CN104611443A - 猕猴桃种间杂交品种金艳的分子鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猕猴桃种间杂交品种‘金艳’的分子鉴定方法，涉及植物种间杂交品种的鉴定方法。本方法是：①‘金艳’猕猴桃及其父母本物种DNA的提取及全基因组序列测定；②‘金艳’猕猴桃及其父母本物种基因组序列的过滤和质量控制；③‘金艳’猕猴桃及其父母本物种全基因组比对到已公开的‘红阳’猕猴桃参考基因组序列；④‘金艳’猕猴桃与母本毛花猕猴桃和父本中华猕猴桃特有SNP发掘、检测并发现‘金艳’含有大量的父母本特异位点；⑤‘金艳’种间杂交特征鉴定SNP位点的重验证。本发明具有重复性好、稳定性高的特点；是第一个应用于猕猴桃种间杂交品种鉴定的方法，可推广应用于其他类似猕猴桃种间杂交品种的分子鉴定。

Description

猕猴桃种间杂交品种金艳的分子鉴定方法
技术领域
本发明涉及植物种间杂交品种的鉴定方法，尤其涉及一种猕猴桃种间杂交品种‘金艳’的分子鉴定方法。
背景技术
建立植物新品种鉴定和保护体系对保护育种者权益、促进植物品种创新、有效利用植物种质资源和促进农林产业发展具有重要意义。分子标记因其稳定、不受表型及环境变异影响，已成为新品种特异性、一致性及稳定性（即DUS测试）测试的重要手段。此外，分子标记解决了目前育种材料遗传基础日益狭窄及选育品种数目增多导致的品种差异趋同问题。利用AFLP和SSR标记等多种分子标记的方法，对油菜、玉米和水稻等多种作物成功地进行了DUS补充测试。在我国，玉米、水稻和大麦等作物的分子鉴定图谱已经成为品种保护国家标准（如，2014年颁布的《大麦品种鉴定技术规程SSR分子标记法》）。单核苷酸多态性（SNP）标记作为第三代分子标记，目前已广泛应用于遗传多样性分析、品种鉴定、遗传连锁图谱构建和重要性状的基因定位等相关研究中。特别是，最近SNP标记在冬、春大麦等品种测试中的成功运用，为猕猴桃等多倍体物种进行分子标记鉴定提供了有力示例。
我国猕猴桃产业和科研的发展已成为猕猴桃品种分子鉴定体系开发的强劲推动力。联想控股现代农业板块公司佳沃集团等大型企业介入农业，在产品的推介、品牌的创建等方面投入大量的资金，推动了我国果品的高端化和国际化；但与此同时，一批劣质及仿冒的品种和果品在市场流通，如何鉴定并保护新品种及其产品已成为国内企业及科研单位的重要任务。随着猕猴桃分子生物学技术的发展，中华猕猴桃的参考基因组草图（616.1Mb）和39040个基因序列已经被公布并得到注释。这为我们开发猕猴桃品种鉴定的分子标记方法提供了科研基础。
本发明选择猕猴桃种间杂交品种‘金艳’为研究对象，拟开发出一套基于测序和生物信息学手段的鉴定猕猴桃种间杂交特征的分子鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种猕猴桃种间杂交品种‘金艳’的分子鉴定方法，适用于‘金艳’杂种特性的鉴定。
本发明的目的是这样实现的：
本方法包括下列步骤：
①‘金艳’猕猴桃及其父母本即中华猕猴桃和毛花猕猴桃物种DNA的提取及全基因组序列测定；
②‘金艳’猕猴桃及其父母本物种基因组序列的过滤和质量控制；
③‘金艳’猕猴桃及其父母本物种全基因组比对到‘红阳’猕猴桃参考基因组序列；
④‘金艳’猕猴桃与母本毛花猕猴桃和父本中华猕猴桃特有SNP发掘和检测，证实‘金艳’含有大量毛花猕猴桃和中华猕猴桃的特异SNP位点，为两者的种间杂交后代；
⑤‘金艳’种间杂交特征鉴定SNP位点的重验证，证明此方法切实可行。
所述的‘金艳’是黄色耐贮藏的猕猴桃品种，由中国科学院武汉植物园选育；母本为毛花猕猴桃，父本为中华猕猴桃。该品种2010年通过国家品种审定（国S-SV-AE-019-2010）,目前是第一个商业化的猕猴桃种间杂交品种。
所述的‘红阳’是红色果肉的猕猴桃品种，由四川省自然资源研究所和苍溪县农业局共同选育，该品种的基因组已经被测定并正式公布在公共网站：http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi。目前，‘红阳’猕猴桃的基因组数据是其他猕猴桃物种和品种生物信息学分析的参照数据。
与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：
本发明开发出一种适用猕猴桃种间杂交品种的分子鉴定方法，经实验证明此套分子鉴定方法具有重复性好、稳定性高的特点。本发明是第一个应用于猕猴桃种间杂交品种鉴定的方法，可推广应用于其他类似猕猴桃种间杂交品种的分子鉴定。
附图说明
图1是利用引物1、2、3、4扩增的‘金艳’和母本毛花猕猴桃特异位点比对图；
图2是利用引物5 扩增的‘金艳’和父本中华猕猴桃特异位点比对图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明：
一、方法
①‘金艳’猕猴桃及其父母本即中华猕猴桃和毛花猕猴桃物种DNA的提取及全基因组序列测定
采用CTAB法提取‘金艳’及其父本中华猕猴桃、母本毛花猕猴桃的DNA，DNA经质量检测合格后基于Illumina HiSeq2000测序平台，对所有的分析样本构建600bp、500bp和180bp的小片段文库，对样本进行6.5×以上的基因组重测序分析，获得‘金艳’及其父母本的基因组序列；
‘金艳’猕猴桃及其父母本物种基因组序列的过滤和质量控制
从测序仪下机的数据可能包含不合格的数据，本发明按照下列标准过滤后使用：去除N碱基含量超过5%的序列，去除低质量碱基（质量值小于5）含量大于50%的序列，去除有测序接头污染的序列，去除具有大量重复的序列；对过滤后的数据，使用FastQC软件，设置为默认参数，进行质量评价；
③测定‘金艳’猕猴桃及其父母本物种基因组比对到‘红阳’猕猴桃参考基因组
首先使用Stampy软件设置为默认参数将每个序列分别比对到参考基因组，得到.bam格式的比对结果；
在文库构建过程中，同一个DNA分子经过PCR扩增后可能被多次测序，得到完全相同的序列；如果在PCR起始几轮时出现错配，这些序列会导致下游发掘SNP步骤中将这些错配鉴定为SNP，影响整体SNP集的正确性；因而本发明使用Picard软件中的MarkDuplicates.jar去除比对结果中的重复序列；
初步的比对将一条条序列单独比对上参考基因组序列，在插入缺失序列边界的碱基通常存在较高的比对错误；因此，本项目使用GATK软件包中的 RealignerTargetCreator先鉴定出候选的插入缺失序列位置，然后再通过IndelRealigner将比对到这些位置的序列进行多序列比对，提高该位置的碱基比对正确率，提高下游发掘SNP和插入缺失序列的准确性；
‘金艳’猕猴桃与母本毛花猕猴桃和父本中华猕猴桃特有SNP发掘、检测并发现‘金艳’含有大量的父母本特异位点，证实其为种间杂交后代：
得到比对结果后，本发明使用GATK软件包的UnifiedGenotyper对每个个体分别进行SNP检测；该软件支持对多倍体进行分析；最终得到初步的检测结果.vcf格式的文件；随后，使用GATK软件包的CombineVariants将所有个体的变异检测结果（.vcf格式的文件）合并为多样本的变异检测结果；最后，使用GATK软件包的SelectVariants筛选符合一定测序深度的位点作为最终变异检测位点(SNP)结果，用于下游分析；
采用如上方法，最终获得‘金艳’与毛花猕猴桃特有的27571个SNP位点、‘金艳’与中华猕猴桃特有的232061个SNP位点；从‘金艳’基因组具有大量的中华猕猴桃和毛花猕猴桃特有SNP位点；此结果证实‘金艳’基因组大部分来源于父本中华猕猴桃、部分来源于母本毛花猕猴桃，‘金艳’为中华猕猴桃和毛花猕猴桃种间杂交品种；
⑤‘金艳’种间杂交鉴定SNP位点的重验证，证明此方法切实可行
在筛选出的25万多个SNP位点中，选择符合如下特征的SNP位点进行验证：a、位点多态性高，PIC 值≥0.40； b、染色体位置已知；c、目标SNP 位点上、下游有150 bp可读，且GC 含量在30%～70%；
基于‘金艳’品种特异的SNP位点及其上下游序列，设计品种特异的引物；引物设计基于程序 PRIMER5，具体要求如下：a、引物长度控制在 17-23bp；b、GC含量 30%-70%；c、退火温度范围在52℃-63℃；d、扩增的PCR 产物长度在70bp-330bp；e、引物序列中不包括其他干扰 SNP 位点和插入缺失序列；
利用如上引物对在‘金艳’和父母本物种中扩增测序、序列比对，检验如上所述的SNP位点的真实可靠性，以此证实本发明切实可行。
二、实施例
1、实施例1：
检验本发明涉及的分子鉴定方法中‘金艳’含有其母本毛花猕猴桃特有的单核苷酸多态性（SNP）位点，证实本发明的有效性。
材料：选取中华猕猴桃、毛花猕猴桃和‘金艳’作为测试材料，检验‘金艳’具备毛花猕猴桃特有的SNP位点。
方法：基于本方法的步骤①-④获得‘金艳’与毛花猕猴桃特有的27571个SNP位点，选取其中位4、13、24、29号染色体上‘金艳’与毛花猕猴桃特异的7单核苷酸多态性（SNP）位点开展验证工作。验证采用本方法步骤⑤设计引物（引物1-4，见表1），开展PCR及测序验证；其中设计引物和PCR鉴定体系见表1。
测序及数据比对：扩增的PCR产物经1%琼脂糖检测，条带清晰并符合原有设计条带大小；将PCR片段克隆入质粒，每个PCR产物挑选3个克隆送至武汉华大基因公司测序；测序数据经质量检测合格后利用Cluster X软件进行比对。
本实验的结果表明：
利用引物1-4（见表1）扩增 ‘金艳’、 中华猕猴桃和毛花猕猴桃序列，获得‘金艳’序列见序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4，对‘金艳’与中华猕猴桃和毛花猕猴桃序列比对发现（见图1），‘金艳’猕猴桃具有7个毛花猕猴桃特有的SNP位点，符合本方法步骤⑤所描述。
本实验验证的‘金艳’猕猴桃与母本毛花猕猴桃特有的7个SNP位点真实存
在，本发明的方法真实有效。
2、实施例2：
检验本方法涉及‘金艳’含有其父本中华猕猴桃特有的单核苷酸多态性（SNP）位点。
材料：选取中华猕猴桃，毛花猕猴桃和‘金艳’作为测试材料，检验‘金艳’具备中华猕猴桃特有的SNP位点。
方法：基于本方法步骤①-④获得 ‘金艳’与中华猕猴桃特有的232061个SNP位点，选取其中位6号染色体上‘金艳’与中华猕猴桃共有的5单核苷酸多态性（SNP）位点开展验证工作。验证采用本方法步骤⑤设计引物（引物5，见表1），开展PCR及测序验证；其中设计引物和PCR鉴定体系见表1。
测序及数据比对：扩增的PCR产物经1%琼脂糖检测，条带清晰并符合原有设计条带大小；将PCR片段克隆入质粒，每个PCR产物挑选3个克隆送至武汉华大基因公司测序；测序数据经质量检测合格后利用Cluster X软件进行比对。
本实验的结果表明：
利用引物5扩增‘金艳’和中华猕猴桃序列进比对发现，‘金艳’猕猴桃具有5个中华猕猴桃特有的SNP位点（表1，序列表SEQ ID NO.5，图2），符合本方法步骤⑤所描述。
本实验验证的‘金艳’猕猴桃与中华猕猴桃特有的5个SNP位点真实存在，
本发明方法真实有效。
表1是‘金艳’种间杂交鉴定SNP位点的验证体系。
验证本发明涉及的分子鉴定体系的真实可靠必须满足，通过简单的PCR检测和测序，引物1-4扩增出的序列包括‘金艳’与毛花猕猴桃特有的7个SNP位点；引物5扩增出的序列包括‘金艳’与中华猕猴桃特有的5个SNP位点；
注：25μL PCR 反应使用的扩增体系：50-100ng/μL 模板DNA 1μL，10pmol/μL 正反向引物（引物的序列详见SEQ ID NO.6- SEQ ID NO.15）各1μL，10mmol/L dNTP Mix 2.0μL，5U/μL TaqDNA 聚合酶0.125μL，10×PCR 反应缓冲液2.5μL，双蒸水17.375μL。
PCR扩增条件为：94℃，5min；②94℃, 1min，55℃，1min，72℃，1min；③72℃,10min；步骤，循环35次。
序列表
<110>中国科学院武汉植物园
<120>猕猴桃种间杂交品种‘金艳’的分子鉴定方法
<140>
<141>
<160> 15
<210> 1
<211> 175
<212> DNA
<400>
TTTACTAGGCATCTTTTATTGACCTGGATATGAAATCATTGAAGAAGATGGAACACTATTATGAATTAGACCAGCAGATAGTCCGCTGCTATGCTCAGATGGTGAACGGAGAGCATCAAGTGGAAAAACCTACGAGTGTTGATCCTTATAGAAATACATATTCAGATCAGTCCAA；
<210> 2
<211> 98
<212> DNA
<400>
TTTGTTTCAGTGCTGGGGGCTTCTAGTTGTTACTGATACAAATATTACTGATATTTTAGGTGTAACACACATGGTTTATCCAGGAGCAGTACATTCTC。
<210> 3
<211> 87
<212> DNA
<400>
GGATAGAACCTCCTTTCCATGCTTTCCTGAACTTTACCTGTCAATCAAATGTAACCTTTGCAATAATAATTGCAAAACAATGAGCTA；
<210> 4
<211> 199
<212> DNA
<400>
CTCGAGTTATGACTAATCAATGTTGAAAATGAACAAAACAACACAAGGGTGCTCCAACAGGCCTGAACTAAAGCAAGTCGCGAGAAAAATGTGGAGAAATGTAACTTTAATTCTTAATTGGAAGGTTTGGAATCATCACCATGAAACTTATTTCACAAAAATGAACTTTTCTCAGGAAACACATTTACATATCCATAGG；
<210> 5
<211> 137
<212> DNA
<400>
GGTCTTCTGGCATCACGTGCAGGATGACCTGTCTTTCTACAGTTCTTGCACGCCTTGTCATTGGTACAGTCAGCTGCAATATGACCTTGCTTGAAGCAGTTATTGCACAACCTCAGATCACCTGGTGGCAATGGGGG；
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<400>
TTTACTAGGCATCTTTT。
<210>7
<211> 17
<212> DNA
<400>
TTGGACTGATCTGAATA。
<210>8
<211> 17
<212> DNA
<400>
TTTGTTTCAGTGCTGGG；
<210>9
<211> 17
<212> DNA；
<400>
GAGAATGTACTGCTCCT
<210>10
<211> 19
<212> DNA
<400>
GGATAGAACCTCCTTTCCA；
<210>11
<211> 17
<212> DNA
<400>
GTAGCTCATTGTTTTGC；
<210>12
<211> 18
<212> DNA
<400>
CTCGAGTTATGACTAATC；
<210>13
<211> 18
<212> DNA
<400>
CCTATGGATATGTAAATG；
<210>14
<211> 17
<212> DNA
<400>
GGTCTTCTGGCATCACG；
<210>15
<211> 19
<212> DNA
<400>
CCCCCATTGCCACCAGGT。

Claims (1)

1.一种猕猴桃种间杂交品种‘金艳’的分子鉴定方法，其特征在于：
①‘金艳’猕猴桃及其父母本即中华猕猴桃和毛花猕猴桃物种DNA的提取及全基因组序列测定；
②‘金艳’猕猴桃及其父母本物种基因组序列的过滤和质量控制；
③‘金艳’猕猴桃及其父母本物种全基因组比对到‘红阳’猕猴桃参考基因组序列；
④‘金艳’猕猴桃与母本毛花猕猴桃和父本中华猕猴桃特有SNP发掘、检测并发现‘金艳’含有大量的父母本特异位点，证实其为种间杂交后代；
⑤‘金艳’种间杂交特征鉴定SNP位点的重验证。
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