CN114875168A - 一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记及其检测引物与应用 - Google Patents

一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记及其检测引物与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记及其检测引物与应用。本发明的InDel标记为在如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第82bp与第83bp之间位置存在一个碱基T的缺失；检测引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明开发获得了与苦瓜粒瘤有无完全共分离的InDel分子标记，可以实现在苦瓜种子或者幼苗阶段根据分子标记基因分型的结果来判定苦瓜的粒瘤有无，可以辅助苦瓜瘤型的选择，提高苦瓜理想瘤型品种的培育效率。

Description

一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记及其检测 引物与应用
技术领域
本发明属于蔬菜分子育种技术领域，具体涉及一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记及其检测引物与应用。
背景技术
苦瓜(Momordica charantia L.)属于葫芦科苦瓜属一年生攀援性草本植物，原产于非洲地区，现广泛分布于亚洲和非洲的热带、亚热带地区。果瘤即果实表面的瘤状凸起是苦瓜最主要的特征性状。依据果瘤的形态特征，苦瓜大体上可分为果瘤数量多且小的粒瘤苦瓜和无粒瘤的油苦瓜两种类型。我国不同地域消费者对不同果瘤类型苦瓜的消费偏好不同。因此，果瘤是影响市场消费选择的重要外观品质性状，也是育种家进行苦瓜新品种遗传改良的重要目标性状之一。
当前，育种家进行苦瓜果瘤性状选择时，主要依靠传统的田间观察鉴定方法，存在鉴定效率低，周期长等问题，大大限制了期望瘤型苦瓜新品种的选育效率。因此，开发苦瓜果瘤性状共分离的分子标记，以便利用分子标记对果瘤类型进行辅助选择育种，可以实现在种子或者苗期阶段对个体的果瘤类型进行早期快速鉴别，对于提高苦瓜新品种遗传改良效率和水平具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记及其检测引物与应用，可用用于苦瓜果瘤性状分子标记辅助育种。
本发明选取有粒瘤苦瓜材料‘K44’和无粒瘤油苦瓜材料‘K8-201’分别作为母本和父本，通过人工杂交和自交获得果瘤性状分离的F2群体，从F2群体中选择有粒瘤和无粒瘤的各50个单株分别构建有粒瘤基因池和无粒瘤基因池，连同父母本一起进行全基因组重测序，通过对两个基因池的SNP-index差值(ΔSNP-index)进行统计分析，鉴定与苦瓜果瘤性状显著关联的候选区域；然后在候选区域进一步开发父母本之间存在多态的InDel(insertion and deletion)分子标记，最后利用多态性InDel分子标记对果瘤性状存在分离的F2群体和自交系群体进行基因分型，旨在获得与果瘤性状共分离的InDel分子标记，最终实现在种子或者苗期阶段对苦瓜果瘤性状进行早期快速鉴别，提高苦瓜果瘤选择育种效率。具体如下：
一、鉴定与苦瓜粒瘤有无显著相关的候选基因组区域
选取有粒瘤苦瓜材料‘K44’和无粒瘤油苦瓜材料‘8-201’分别作为母本和父本，通过人工杂交和自交获得果瘤性状分离的包含230个单株的F2群体；对230个F2单株进行果瘤类型鉴定，从F2群体中选择有粒瘤和无粒瘤的各50个单株分别构建有粒瘤和无粒瘤基因池；连同父母本一起进行高深度(平均深度40.76×)全基因组重测序；通过对两个基因池的SNP-index差值(ΔSNP-index)进行统计分析，结果在苦瓜4号染色体上鉴定到1个与苦瓜果瘤性状显著(置信水平＝0.99)关联的候选区域，该候选区域起止物理坐标为19431924～24253081，物理区间长度为4.82Mb。
二、开发与粒瘤有无共分离InDel分子标记
在上述4.82Mb候选区域内，均匀开发了8个InDel标记，利用这8个InDel标记对230个F2单株进行基因分型，结果发现一个标记(命名为fw4)在这230个F2单株中完全与苦瓜粒瘤有无表型共分离。进一步利用fw4两侧的分子标记fw3和fw5分别对230个F2单株进行基因分型，筛选在fw3和fw5之间存在重组交换的单株，结果共鉴定到14个重组单株。同时，在fw3和fw5之间继续均匀新开发了7个InDel和SNP标记，并利用fw3、fw4、fw5以及新开发的7个标记对14个重组单株进行基因分型。结果发现1个InDel标记(fw3.6)在14个重组单株中与果实粒瘤有无表型完全共分离。最后，利用fw3.6标记及其引物对74份具有不同果瘤类型的苦瓜自交系材料进行基因分型，结果发现fw3.6基因分型与粒瘤有无表型完全对应。
因此，本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记，所述的InDel标记为在如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第82bp与第83bp之间位置存在一个碱基T的缺失。
优选，所述的InDel标记的检测引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的检测引物，所述的检测引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的试剂盒，其含有所述的检测引物。
本发明还提供所述的InDel标记、所述的检测引物在鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无中的应用。
本发明还提供一种鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的方法，包括以下步骤：
a.提取待鉴定苦瓜DNA；
b.采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物，以待鉴定苦瓜DNA为模板进行PCR扩增；
c.用内切酶Dde I对PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行电泳检测；
d.结果判定：
当酶切产物只有117bp特征条带时，判定该苦瓜为有粒瘤苦瓜类型；
当酶切产物只有82bp和34bp特征条带时，判定该苦瓜为无粒瘤苦瓜类型；
当酶切产物同时含有117bp、82bp和34bp特征条带时(基因型为杂合型)，判定该苦瓜为有粒瘤苦瓜类型。
优选，所述的PCR扩增反应体系为：50ng/μL的DNA模板1μL，Taq MasterMix 5μL，ddH2O 3μL，10μM的上游引物0.5μL，10μM的下游引物0.5μL。
优选，所述的PCR扩增反应程序为95℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃1min，共计34个循环；72℃5min。
优选，所述的Dde I酶切反应体系为：2μLPCR扩增产物，1μL 10×CutSmartbuffer，5UDde I，6.5μL ddH2O；反应程序为37℃1h，65℃20min，4℃保存。
本发明建立了一种鉴定苦瓜粒瘤有无的InDel标记开发及其应用的体系。首先使用混合分组分析法鉴定与苦瓜粒瘤有无的显著关联区域，然后在该区域开发获得与苦瓜粒瘤有无表型完全共分离的InDel标记，并在粒瘤有无表型分离的家系和自然群体中进行了验证。
本发明具有以下有益效果：
利用分布广泛，数量多且准确性高的SNP标记进行混合分组分析方法快速定位苦瓜粒瘤有无显著关联区域。开发获得了与苦瓜粒瘤有无完全共分离的InDel分子标记，可以实现在苦瓜种子或者幼苗阶段根据分子标记基因分型的结果来判定苦瓜的粒瘤有无，可以辅助苦瓜瘤型的选择，提高苦瓜理想瘤型品种的培育效率，解决了现有技术采用常规田间观察鉴定的方法进行苦瓜果瘤的选育存在的过程繁琐、耗时费力等缺点。
附图说明
图1是有粒瘤苦瓜母本‘K44'和无粒瘤苦瓜父本‘K8-201'的果实外观比较，标尺为5cm。
图2是苦瓜粒瘤有无性状的精细定位图。
图3是fw3.6标记及其引物在74份苦瓜材料中的基因分型结果。
图4是在InDel位点下游4bp处(T)引入错配碱基(G)创造酶切位点(Dde I)示意图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
(一)试验材料及表型鉴定
以有粒瘤苦瓜自交系‘K44’为母本，无粒瘤油苦瓜自交系‘K8-201’为父本(图1)，通过杂交获得F1群体，F1再自交获得果瘤性状分离的F2群体(n＝230)。将双亲、F1和F2群体同时浸种催芽育苗，定植到大田，常规肥水管理。授粉后18天时，利用肉眼观察法对双亲、F1和F2群体每一单株的苦瓜果实进行果瘤表型鉴定。
(二)DNA提取
(1)称取100mg新鲜幼嫩真叶，在液氮中快速研磨成粉末，转入2mL离心管中。
(2)加入700μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，混匀，65℃水浴45min。
(3)冷却后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，轻缓多次颠倒混匀，12000rpm离心5min。
(4)转上清液于新的2mL离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：:1)，上下颠倒混匀，12000rpm离心5min。
(5)转上清液至新的2mL离心管中，加2/3体积的预冷异丙醇，轻缓颠倒混匀，4℃放置30min。
(6)4℃条件下12000rpm离心10min，弃去上清液，用70％乙醇将沉淀清洗两次，风干。
(7)用50μL 1×TE溶解沉淀，再加RNase放到37℃恒温箱中消化3小时，去除RNA，最后-20℃冰箱保存DNA溶液。
(三)苦瓜果实粒瘤有无性状的BSA-seq定位和连锁验证
从‘K44’בK8-201’F2群体中选择有粒瘤和无粒瘤的各50个单株分别构建有粒瘤和无粒瘤基因池，连同父母本一起进行高深度(平均深度40.76×)全基因组重测序，通过对两个基因池的SNP-index差值(ΔSNP-index)进行统计分析，在苦瓜4号染色体上鉴定到1个与苦瓜果瘤性状显著(置信水平＝0.99)关联的候选区域，该候选区域起止物理坐标为19431924～24253081，物理区间长度为4.82Mb(图2a)。
基于双亲重测序获得的遗传变异位点信息，在BSA-seq初定位区间均匀开发了8对在‘K44’和‘K8-201’间存在多态的引物，然后利用这8对多态引物对230个‘K44’בK8-201’F2单株进行基因分型。具体PCR反应体系为DNA(50ng/μL)模板1μL，Taq Master Mix 5μL，ddH2O 3μL，上游引物(10μM/L)0.5μL，下游引物(10μM/L)0.5μL。PCR反应程序为95℃变性3min；95℃变性30s，54～58℃退火30s，72℃延伸1min，共计34个循环；72℃延伸5min。将PCR产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经过银染并统计带型，确定样品基因型。基于8个多态引物的基因分型结果，对粒瘤有无性状进行局部连锁作图，结果发现8个标记与果实粒瘤有无存在不同程度连锁，其中fw4与果实粒瘤有无完全共分离，据此将控制果实粒瘤基因定位在标记fw3和fw5之间(图2b)。
(四)控制苦瓜果实粒瘤基因的精细定位
利用初定位群体水平共分离标记fw4两侧的标记fw3和fw5对230个‘K44’בK8-201’F2单株进行重组株的筛选，结果共鉴定到14个重组单株并将它们定植到大田进行果瘤表型鉴定。同时，在fw3和fw5之间继续开发了7个新的分子标记，对14个重组单株进行基因分型，结果发现fw3.6标记在14个重组体中与果实粒瘤有无的表型完全共分离(图2c)。
fw3.6标记反映的是父母本间1bp的InDel变异，母本‘K44’相比对父本‘K8-201’在4号染色体上物理坐标21927645位置插入了1个碱基T。fw3.6标记上游引物序列为5’-TGCATCAAGACTTCTGCCAA-3’(SEQ ID NO.3)，下游引物为5’-TCTTCCAGGCTTCTGCATTATCAAAAAACACTGA-3’(SEQ ID NO.4)。该对引物对应PCR扩增父本‘K8-201’的基因组DNA区段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该对引物对应PCR扩增母本‘K44’的基因组DNA区段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。InDel标记为在如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的在第82bp与第83bp之间位置存在一个碱基T的缺失。本发明在引物设计时，通过在目的InDel变异位点下游4bp处(T)引入错配碱基(G)，人工创造1个Dde I识别位点(图4)。利用上述引物对父母本DNA进行PCR扩增，然后利用内切酶Dde I对PCR产物进行酶切，以有粒瘤母本‘K44’DNA为模板扩增获得的产物，由于Dde I识别位点插入了碱基T，内切酶DdeI无法识别，因此不能被Dde I酶切，电泳检测只有1条117bp的条带；以无粒瘤父本‘K8-201’DNA为模板扩增获得的产物，可以被Dde I识别，能被Dde I酶切获得82bp和34bp两条条带。上述的PCR扩增反应体系为：DNA(50ng/μL)模板1μL，Taq Master Mix 5μL，ddH2O 3μL，上游引物(10μM)0.5μL，下游引物(10μM)0.5μL，反应程序为95℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃1min，共计34个循环；72℃5min，12℃保存。上述的Dde I酶切反应体系为：2μL PCR扩增产物，1μL10×CutSmartbuffer，5UDde I，6.5μL ddH2O，反应程序为37℃1h，65℃20min，4℃保存。
实施例2
在幼苗期采集不同来源的33份有粒瘤苦瓜自交系材料和41份无粒瘤苦瓜自交系材料的嫩叶提取DNA，利用fw3.6分子标记及fw3.6标记上、下游引物(同实施例1中引物序列)进行基因分型，具体PCR扩增反应及酶切反应体系见实施例1，酶切反应结束后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并进行条带统计分析：
(1)如某材料的电泳条带与母本‘K44'电泳条带(117bp特征条带)大小相同，则判定该材料为有粒瘤苦瓜类型；
(2)如某材料的电泳条带与父本‘K8-201'电泳条带(82bp和34bp特征条带)大小相同，则判定该材料为无粒瘤苦瓜类型；
(3)如某材料的电泳条带同时出现母本‘K44'(117bp特征条带)和父本‘K8-201'(82bp和34bp特征条带)的电泳条带，即基因型为杂合型，则判定该材料为有粒瘤苦瓜类型。基于上述判定规则，通过比较74份苦瓜自交系的fw3.6的标记分型结果和果瘤表型结果(图3，表1)，发现准确率为100％。因此，开发的分子标记fw3.6及其引物可以用于苦瓜幼苗阶段植株果实有无粒瘤的早期鉴定。
表1 74份苦瓜自交系果瘤性状表型及fw3.6标记分型统计
Figure BDA0003690266160000061
Figure BDA0003690266160000071
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记及其检测引物与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> DNA
<213> 苦瓜K8-201(Momordica charantia L. K8-201)
<400> 1
tgcatcaaga cttctgccaa tcattagaat gatgaagaaa accacaaaaa taaaagacag 60
gtgagctacc agagaacatt tctcagtgtt ttttgataat gcagaagcct ggaaga 116
<210> 2
<211> 117
<212> DNA
<213> 苦瓜K44(Momordica charantia L. K44)
<400> 2
tgcatcaaga cttctgccaa tcattagaat gatgaagaaa accacaaaaa taaaagacag 60
gtgagctacc agagaacatt tcttcagtgt tttttgataa tgcagaagcc tggaaga 117
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcatcaaga cttctgccaa 20
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcttccaggc ttctgcatta tcaaaaaaca ctga 34

Claims (10)

1.一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的InDel标记，其特征在于，所述的InDel标记为在如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第82bp与第83bp之间位置存在一个碱基T的缺失。
2.根据权利要求1所述的InDel标记，其特征在于，所述的InDel标记的检测引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的检测引物，其特征在于，所述的检测引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种用于鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的检测引物。
5.权利要求1所述的InDel标记在鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无中的应用。
6.权利要求3所述的检测引物在鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无中的应用。
7.一种鉴定苦瓜果实表面粒瘤有无的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.提取待鉴定苦瓜DNA；
b.采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物，以待鉴定苦瓜DNA为模板进行PCR扩增；
c.用内切酶Dde I对PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行电泳检测；
d.结果判定：
当酶切产物只有117bp特征条带时，判定该苦瓜为有粒瘤苦瓜类型；
当酶切产物只有82bp和34bp特征条带时，判定该苦瓜为无粒瘤苦瓜类型；
当酶切产物同时含有117bp、82bp和34bp特征条带时，判定该苦瓜为有粒瘤苦瓜类型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应体系为：50ng/μL的DNA模板1μL，Taq Master Mix 5μL，ddH2O 3μL，10μM的上游引物0.5μL，10μM的下游引物0.5μL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为95℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃1min，共计34个循环；72℃5min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的Dde I酶切反应体系为：2μLPCR扩增产物，1μL 10×CutSmart buffer，5UDde I，6.5μL ddH2O；反应程序为37℃1h，65℃20min，4℃保存。
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