CN107164484A - 金农和超红两个猕猴桃品种杂交子代的鉴定方法 - Google Patents
金农和超红两个猕猴桃品种杂交子代的鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种金农和超红两个猕猴桃品种杂交子代的鉴定方法，属于植物遗传育种领域。本方法是：①金农和超红及待鉴定个体的基因组DNA提取；②叶绿体和线粒体分子标记的开发及引物设计；③对金农和超红杂交子代进行鉴定：A、PCR扩增和测序；B、分子标记的基因分型；C、杂交子代的鉴定。与传统形态学鉴定相比，本发明操作简单、重复性好、稳定性高、不受环境影响；节省育种成本。
Description
技术领域
本发明属于植物遗传育种领域，涉及一种金农和超红两个猕猴桃品种杂交子代的鉴定方法，可加快猕猴桃育种进程。
背景技术
猕猴桃是一种功能性雌雄异株多年生的藤本果树，因其丰富的营养价值和独特的风味已成为全球性重要水果。我国猕猴桃产量和面积均居世界第一，在世界猕猴桃产业中具有举足轻重的地位。猕猴桃属种类繁多，我国分布的猕猴桃属植物有52种以上，其中有不少种类都可以食用。这些猕猴桃在果实表型、品质特性和遗传变异等方面表现出丰富的多样性，是培育特色、优良品种的基础；科学家们一直努力致力于猕猴桃新品种的培育，期望培育出具有美味、优质、耐贮、丰产和抗逆等优良性状的品种。采用较多的是野外直接选优、实生育种或杂交育种；而猕猴桃种类多，因此种间或品种间杂交是猕猴桃育种的主要手段。如金艳是从以毛花猕猴桃株系6113作为母本，以中华猕猴桃作父本的杂交子代中经多代选育而形成的新品种；超红是从以毛花猕猴桃为母本，以中华猕猴桃为父本的杂交子代中选育而来，具有长势强、花期长、开红花和枝叶表面灰白色茸毛等偏毛花猕猴桃性状。而金农是从中华猕猴桃的野生资源中直接培育出的二倍体黄肉品种，其风味香甜，树势较强。
但在新品种培育过程中常使用多个猕猴桃物种间或品种间杂交，在管理中有时会出现群体间弄混的现象。准确辨别所有个体之间的遗传背景是猕猴桃新品种培育过程中不可缺少的环节。分子鉴定方法具有操作简单、稳定、不受环境影响等优点，在遗传背景鉴定中具有重要意义，从而加快新品种的培育。常用的分子标记有叶绿体、线粒体和核基因标记，其中，叶绿体基因组属于父系遗传，线粒体基因组属于母系遗传，这两类标记可组合一起进行亲本关系鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金农和超红两个猕猴桃品种杂交子代的鉴定方法，为猕猴桃育种提供理论基础和具体操作技术。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
具体地说，本方法包括下列步骤：
①金农和超红及待鉴定个体的基因组DNA提取
利用液氮对新鲜树皮进行研磨，并转移至2mL离心管中；向离心管中加入1mL 60℃预热的洗液，震荡摇匀，10000rpm离心8min，去上清；向离心管中加入1mL 60℃预热的3×CTAB 提取缓冲液，震荡摇匀，60℃水浴60min，期间每隔15min摇晃一次，然后10000rpm离心8min，取上清至新的2mL离心管中；向离心管中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，其体积比是苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，震荡摇匀10min，12000rpm离心10min，取上清至新的2mL离心管中；向离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇，其体积比是：氯仿：异戊醇＝24：1，震荡摇匀10min， 12000rpm离心10min，取上清至新的2mL离心管中；向离心管中加入等体积的预冷的异丙醇和 1/10体积的3M NaAc，混匀后置于-20℃30min；10000rpm 4℃离心10min，弃上清；用预冷的75％乙醇清洗沉淀后干燥DNA，自然风干或37℃风干；利用50μL TE缓冲液溶解DNA。
②叶绿体和线粒体分子标记的开发及引物设计
利用ILLμmina HiSeq2000测序平台获得金农和超红的叶绿体和线粒体基因组DNA序列；对金农和超红的叶绿体基因组序列进行线性比对，鉴定出叶绿体基因组变异位点，同理鉴定出线粒体基因组变异位点；分别随机挑选3个叶绿体和线粒体基因组变异位点进行引物设计，要求PCR扩增子测序能准确对变异位点进行基因分型；
叶绿体的3对引物分别为：
Kiwi-cp18
F：5’-ACATTCGCGAAGAGCCGTAT-3’，R：5’-CGGGGTCGTATCGATTGGTT-3’；
Kiwi-cp19
F：5’-ACCAAATCACAGGCTGCTGA-3’，R：5’-AATTGGATTGTTGCGAGCGG-3’；
Kiwi-cp24
F：5’-GCCGATTCTAGTTCGCCCAT-3’，R：5’-GGCAGGATTTCGTGGGATCT-3’；
线粒体的3对引物分别为：
Kiwi-mt8
F：5’-GCCCGGTCTGTGAACAACTA-3’，R：5’-ACCTTAGCTTGCACTCGCTT-3’；
Kiwi-mt20
F：5’-CAAACTCCCATCGTGTCCCA-3’，R：5’-GGGGGAAAGAAAAGGGAGGG-3’；
Kiwi-mt21
F：5’-TCTGCACGCATGAGACCATT-3’，R：5’-GGTCCCTTCGCCTATATGCC-3’。
③对金农和超红杂交子代进行鉴定：
A、PCR扩增和测序
对金农和超红及其子代进行PCR扩增，PCR反应体系为30μL，包含DNA模板30～50ng，正/反向引物各0.25μM，2×PCR Mastermix 15.0μL，ddH2O补足至30μL；PCR反应参数为： 94℃预变性4min；35个循环：变性，94℃、45s，退火，54℃、45s和延伸，72℃、45s；72℃终延伸8min；PCR扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳，并回收PCR产物；使用一代测序仪对PCR 产物的序列进行测定；
B、分子标记的基因分型
对于每个分子标记，将所有个体的DNA序列进行线性比对，统计变异位点的基因型；
C、杂交子代的鉴定
根据叶绿体基因组父系遗传和线粒体基因组母系遗传的规律判别子代是否是金农和超红的杂交后代；对于叶绿体分子标记，子代基因型与父本相同，与母本不同；对于线粒体分子标记，子代基因型与母本相同，与父本不同；不仅可以判别子代是否是金农和超红的杂交后代，还可以判断哪个亲本作为父本或母本。
与传统形态学鉴定相比，本发明具有下列优点和积极效果：
①操作简单、重复性好、稳定性高、不受环境影响；
②节省育种成本。
附图说明
图1为本方法的流程图；
图2为叶绿体和线粒体分子标记DNA片段在亲本中的多态位点及其在子代中的遗传图；
子代叶绿体分子标记基因型与超红相同，子代线粒体分子标记基因型与金农相同，因此，子代为以超红为父本、金农为母本的杂交子代。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明。
提供金农为母本，超红为父本。
1、材料获取和基因组DNA提取
在猕猴桃育种过程中，已有以超红为父本、金农为母本的杂交育种工作，取亲本和随机10 株子代的树皮作为实验材料。通过以下步骤提取基因组DNA：(1)利用液氮对新鲜树皮进行研磨，并转移至2mL离心管中；(2)向离心管中加入1mL 60℃预热的洗液，震荡摇匀，10000rpm 离心8min，去上清；(3)向离心管中加入1mL 60℃预热的3×CTAB提取缓冲液，震荡摇匀， 60℃水浴60min，期间每隔15min摇晃一次，然后10000rpm离心8min，取上清至新的2mL离心管中；(4)向离心管中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)，震荡摇匀10min，12000rpm离心10min，取上清至新的2mL离心管中；(5)向离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)，震荡摇匀10min，12000rpm离心10min，取上清至新的2mL离心管中；(6)向离心管中加入等体积的预冷的异丙醇和1/10体积的3M NaAc，混匀后置于-20℃至少30min；10000rpm 4℃离心10min，弃上清；(7)用预冷的75％乙醇清洗沉淀后干燥DNA(自然风干或37℃风干)；(8)利用50μL TE缓冲液溶解DNA。
2、分子标记的开发及引物设计
对‘金农’和‘超红’的叶绿体基因组序列进行线性比对，鉴定出叶绿体和线粒体基因组变异位点；分别随机挑选3个叶绿体和线粒体基因组变异位点进行引物设计，设计参数和要求如下：(1)上下游引物序列离变异位点至少有100bp；(2)引物序列长度为19～23bp；(3) 引物序列GC含量为40％～60％；(4)扩增子长度为600～1000bp。这3对叶绿体分子标记的引物和3对线粒体分子标记的引物见下表：
3、PCR扩增和测序
以上述6对引物对金农和超红及其子代进行PCR扩增，PCR反应体系为30μL，包含DNA模板 30～50ng，正/反向引物各0.25μM，2×PCR Mastermix 15.0μL，ddH2O补足至30μL；PCR反应参数为：94℃预变性4min；35个循环：变性，94℃、45s，退火，54℃、45s和延伸，72℃、45s；72℃终延伸8min；PCR产物经电泳、回收后进行DNA测序。
4、基因分型
将每个分子标记的所有个体的序列进行线性比对，统计所有变异位点的基因型。如图2所示，叶绿体分子标记引物Kiwi-cp18，Kiwi-cp19和Kiwi-cp24扩增的片段序列中，分别发现有2、 3和4个SNP位点；线粒体分子标记引物Kiwi-mt8，Kiwi-mt20和Kiwi-mt21扩增的片段序列中，分别发现有1、1和3个SNP位点。
5、杂交子代鉴定
子代鉴定的理论依据为：叶绿体基因组为父系遗传；线粒体基因组为母系遗传。如图2所示，子代个体叶绿体分子标记的基因型全与父本超红相同，符合叶绿体父系遗传的特性；子代个体线粒体分子标记的基因型全与母本金农相同，符合线粒体母系遗传的特性。因此，所鉴定的3个子代全为以超红为父本、金农为母本的杂交子代。
序列表
<110>中国科学院武汉植物园
<120>金农和超红两个猕猴桃品种杂交子代的鉴定方法
<140>
<141>
<160>18
<210>1
<211>875
<212>DNA
<400>
TAACCCTCTCATATATCTCATCCCGCCCAGATATCTTTGCAAGTGAGATAATTGTCTTTTCAACATAGCTGCATTTCTTTTCGGAAGACGGTTGAGTCTGCCCATTTTTTGTTCCATTCTCAAGTCTCCGAACTTTTGAAGTCTCGTTTTTGTAGTGGACCAATTCGTTAACATACCACCGAGCCATTTTTTATTAACATAATGACATCGAGCCTTTATTGCAGCCCGTGCTACTGAATCAGCTGCTTCATTTTTGGTACCAACAATTAAGAATTGTTTTCCCCTACTTGCTGCATCAAAAACCAAATCACAGGCTGCTGATAAAAAGCGAGCAGTTCTAGTAAGATTTGTAATATGAATACCTTTACGCTTTGCAGAGATATAAGACGCCATTCTAGGGTTCCATTTCCTAGTACCATGGCCAAAATGAACTCCTGCCTTCATCATCTCTTTCAATTTGATGTTCCAATATCTTCTTGTCATTTTTCCCCACACTTACCCTCCCTTTTAAGAGACGAGGTACCCTGAAAAAACAAAAATAATTGTTCCGATGGAACCTTCTCTTCTACCGTAGATGTAGATACACGATGCAAGCCGTTATTCTTTTCTATTCATTATTTTCTTTATTACCAAATCAAATGGCCGGACCAAATGCAGATAGTTAAAAGGATGAATCCGCTCTTAGGAATCTATAAATGATTGTTCTGGTGTATCATGGAAATTCTTTGAAAGACAAGAATCAAATAATTTTCTGTGGTGGAACAAAATATCTCTCATTTCTAACTCGAATAGATTCTTTTTTTTGGTTTCCACAGGAATGTTGTTATGTTGCCTTAAAGGGGGCATTAATCCTTTGAATCCGGTACCAACGGGTA；
<210>2
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<212>DNA
<400>
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<212>DNA
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TACTCATCCATCAGCTCCTCTCGTAGTCGTAGATCGGTGCGGTTTTACGAAGCGTCTAAGCACAGTTCACTCGCGTTGATCAATCTTCAGTTTTGCCGCCACTCCTTAAGGTTACCTGTTGTATCATACACTTATTGCATTCTTTCCCACGCTTCATACCCCCCTCTTTCTTCTTAAGGTAAGGTAAAGGGCCAGGCATGGTGGGGTAGGAGCATCCAGTCGGCAATCTTTTTGGCTTGACCAATCAGTCTTATGTCCTCCGAGTCGCACGGCGTTTTAACCGAAAGAACTTCTTGCGCAATTAATGCCTTTCTGTTTTTATGACCAGAAATTGATTCTTGATTTCCATTTAAAAGAGTTCTCTGGACTTTTTATCAATATGAGGTGATCGTAACACAGTATATAAGACTCGTGATTCAGGCAATCCAATCTTCCGTGTGTAAGGCGGAAGCCCCCAAAAATGGTTTTCCAAAAATGGGTGATCAAAAGATCGAATCACTATGCGTATCTTGGTGGTCGTTACTTTTGGTGGTCTGGTCTTTCTTTTTGGCTGACTCCTATTCCTGTTCTATTGATCAGAAGCATCCAGCAGCGCCACTTAGGTTTAGAATTCGAT；
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TTTCTTTTGATCAACCGAGTACCCAGCTCTACTGACTTGATTTACTAACAGCAGCACCTGCCGTGGGCTTTACTGACTAACGAGTTATCTGACGGCACCTAAGCCTAGCTCCCGGAAAGAGATAGGTTTTATTCATCTGCCCTCCGCCTGGAAAGAAAGAATCTGTCAATCTGCCTACTTCCTTCTCGCTACCAGCACGAGATAGATTTTATGATCCACTTGCTTTCTCGCTTGACTTGAGGATTGCTGGTGAAACTAGGCTTCCTAGCTATCGGAAAGAGAACGAGGAGTTTACTACGACCCTCGGAGCTTGAGCGCTTCGCTTTCCCTGAACCAGAAGTCAACTGCAACTTGAACCTAAGAGCAAGTTTACGAAGCGAGCCCAGAAGAGCGAGGGACTCTATCACAGCACCTATCGGTGATCAACTGGCATTCTCTCTGATCTCAAACTAAAGCGAGCAAGGGGAAAGGATGGGTGGCCCATCAGTCCGCCGCCAGCAGCATCACTATACCACAATGATAGGAACCAAGGCGGCATGAGGTAACGACACAATAGGCAACGAAGCTATATGTATCGAAGTACGTAGCACCATAGCACTATGTGTGGCTAAGTTAA；
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CGGGGTCGTATCGATTGGTT；
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GGTCCCTTCGCCTATATGCC。
Claims (1)
1.一种金农和超红两个猕猴桃品种杂交子代的鉴定方法，其特征在于：
①金农和超红及待鉴定个体的基因组DNA提取
利用液氮对新鲜树皮进行研磨，并转移至2mL离心管中；向离心管中加入1mL 60℃预热的洗液，震荡摇匀，10000rpm离心8min，去上清；向离心管中加入1mL 60℃预热的3×CTAB提取缓冲液，震荡摇匀，60℃水浴60min，期间每隔15min摇晃一次，然后10000rpm离心8min，取上清至新的2mL离心管中；向离心管中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，三种成分的体积比为25：24：1，震荡摇匀10min，12000rpm离心10min，取上清至新的2mL离心管中；向离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇，其体积比是氯仿：异戊醇=24：1，震荡摇匀10min，12000rpm离心10min，取上清至新的2mL离心管中；向离心管中加入等体积的预冷的异丙醇和1/10体积的3M NaAc，混匀后置于-20℃ 30min；10000rpm 4℃离心10min，弃上清；用预冷的75%乙醇清洗沉淀后干燥DNA，自然风干或37℃风干；利用50μL TE缓冲液溶解DNA；
②叶绿体和线粒体分子标记的开发及引物设计
利用ILLμmina HiSeq2000测序平台获得金农和超红的叶绿体和线粒体基因组DNA序列；对金农和超红的叶绿体基因组序列进行线性比对，鉴定出叶绿体基因组变异位点，同理鉴定出线粒体基因组变异位点；分别随机挑选3个叶绿体和线粒体基因组变异位点进行引物设计，要求PCR扩增子测序能准确对变异位点进行基因分型；
叶绿体的3对引物分别为：
SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12；
线粒体的3对引物分别为：
SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18；
③对金农和超红杂交子代进行鉴定：
A、PCR扩增和测序
对金农和超红及其子代进行PCR扩增，PCR反应体系为30μL，包含DNA模板30～50ng，正/反向引物各0.25μM，2×PCR Mastermix 15.0μL，ddH2O补足至30μL；PCR反应参数为：94℃预变性4min；35个循环：变性，94℃、45s，退火，54℃、45s和延伸，72℃、45s；72℃终延伸8min；PCR扩增后进行1%琼脂糖凝胶电泳，并回收PCR产物；使用一代测序仪对PCR产物的序列进行测定；
B、分子标记的基因分型
对于每个分子标记，将所有个体的DNA序列进行线性比对，统计变异位点的基因型；
C、杂交子代的鉴定
根据叶绿体基因组父系遗传和线粒体基因组母系遗传的规律判别子代是否是金农和超红的杂交后代；对于叶绿体分子标记，子代基因型与父本相同，与母本不同；对于线粒体分子标记，子代基因型与母本相同，与父本不同；不仅可以判别子代是否是金农和超红的杂交后代，还可以判断哪个亲本作为父本或母本。
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| CN104789650A (zh) * | 2015-01-09 | 2015-07-22 | 贵州禾睦福种子有限公司 | 芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法 |
| CN104611443A (zh) * | 2015-02-06 | 2015-05-13 | 中国科学院武汉植物园 | 猕猴桃种间杂交品种金艳的分子鉴定方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DAWEI LI等: "Maternal inheritance of mitochondrial genomes and complex inheritance of chloroplast genomes in Actinidia Lind.: evidences from interspecific crosses", 《MOLECULAR GENETICS AND GENOMICS》 * |
| 贾敬贤等: "《中国作物及其野生近缘植物 果树卷》", 31 July 2006, 中国农业出版社 * |
| 钟彩虹等: "湖北省猕猴桃产业发展调查与研究", 《湖北农业科学》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108977575A (zh) * | 2018-09-30 | 2018-12-11 | 中国科学院武汉植物园 | 用于猕猴桃rc197品种鉴定的分子标记引物及应用 |
| CN108977575B (zh) * | 2018-09-30 | 2021-05-11 | 中国科学院武汉植物园 | 用于猕猴桃rc197品种鉴定的分子标记引物及应用 |
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