猴桃等常见猕猴桃自然杂交亲本的特异性鉴别，特别适用于质谱仪分型平台的应用。
六个猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的检测引物组如下：
A、阔叶猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AL-1，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AL-1标记获取引物F：5’-ATGGAAGGTAGATGTTGCCG-3’(SEQ ID No.1)，
AL-1标记获取引物R：5’-GTCAGATGAGACTGAAGAAG-3’(SEQ ID No.2)，
AL-1标记延伸引物：5’-ggTGAAGAAGATTTATTCTCAATGTA-3’(SEQ ID No.3)；
在此位点扩增得到的阔叶猕猴桃物种特异基因型为碱基C/T型组合，其他猕猴桃物种基因型均为C/C型；
B、葛枣猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AP-2，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AP-2标记获取引物F：5’-TGTGGCGATTGCCATAATGC-3’(SEQ ID No.4)，
AP-2标记获取引物R：5’-GGAAGCGATTTGCATCTCTC-3’(SEQ ID No.5)，
AP-2标记延伸引物：5’-aGTTGAGACACCTTCGATATA-3’(SEQ ID No.6)；
在此位点扩增得到的葛枣猕猴桃物种特异基因型为碱基C/C型组合，其他猕猴桃物种基因型均为T/T型；
C、软枣猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AA-3，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AA-3标记获取引物F：5’-CTGCTCTCCCGATTTCTATC-3’(SEQ ID No.7)，
AA-3标记获取引物R：5’-CATCAAATTAGTGGAAGTCCC-3’(SEQ ID No.8)，
AA-3标记延伸引物：5’-catccAATTAGTGGAAGTCCCTACAAC-3’(SEQ ID No.9)；
在此位点扩增得到的软枣猕猴桃物种特异基因型为碱基A/G型组合，其他猕猴桃物种基因型均为G/G型；
D、刺毛猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AS-4，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AS-4标记获取引物F：5’-GCACTTAGTTGCAAGCAATC-3’(SEQ ID No.10)，
AS-4标记获取引物R：5’-GTTCTCGTATGTTAGCTTTGG-3’(SEQ ID No.11)，
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在此位点扩增得到的刺毛猕猴桃物种特异基因型为碱基A/A型组合，其他猕猴桃物种基因型均为G/G型；
E、中华猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AC-5，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AC-5标记获取引物F：5’-GAGTGTTCTGGCCTAGAAAG-3’(SEQ ID No.13)，
AC-5标记获取引物R：5’-TACGGGTCAAAACCAAACCT-3’(SEQ ID No.14)，
AC-5标记延伸引物：5’-gcaacACCAAACCTTTATTGCACCAA-3’(SEQ ID No.15)；
在此位点扩增得到的中华猕猴桃物种特异基因型为碱基C/T型组合，其他猕猴桃物种基因型均为C/C型；
F、长叶猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AH-6，其检测引物组包括获取引物和延伸引物，具体为：
AH-6标记获取引物F：5’-GTGCAAAAGGCTTACGGTTG-3’(SEQ ID No.16)，
AH-6标记获取引物R：5’-TCAAGTCCTGAGGTTGGTTC-3’(SEQ ID No.17)，
AH-6标记延伸引物：5’-ggCCATAAATATTATGGACGGATT-3’(SEQ ID No.18)；
在此位点扩增得到的长叶猕猴桃物种特异基因型为碱基C/C型组合，其他猕猴桃物种基因型均为G/G型。
二、上述六个猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的应用
本实施例随机选择了二十份不同的经过物种形态鉴定的猕猴桃种质资源，提取其基因组DNA，然后分别利用上述阔叶猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AL-1、葛枣猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AP-2、软枣猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AA-3、刺毛猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AS-4、中华猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AC-5、长叶猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AH-6的检测引物组(获取引物和延伸引物)进行PCR扩增，具体过程如图2所示，其中：
聚合酶链式反应体系为：5μL反应体系包括1μM相配对的获取引物F和R(获取引物F和R按照物质的量之比1:1混合，如AL-1标记获取引物F和R、AP-2标记获取引物F和R、AA-3标记获取引物F和R、AS-4标记获取引物F和R、AC-5标记获取引物F和R、或AH-6标记获取引物F和R)的混合物0.5μL，10X聚合酶链式反应缓冲液0.5μL，25mM dNTPs混合液0.1μL，5U/μL链式反应聚合酶0.2μL，5ng/μL基因组DNA模板2μL，余量用水补齐；
聚合酶链式反应扩增程序：95℃变性2分钟；接着45个循环包括95℃30秒，56℃30秒和72℃1分钟；最后72℃延伸5分钟；
对上述聚合酶链式反应的扩增产物进行SAP酶处理以去除反应中剩余的dNTPs；
适用于96孔板的SAP反应混合液包括：SAP酶39.6μL、SAP缓冲液22.44μL和双蒸水201.96μL；
将SAP反应混合液均分到96孔中，每个孔2μL，与扩增产物5μL形成总反应体积7μL；反应程序为37℃40分钟，85℃5分钟；得到SAP酶处理后的聚合酶链式反应扩增产物。
以SAP酶处理后的聚合酶链式反应扩增产物为模板进行单碱基延伸反应，其适用于96孔板的单碱基延伸反应iPLEX混合液体系为：iPLEX缓冲液26.4μL，iPLEX酶5.4μL，相对应的延伸引物1μM，iPLEX终止混合物26.4μL；
将2μL混合均匀的单碱基延伸反应iPLEX混合液体系加入到每个孔中，与7μL SAP酶处理后的聚合酶链式反应扩增产物形成总共9μL的反应体系；(即当上面用某种分子标记的获取引物后，其PCR产物进行单碱基延伸反应时使用其相对应的某种分子标记的延伸引物)
单碱基延伸反应程序：94℃变性39秒；接着40个循环包括94℃5秒，52℃5秒和80℃5分钟；然后5个循环包括52℃和80℃各5秒；最后72℃延伸3分钟；
采用洁净树脂对上述反应产物进行脱盐处理，然后使用MassARRAY平台专用芯片和自动点样仪进行样品点样和上机分析。
鉴定结果如表1所示，鉴定结果展示的特异单核苷酸标记基因型符合阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃和长叶猕猴桃的形态表征。即利用该猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记及其检测引物组，对二十份随机选择的猕猴桃物种资源进行评价鉴定，得到的基因分型结果与物种材料表型特征类型完全一致，利用猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记或其检测引物组可以清晰的区分阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃、长叶猕猴桃。
表1
| 样本编号 | AL-1 | AP-2 | AA-3 | AS-4 | AC-5 | AH-6 |
| 1(黄毛猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 2(京梨猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 3(毛花猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 4(柱果猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 5(阔叶猕猴桃) | C/T | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 6(山梨猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 7(葛枣猕猴桃) | C/C | C/C | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 8(狗枣猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 9(长叶猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | C/C |
| 10(美味猕猴桃品种) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 11(美味猕猴桃品种) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 12(美味猕猴桃品种) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 13(中华猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/T | G/G |
| 14(美味猕猴桃野生株) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 15(大籽猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 16(灰毛猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 17(刺毛猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | A/A | C/C | G/G |
| 18(对萼猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 19(湖北猕猴桃) | C/C | T/T | G/G | G/G | C/C | G/G |
| 20(软枣猕猴桃) | C/C | T/T | A/G | G/G | C/C | G/G |
Claims (5)
1.一种猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的检测引物组，其特征在于，其包括：
A、阔叶猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AL-1的检测引物组，包括获取引物和延伸引物，具体为：
AL-1标记获取引物F：5’-ATGGAAGGTAGATGTTGCCG-3’，
AL-1标记获取引物R：5’-GTCAGATGAGACTGAAGAAG-3’，
AL-1标记延伸引物：5’-ggTGAAGAAGATTTATTCTCAATGTA-3’；
B、葛枣猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AP-2的检测引物组，包括获取引物和延伸引物，具体为：
AP-2标记获取引物F：5’-TGTGGCGATTGCCATAATGC-3’，
AP-2标记获取引物R：5’-GGAAGCGATTTGCATCTCTC-3’，
AP-2标记延伸引物：5’-aGTTGAGACACCTTCGATATA-3’；
C、软枣猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AA-3的检测引物组，包括获取引物和延伸引物，具体为：
AA-3标记获取引物F：5’-CTGCTCTCCCGATTTCTATC-3’，
AA-3标记获取引物R：5’-CATCAAATTAGTGGAAGTCCC-3’，
AA-3标记延伸引物：5’-catccAATTAGTGGAAGTCCCTACAAC-3’；
D、刺毛猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AS-4的检测引物组，包括获取引物和延伸引物，具体为：
AS-4标记获取引物F：5’-GCACTTAGTTGCAAGCAATC-3’，
AS-4标记获取引物R：5’-GTTCTCGTATGTTAGCTTTGG-3’，
AS-4标记延伸引物：5’-ccccAGCTTTGGCTTTTTAGTAA-3’；
E、中华猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AC-5的检测引物组，包括获取引物和延伸引物，具体为：
AC-5标记获取引物F：5’-GAGTGTTCTGGCCTAGAAAG-3’，
AC-5标记获取引物R：5’-TACGGGTCAAAACCAAACCT-3’，
AC-5标记延伸引物：5’-gcaacACCAAACCTTTATTGCACCAA-3’；
F、长叶猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记AH-6的检测引物组，包括获取引物和延伸引物，具体为：
AH-6标记获取引物F：5’-GTGCAAAAGGCTTACGGTTG-3’，
AH-6标记获取引物R：5’-TCAAGTCCTGAGGTTGGTTC-3’，
AH-6标记延伸引物：5’-ggCCATAAATATTATGGACGGATT-3’。
2.权利要求1所述的猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的检测引物组在鉴别阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃和长叶猕猴桃中的应用。
3.一种鉴别阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃和长叶猕猴桃的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测猕猴桃的基因组DNA，分别利用权利要求1所述的猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的检测引物组中各分子标记的检测引物组中的获取引物R和F扩增，扩增产物再用相对应的延伸引物延伸获得延伸产物，对延伸产物进行基因分型，确定待测猕猴桃的特异基因型，然后根据基因型鉴别待测猕猴桃的种类。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的基因分型是将延伸产物用MassARRAY质谱仪平台进行基因分型或者对延伸产物进行测序获得测序结果，基于测序结果确定待测猕猴桃的特异基因。
5.一种用于鉴别阔叶猕猴桃、葛枣猕猴桃、软枣猕猴桃、刺毛猕猴桃、中华猕猴桃和长叶猕猴桃的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的猕猴桃物种关联特异单核苷酸分子标记的检测引物组。
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