CN112322769A - 一种与黄瓜多表皮毛性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与黄瓜多表皮毛性状相关的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记是以‘Chinese Long v2’黄瓜基因组数据库中的Chr6:27397366位点前后各400bp的DNA序列为模板设计引物，扩增得出的基因组序列如SEQ ID NO:1所示，自5’端起，在该序列的第401位存在A/C多态性，即SNP位点。本发明分子标记与黄瓜多表皮毛基因紧密连锁，可靠且检测快捷，可用于黄瓜多表皮毛相关性状的定向遗传育种。对于加快黄瓜品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

Description

一种与黄瓜多表皮毛性状相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种与黄瓜多表皮毛性状相关的SNP分子标记及其应用，属于黄瓜分子遗传育种领域。

背景技术

表皮毛(Trichomes)由表皮细胞发育而来的。它分为单细胞或多细胞，有的有分支有的不分支。在表皮毛中有的有腺体，可以分泌一些脂类物质或次生代谢物，有的无腺体，相同的植物上能产生不同类型的表皮毛。植物表皮毛具有一系列功能：无腺体的表皮毛具有散热、增加对冷害的忍受力、方便种子传播、水分的吸收、保护紫外和一些食草昆虫对植物组织损伤的作用；有腺体的表皮毛可通过分泌化学物质来帮助植物抵抗食草昆虫和病原菌，同时也具有吸引动物或堆积盐分的作用。一些无腺体的表皮毛，比如棉纤维是来自棉花种子单细胞表皮毛，对于纺织工业是十分重要的。

模式植物拟南芥的表皮毛由于其具有简单的结构和易观察的优点已经成为研究表皮毛细胞形态建成的模式系统。在拟南芥中表皮细胞发育成表皮毛细胞的进程涉及由三个转录因子组成的复合物的正调控和一个抑制因子的负调控。其中两个转录因子的突变都会引起植株表皮毛的缺失，第一个是GLABRA1(GL1)，它是一个有两个包含DNA-binding结构域的MYB重复转录因子，属于R2R3类型的MYB家族，第二个是TRANSPARENT TESTA GLABRA1(TTG1)，它编码一个WD40 repeat的蛋白，同时还影响着其它几个代谢途径，这两个转录因子与GLABRA3(GL3)互作而形成复合物，GL3的突变表现为植株表皮毛的减少，它是一个bHLH家族的转录因子。

黄瓜(Cucumis sativus L)属葫芦科甜瓜属一年生蔓生草本植物，是世界上十大蔬菜作物之一。黄瓜植株茎、叶、卷须、花萼、子房表面均覆有短刚毛，果实均有刺，多数子房表面有瘤状突起，瘤上有刺，但是有些品种果实上没有果瘤。通过组织学观察，发现黄瓜叶片上的刚毛和果实上的果刺形态结构一样，均为多细胞无腺体的表皮毛。目前大多数黄瓜毛状体皮毛缺陷突变体具有无毛表型，但如今对黄瓜多毛性状的研究仍是空白的，这给黄瓜果实表皮相关性状的遗传改良和分子标记辅助育种带来了困难。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种黄瓜多表皮毛性状相关的SNP分子标记，即利用黄瓜基因序列上与多表皮毛性状显著关联的SNP位点进行分子标记选择。

本发明第二个目的是提供用于检测上述SNP分子标记的一对引物。

本发明的第三个目的是提供上述SNP分子标记的应用。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种与黄瓜多表皮毛性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记是以‘ChineseLong v2’黄瓜基因组数据库中的Chr6:27397366位点前后各400bp的DNA序列为模板设计引物，扩增得出的基因组序列如SEQ ID NO:1所示，自5’端起，在该序列的第401位存在A/C多态性(SNP位点)，即所述SNP位点位于SEQ ID NO:1上第401位，碱基为A或C。

根据SNP位点的基因型确定黄瓜多表皮毛的有无：AA基因型为正常表皮毛黄瓜，CC基因型为多表皮毛黄瓜，AC基因型为介于多表皮毛和正常表皮毛黄瓜的中间型多表皮毛黄瓜。

一种用于检测所述的SNP分子标记的引物对，包括正向引物、反向引物，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：

正向引物：5′TATTTGAAAGGAGAGAGATG 3′，如SEQ ID NO:2所示。

反向引物：5′TGATATTTACACTGGCTGTT 3′，如SEQ ID NO:3所示。

一种用于检测所述的SNP分子标记的试剂盒，其包含所述的引物对。

所述的SNP分子标记、所述的引物对或所述的试剂盒在黄瓜多表皮毛性状检测中的应用。

一种检测黄瓜多表皮毛性状的方法，包括通过对待测黄瓜进行所述的SNP分子标记的检测，确定所述待测黄瓜的多表皮毛性状。

进一步的，所述的检测黄瓜多表皮毛性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测黄瓜的基因组DNA；

(2)利用所述的引物对或所述的试剂盒进行PCR扩增，检测其SNP位点的基因型是AA、CC还是AC；

(3)最后根据基因型确定黄瓜的多表皮毛性状。

扩增产物进行一代Sanger测序，分析测序结果，位于测序序列其正向扩增第401位点的A/C多态性，基于该位点SNP多态性判读基因型为AA、CC以及AC三种基因型，根据基因型确定黄瓜多表皮毛的有无：AA基因型为正常表皮毛黄瓜，CC基因型为多表皮毛黄瓜，AC基因型为介于多表皮毛和正常表皮毛黄瓜的中间型多表皮毛黄瓜。

SNP标记一般只有两种等位基因型，可以较为容易的区分纯合基因型和杂合基因型，具有数量巨大、分布密度大、检测快速等优点。近几年来，高通量测序技术的发展(SLAF-seq，BSA-seq，RAD-seq等)，使得SNP标记的开发更加简便。本发明利用高通量测序技术结合图位克隆等连锁分析手段开发与黄瓜多表皮毛状相连锁的SNP标记，相信定会加快黄瓜多表皮毛相关性状的定向遗传育种的进程。

技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：

(1)通过筛选获得与黄瓜多表皮毛基因紧密连锁的分子标记(MT-SNP8)，为分子标记辅助育种和克隆基因奠定了基础。利用本发明与黄瓜多表皮毛基因紧密连锁的分子标记，进行多表皮毛基因的鉴定，在包含700个单株的样品中选择效率均为100％。

(2)通过本发明分子标记定位的基因位点精确，鉴定方便。由于这个标记与黄瓜多表皮毛基因紧密连锁，因此，在苗期就可以用上述的分子标记方法测定植株的表型，有效解决了表型鉴定结果可靠性低、费时、成本高、难度大等问题，简便又快速。

(3)本发明提供的分子标记可广泛应用于分子辅助育种中多表皮毛基因的分子检测，实现基因的产业化分子育种。

附图说明

图1为黄瓜多表皮毛突变体与野生型WT表型比对图；

图2为引物MT-SNP8扩增序列测序结果峰图，图中箭头所指为其正向扩增第401核苷酸位点为AA基因型；

图3为引物MT-SNP8扩增序列测序结果峰图，图中箭头所指为其正向扩增第401核苷酸位点为AC基因型；

图4为引物MT-SNP8扩增序列测序结果峰图，图中箭头所指为其正向扩增第401核苷酸位点为CC基因型；

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例1黄瓜多表皮毛性状连锁分子标记，是通过以下方法获得：

(1)黄瓜多表皮毛性状的获得及遗传分析

黄瓜多表皮毛突变体mt由EMS(甲基磺酸乙酯)诱变北方密刺黄瓜品种‘长春密刺’得到突变体。与野生型植株相比，mt突变体在叶、茎、卷须、花器官和子房表面的表皮毛状体较多。WT和mt杂交F1植株表现出中间表型，表面有中等数量的表皮毛状体。mt突变体的表皮毛状体长度短于野生型，F1的表皮毛状体长度介于双亲之间。显微镜观察发现，mt叶片表皮毛状体的数量、大小、排列和形状与野生型不同。除了表皮毛状体的密度增加和长度减少外，表皮毛状体的一些基底细胞连接在一起。

利用这两个亲本材料配置F₁，F₁代自交产生F₂代。统计146个F₂群体的表型，并用卡方分析法进行验证，F2群体的表型分离符合1:2:1的遗传比。上述分离比表明，黄瓜多表皮毛基因为单基因控制的不完全显性性状。

(2)黄瓜基因组DNA的提取

按常规方法—CTAB法提取亲本，F₁及全部F₂分离群体的叶片总DNA。

(3)利用BSA-seq方法初定位黄瓜多表皮毛基因

利用群体分离法(BSA)从F2分离群体中分别随机选取多表皮毛突变单株或者中间型多表皮毛单株27株和正常表皮毛个体29株，建立多表皮毛或者中间型表皮毛(z)和正常表皮毛(p)的基因池。通过Illumina HiSeq4000平台对以上构建的这些文库进行测序，并产生150bp的配对末端读段，插入片段大小约为350bp。使用BWA和SAM工具软件，将突变体和WT池中的读段分别与“CCMC”共有参考序列进行比对，以调用SNP(单核苷酸多态性)。去除低质量测序reads后，使用2MB窗口大小和10kb增量的滑动窗口分析，计算两个群体的SNP指数，用突变体的SNP指数减去WT突变体的SNP指数得到ΔSNP-index。ΔSNP-index绝对值越大，表示与性状连锁的可能性也越大，同时作出置信区间为60％的阈值线，超过阈值线视为差异显著，认为是候选区域。结合SNP-index曲线与卡方分布的结果，我们确定了潜在的候选区域，为黄瓜6号染色体0-1.3Mb区域。

(4)候选基因的精细定位及连锁标记的开发

利用表皮表皮毛发育正常品种Hazerd与突变亲本mt进行杂交、自交后产生的F₂群体进行候选基因的精细定位。首先对双亲进行全基因组重测序。分析测序数据，在初定位区域内寻找Indel及SNP差异，提取差异位点两侧序列(各400bp)，采用引物设计软件PrimerPremier 5.0进行引物设计，在两个亲本间进行PCR扩增，Indel标记使用6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，SNP标记采用一代Sanger测序进行多态性检测。其中11对引物有多态性(7对Indel标记及4对SNP标记)。用700个F₂群体对11对多态性引物进行进一步筛选，寻找标记基因型与性状表现型的差别，获得标记与多表皮毛基因mt的交换单株。位于基因两侧的多态性标记向交换单株逐渐减少的方向步移，将目标区段缩小至引物MT-SNP-12和MT-SNP-8之间，而标记SF-SNPI重组株为0。用JoinMap 4软件对INDEL标记的结果结合植株表型绘图，结果表明多表皮毛基因mt和标记MT-SNP8紧密连锁。

(5)标记引物MT-SNP8在黄瓜多表皮毛基因与正常表皮毛黄瓜构建的F₂中的分子检测

利用标记引物MT-SNP8在双亲、F1和F2材料中进行PCR扩增测序检测：

引物对如下：

正向引物：5′TATTTGAAAGGAGAGAGATG 3′，如SEQ ID NO:2所示。

反向引物：5′TGATATTTACACTGGCTGTT 3′，如SEQ ID NO:3所示。

PCR扩增反应体系为：PCR扩增反应的总体系为24μl，包括：2×Taq MasterMix12.0μL，ddH2O 9.0μL，正、反向引物各1μL，DNA1.0μL。反应程序为95℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

利用显微镜观察成株期黄瓜子房、雄花与茎上的表皮表皮毛数量，结果表明：对于引物MT-SNP8，在多表皮毛基因亲本和F₂中多表皮毛黄瓜植株都能检测出CC的基因型，而在正常表皮毛亲本检测出AA的基因型，在F1和F2中间型多表皮毛植株中扩增检测出AC的基因型。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种与黄瓜多表皮毛性状相关的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 715

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatttgaaag gagagagatg tttgacaatg cagttaccta aacattcaaa ttcagaaatg 60

agaaaaaaga attcctaata agcatctaca taaagtacct taaaacaaaa tttcacaaga 120

tatgtgtttg ctgggaaaac aaatgttcaa taagatatac caacctgcca agaggaggtt 180

atcgtaggca ctgcaccatg gtttagagca ttaaggtaag actctgttat accaaccaaa 240

attggacctg tcataacagt tgctccaact tgcttaggcc ttgtcctctc aaaaacaaat 300

ttagtaaatg catcaagtcc agacctaaat tcaggcctta gtttatccaa ctgcagaacc 360

acagaatact aagtttgatt aaatttggct tcaaaagaaa caaaaaatgt aaagaaaatc 420

cataagttta agttacttac agatatttga tcaagtcttt ggagatcatt ttcattattc 480

agaggacgca caagagtaaa gcagtctcta tcaggaaaca gtgctctaat tgaatcacga 540

atctggcagt aaatgaacga aattacaaat cagatcatcg atgcaaacaa acatattcaa 600

tttacaacaa caaaatacaa gagaaaatgt tcaaagtgtc ccaaagtcat aaaaagcaga 660

ctcgaagttc tatgttcacg agcaaacaga tagtgaacag ccagtgtaaa tatca 715

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatttgaaag gagagagatg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgatatttac actggctgtt 20

Claims (8)

1.一种与黄瓜多表皮毛性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记是以‘Chinese Long v2’黄瓜基因组数据库中的Chr6:27397366位点前后各400bp的DNA序列为模板设计引物，扩增得出的基因组序列如SEQ ID NO:1所示，自5’端起，在该序列的第401位存在A/C多态性，即SNP位点。

2.根据权利要求1所述的与黄瓜多表皮毛性状相关的SNP分子标记，其特征在于，根据SNP位点的基因型确定黄瓜多表皮毛的有无：AA基因型为正常表皮毛黄瓜，CC基因型为多表皮毛黄瓜，AC基因型为介于多表皮毛和正常表皮毛黄瓜的中间型多表皮毛黄瓜。

3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于，包括正向引物、反向引物，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：

正向引物：5′TATTTGAAAGGAGAGAGATG 3′，如SEQ ID NO:2所示。

反向引物：5′TGATATTTACACTGGCTGTT 3′，如SEQ ID NO:3所示。

4.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的引物对。

5.权利要求1或2所述的SNP分子标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒在黄瓜多表皮毛性状检测中的应用。

6.一种检测黄瓜多表皮毛性状的方法，其特征在于，包括通过对待测黄瓜进行权利要求1或2所述的SNP分子标记的检测，确定所述待测黄瓜的多表皮毛性状。

7.根据权利要求6所述的检测黄瓜多表皮毛性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测黄瓜的基因组DNA；

(2)利用权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒进行PCR扩增，检测其SNP位点的基因型是AA、CC还是AC；

(3)最后根据基因型确定黄瓜的多表皮毛性状。

8.根据权利要求7所述的检测黄瓜多表皮毛性状的方法，其特征在于，AA基因型为正常表皮毛黄瓜，CC基因型为多表皮毛黄瓜，AC基因型为介于多表皮毛和正常表皮毛黄瓜的中间型多表皮毛黄瓜。

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