CN113862392B

CN113862392B - 大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物及其应用

Info

Publication number: CN113862392B
Application number: CN202111346324.7A
Authority: CN
Inventors: 张鲁刚; 张妮南; 薛一花; 吴俊清; 和禹廷; 张亚秀; 张学芬; 刘小愿
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2041-11-15
Also published as: NL2033088B1; CN113862392A

Abstract

本发明公开了大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物及应用，还公开了一种大白菜黄子叶基因克隆和大白菜黄子叶性状鉴定的方法。本发明在第6连锁群上(A06)构建了大白菜黄子叶基因Bryc的分子遗传图谱，得到位于A06连锁群上与Bryc基因连锁的6对双侧SSR标记引物。连锁分析发现Bryc两侧两个最紧密连锁的两对SSR标记，并对该分子标记进行了相关验证应用，该分子标记具有检测方便，扩增稳定，重复性好和准确率高等优点。本发明对大白菜性状鉴定提供了分子标记辅助选择以及对相关的图位克隆提供了有用信息。

Description

大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物及其应用

技术领域

本发明属于农作物育种及生物分子遗传学领域，具体涉及与大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物及其应用。

背景技术

叶片是植物生长发育的光能转换器，叶色突变直接影响植物的光合作用、同时丰富叶片的观赏功能和应用价值，因此叶色突变体的相关研究一直是植物学研究的热点。由于叶色突变性状易于被识别发现，在实际生产中常作为鉴定品种纯度的形态学标记来使用，越来越多的科研工作者和育种家开展了各种叶色突变的研究。如叶色突变不仅在单子叶植物水稻、大麦、小麦和玉米中被大量报道，同时在大豆、棉花、蚕豆、黄瓜、番茄和拟南芥等多种双子叶植物中亦有研究(郭明等，2010)；其中，在水稻上发现了200多个叶色突变体(张向前等，2009；王备芳等，2018)，在模式作物拟南芥(Qin et al.2007；Yu et al.2009)等方面的研究表明，叶色突变通常符合隐性遗传，在拟南芥中发现了27个编码15种叶绿素生物合成酶的核基因，它们的任何异常突变都会导致叶绿素缺乏(Nagata et al.2005)，从而产生黄色突变。此外，环境温度的极端变化也可能产生黄绿色突变体(Liu et al.2007)。

目前十字花科作物有关叶色突变的研究在甘蓝(杨冲,等2014,刘小萍.2017)、羽衣甘蓝(Zhou S,et al.2013)、花椰菜(李梅等2004)、甘蓝型油菜(胡远辉等2004)、芥菜型油菜(李玮等2007，毛虎德等2010)以及小白菜(Zhang K,et al.2020)、乌塌菜(陆晓民,等2015)和大白菜(刘梦洋等2014,Tang XY,et al.2018，Li X,et al.2019)上有相关报道。然而，尚未见到有关子叶颜色突变的报道。

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)是我国广泛栽培的一种蔬菜作物，杂种优势明显。目前大白菜的生产用种90％以上是杂交一代，而大白菜杂交一代主要由自交不亲和系配制，进行杂交种杂种纯度鉴定是大白菜种子销售前的必做工作，传统的成株鉴定虽然鉴定结果可靠，但费工费时间；分子标记鉴定缩短了鉴定时间，但还需要DNA提取、差异引物筛选，PCR扩增等过程；子叶期和苗期标记性状则可在早期直接准确的区分杂交种与母本自交苗，是理想的鉴定方法，其中子叶期标记性状更优越。

随着芸薹属作物全基因组测序的逐步完成(Wang 2011；Liu et al.2014)和分子标记技术的发展，芸薹属作物的许多颜色性状已被广泛定位。Huang et al.(2015,2016)将油菜(Brassica napus L.)花瓣颜色候选基因定位于A01于染色体上。Han et al.(2015)将甘蓝(Brassica oleracea L.)花瓣颜色候选基因定位于C03染色体上。油菜紫色叶候选基因分别位于A02(zhang et al.2016)、A03(wang et al.2014)和A09(Guo et al.2015；Wuet al.2017)染色体上。定位于A09染色体上的CRTISO突变体被证实对大白菜球叶中积累类胡萝卜素起作用(zhang et al.2013)。然而，尚未见到有关白菜黄子叶分子标记基因定位报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种与大白菜黄子叶基因Bryc紧密连锁的SSR分子标记引物，本发明的目的之二还在于应用该SSR分子标记引物，提供一种大白菜黄子叶基因克隆和大白菜黄子叶性状鉴定的方法，通过PCR方法，在分离群体检测Bryc基因的存在，从而淘汰非目标植株，创制新的黄子叶种质材料，大大提高选择的效率，同时利用该标记进一步克隆Bryc基因，研究黄子叶形成的分子机理。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物，所述SSR分子标记引物为以下引物对中的至少一对：SSR280-3-1、SSR06-29、SSR280-21、SSR280-23、SSR280-39、SSR280-42；

其中SSR280-3-1引物对序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

SSR06-29引物对序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

SSR280-21引物对序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

SSR280-23引物对序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

SSR280-39引物对序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；

SSR280-42引物对序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。

进一步，利用该引物可以区别黄子叶与绿子叶大白菜。

进一步，所述大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物中，6个SSR标记分别位于Bryc的两侧，与Bryc的遗传距离分别为0.92cM、0.48cM、0.08cM、0.04cM、0.96cM、0.96cM。

2.上述技术方案中大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物在大白菜黄子叶基因克隆和大白菜黄子叶性状鉴定及辅助育种的应用。

3.一种大白菜黄子叶基因克隆和大白菜黄子叶性状鉴定的方法，所述方法具体包括以下步骤：

a.提取大白菜基因组DNA；

b.用大白菜黄子叶基因Bryc连锁的分子标记引物SSR280-3-1、SSR06-29、SSR280-21、SSR280-23、SSR280-39或/和SSR280-42对大白菜基因组DNA分别进行PCR扩增；

c.再将PCR扩增产物电泳检测。

进一步，大白菜黄子叶基因克隆和大白菜黄子叶性状鉴定的方法中，大白菜黄子叶基因Bryc连锁的分子标记引物SSR280-3-1、SSR06-29、SSR280-21、SSR280-23、SSR280-39和SSR280-42的PCR扩增特异产物的大小分别为192bp、216bp、225bp、144bp、196bp、179bp。

进一步，大白菜黄子叶基因克隆和大白菜黄子叶性状鉴定的方法中，所述PCR扩增的反应体系包括：

10.0μL的PCR反应体系包含0.1μmol DNA模板、0.5μmol正向引物、0.5μmol反向引物、5.0μL 2×Taq Master，最终添加ddH₂O至10.0μL。

进一步，大白菜黄子叶基因克隆和大白菜黄子叶性状鉴定的方法中，所述PCR扩增的反应程序为：PCR反应的热循环如下：94℃5min；34个循环，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒；72℃延伸10分钟，4℃保存。

进一步，大白菜黄子叶基因克隆和大白菜黄子叶性状鉴定的方法中，所述PCR扩增产物电泳检测为质量浓度为12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再银染显色照相统计。

本发明的有益效果在于：本发明首次获得了与大白菜黄子叶基因Bryc最为紧密连锁的分子标记引物，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。具体表现如下：

(1)获得了在第6连锁群(A06)上大白菜黄子叶基因Bryc的分子遗传图谱，且首次获得与Bryc基因紧密连锁的6个SSR标记，分别是SSR280-3-1、SSR06-29、SSR280-21、SSR280-23、SSR280-39和SSR280-42，可在黄子叶大白菜分子标记辅助育种及Bryc基因克隆中发挥重要的作用。

(2)获得了与Bryc紧密连锁的分子标记，并构建了其高密度遗传图谱。在6个SSR标记中位于Bryc两侧的分子标记为，SSR280-23与Bryc连锁紧密，其遗传距离为0.04cM，SSR280-39与Bryc遗传距离为0.96cM，这两个标记能够帮助该基因向推广品种中转移以及与其他抗病、抗逆基因的聚合。

(3)鉴定方便，这6个标记均为共显性标记，具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。用这6个分子标记检测Bryc基因，可以确定Bryc的存在与否及存在的状态，进而快速筛选携有Bryc基因的植株，并用于黄子叶大白菜新种质的选育。同时利用分子标记进行检测时还可以避免环境对品种的影响，提高选择的准确性。

(4)可用于克隆大白黄子叶基因的研究。图位克隆大白菜黄子叶基因Bryc的前提在于获得与Bryc紧密连锁的分子标记。SSR280-23和SSR280-39在所有已知的A06分子标记中是首次报道的位于Bryc两侧并且与之连锁最为紧密标记，这为克隆该基因提供了分子生物学基础和遗传学依据。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1是白菜黄子叶基因Bryc的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离(cM)。

图2是SSR280-23在黄子叶和绿子叶亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：(从左到右)M，50bp DNA ladder；P1是黄子叶亲本；P2是绿子叶亲本，F1是杂交一代，F2是F2分离单株；方框内为特异扩增产物。

图3是SSR280-39在黄子叶和绿子叶亲本及F2代单株中的扩增结果；泳道信息：(从左到右)M，50bp DNA ladder；P1是黄子叶亲本；P2是绿子叶亲本，F1是杂交一代，F2是F2分离单株。方框内为特异扩增产物。

图4是黄子叶亲本材料的子叶(a)和绿黄子叶亲本材料的子叶(b)。

图5-图8依次是引物对SSR280-3-1、SSR06-29、SSR280-21、SSR280-42在黄子叶和绿子叶亲本及F2代单株中的扩增的核酸电泳结果图，标识同前。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点，对本发明的优选实施例进行详细的描述。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

与白菜黄子叶基因Bryc紧密连锁的SSR分子标记引物的研发

(1)群体材料准备

大白菜黄子叶纯系(19YC-2)是由紫心大白菜14S839和橙色大白菜14S162杂交后代中发现并自交育成(其中紫心大白菜14S839和橙色大白菜14S162公开于《园艺学报》，2016,06期:1079页，吴俊清,赵静,秦美玲,任延靖,张华敏,代子卉,郝玲玉,张鲁刚*.大白菜紫心性状遗传规律分析及其基因初步定位[J],1079-1088)，正常绿子叶近等基因系(19GC-2)是大白菜黄子叶纯系(19YC-2)自交过程再选育的近等基因系，如图4所示，其中a为黄子叶亲本材料的子叶，b为绿黄子叶亲本材料的子叶。

以大白菜黄子叶纯系(19YC-2)为父本，正常绿子叶近等基因系(19GC-2)为母本杂交产生的F1群体，然后通过单株自交获得相应的F2群体。

(2)白菜单株基因组总DNA的提取

A、取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶，塞入装有钢珠(钢珠需要由质量分数为75％的酒精清洗过)的2mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；

B、向离心管中加700μL经65℃预热的CTAB提取液(CTAB：2％，Tris-HCl(pH8.0)：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L)，再加入10μL的β-巯基乙醇，迅速混匀；

C、随后将离心管放入65℃烘箱中，中间每间隔5-10min分钟摇一次，温浴45min；

D、取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)的混合物，摇匀15min后，常温下10000r/min离心10min；

E、将上层液相(约700μL)转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液(氯仿：异戊醇＝24：1)，轻轻摇匀10min，常温下10000r/min离心10min；

F、取上清(约500μL)，加入2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下8000r/min离心5min；

G、弃上清，加入500μL质量百分数为75％的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；

H、加入500μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29μL的RNase A(10μg/μl)，混匀后稍离心，37℃保温30min；

I、加入3mol/L的NaAc溶液50μL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；

J、在4℃条件下，8000r/min离心5min，弃上清，加入质量百分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400～500μL的灭菌ddH₂O溶解使用，或加入质量百分数为75％的乙醇-20℃保存备用；

(3)DNA池的构建

用10个绿色子叶亲本“19GC-2”和黄色子叶亲本“19YC-2”分别提取单株DNA，然后分别从10个绿色子叶亲本DNA中取等量DNA混合构建绿子叶DNA混池(GC)，分别从10个黄色子叶亲本DNA中取等量DNA混合构建黄子叶DNA混池(YC)。

(4)SSR序列的获得

用本实验室保存的分布于大白菜10条染色体上的28对核心引物以及以往合成的SSR引物共249对SSR引物筛选与Bryc连锁的多态性标记，进行染色体定位。

(5)SSR分子标记引物设计

为了有效地在目标染色体上定位候选基因，将多个已报道的叶绿素合成相关基因与参考基因组进行比对，最终分别以目标群上的有价值基因作为SSR分析的起始位点。从BRAD上下载目标基因组片段，利用SSRHunter 1.3(Li and Wan 2005)开发SSR标记。根据BRAD中各位点的物理距离，选取多个均匀覆盖相应片段的SSR位点，采用PrimerPremier5.0设计SSR引物。

根据SSR差异位点两端的序列，采用Primer 5.0软件对符合条件的目标序列设计引物。设计引物参数原则：退火温度为50℃～70℃，最佳温度为57℃；引物长度18bp～26bp；产物大小为100bp～300bp；引物(G+C)含量为40％～60％，引物不出现二级结构、发夹结构和二聚体。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，共设计合成了SSR引物142对。

(6)多态性引物筛选和SSR分子标记分析

用黄子叶大白菜单株DNA池(YC)和绿子叶大白菜单株DNA池(GC)作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析。

所述的PCR扩增包括：10.0μL的PCR反应体系包含0.1μmol DNA模板、0.5μmol正向引物、0.5μmol反向引物、5.0μL 2Taq Master(Vazyme)，最终添加ddH₂O至10.0μL。

PCR反应程序为：94℃5分钟；34个循环，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒；72℃延伸10分钟。扩增产物用12％非变性PAGE在50W下分离90分钟，最后银染照相。

选用所有416对引物，将在黄子叶亲本和绿子叶亲本间表现出相同多态性的引物重复分析2次，双亲间存在扩增差异的引物进一步在F₂群体的20株黄子叶单株中检测连锁关系，15株以上黄子叶单株扩增出目标产物视为有连锁关系，用这些引物进一步对F2小群体单株的进行SSR分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型材料与田间对叶球颜色调查统计的结果，利用JoinMap4.0软件构建了大白菜黄子叶基因Bryc的分子遗传连锁图，获得了与Bryc紧密连锁的6个SSR标记。白菜黄子叶基因Bryc的遗传连锁图如图1所示，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离(cM)。

6对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下表1所示：

表1：

实施例2

SSR280-23引物的应用

(一)采用CTAB法提取大白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：

A.取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠(钢珠需要由质量分数为75％的酒精清洗过)的2mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；

B.向离心管中加700μL经65℃预热的CTAB提取液(CTAB：2％，Tris-HCl(pH8.0)：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L)，再加入8μl的β-巯基乙醇，迅速混匀；

C.随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔5-10min分钟摇一次，水浴45min；

D.取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)，摇匀15min后，常温下10000r/min离心10min；

E.将上层液相(约700μL)转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物(氯仿：异戊醇＝24：1)，轻轻摇匀10min，常温下10000r/min离心10min；

F.取上清(约500μL)，加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下8000r/min离心5min；

G.弃上清，加入500μL质量分数为75％的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；

H.加入500μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29μL的RNaseA(10μg/μL)，混匀后离心，37℃保温30min；

I.加入3mol/L NaAc溶液50μL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；

J.在4℃条件下，8000r/min离心5min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400-500μL灭菌的ddH₂O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇-20℃保存备用；

(二)PCR扩增

用黄子叶亲本和绿子叶亲本DNA作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析

①PCR扩增条件：10.0μL的PCR反应体系包含0.1μmol DNA模板、0.5μmol正向引物、0.5μmol反向引物、5.0μL 2Taq Master(Vazyme)，最终添加ddH₂O至10.0μL。

②PCR反应程序为：先94℃预变性5min；34个循环，94℃30秒，55℃30秒，72℃30

秒；72℃延伸10分钟。PCR反应在Bio-Rad S1000 96型PCR仪中进行。

(三)12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)12％非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：

①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板分开。

②装板：将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板两侧对齐，光滑玻璃板下侧突出插入到带有凹槽的橡皮封条中，利用1％的琼脂糖凝胶将磨砂玻璃板与橡皮封条之间的间隙封住，琼脂糖凝胶凝固后待用。

③灌胶：封底之后，取25mL，12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加250μL浓度为10％的过硫酸氨(APS)和25μL的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调至水平，室温下胶板凝固30min。

(2)电泳：

①点样：往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液(中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10cm以上)，将梳子从胶板中轻轻地拔出，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除干净，加入2μL由SSR280-23引物扩增出的PCR扩增产物。

②电泳检测：接通电源，50W电泳约为90min，待二甲苯氰指示剂跑出胶底部，停止电泳。

③卸板：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来，该过程在水中进行，可以减少凝胶的损坏。

(3)银染步骤：

①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5-6s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；

②染色：将胶转入0.1％的硝酸银溶液中震荡染色8-10min；

③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2-3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；

④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液(1.5％NaOH，0.4％甲醛)中显色至条带清楚显示；

⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2-3次；

⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相，然后用保鲜膜封存，4℃可保存数月。

(四)结果判断

核酸电泳结果如图2所示，纯合黄子叶材料扩增出大约144bp的产物、纯合绿子叶材料扩增出大约154bp的产物，杂合绿色子叶材料扩增出共显性的产物。

实施例3

SSR280-39引物的应用

(一)采用CTAB法提取大白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：

C.随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔5－10min分钟摇一次，水浴45min；

J.在4℃条件下，8000r/min离心5min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400－500μL灭菌的ddH₂O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇﹣20℃保存备用；

(二)PCR扩增

用紫色亲本和非紫色亲本DNA作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析

①PCR扩增条件：

10.0μL的PCR反应体系包含0.1μmol DNA模板、0.5μmol正向引物、0.5μmol反向引物、5.0μL 2Taq Master(Vazyme)，最终添加ddH₂O至10.0μL。

②PCR反应程序为：先94℃预变性5min；34个循环，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒；72℃延伸10分钟。PCR反应在Bio-Rad S1000 96型PCR仪中进行。

(三)12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)12％非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：

(2)电泳：

①点样：往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液(中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10cm以上)，将梳子从胶板中轻轻地拔出，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除干净，加入2μL由SSR280-39引物扩增出的PCR扩增产物。

②电泳检测：接通电源，恒压180V电泳检测，时间约为90min，待二甲苯氰跑出胶底部，停止电泳。

(3)银染步骤：

①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5－6s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；

②染色：将胶转入0.1％的硝酸银溶液中震荡染色8-10min；

③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2－3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；

⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2－3次；

(四)结果判断

核酸电泳结果如图3所示，纯合黄子叶材料扩增出大约196bp的产物、纯合绿子叶材料扩增出大约210bp的产物，杂合绿色子叶材料扩增出共显性的产物。

图5-图8依次是引物对SSR280-3-1、SSR06-29、SSR280-21、SSR280-42在黄子叶和绿子叶亲本及F2代单株中的扩增的核酸电泳结果图，PCR方法和标识同前，由电泳图可见分别可以用于大白菜黄子叶性状的鉴定。更进一步可用于辅助育种等应用。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctagcatgaa tcgaaagc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaggcgtaag ataacaag 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcggcttcc agaacaat 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaaaagggc agggataa 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcatcaaaat caagtggcac aag 23

<210> 6

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgattacca atgactgcaa aatactac 28

<210> 7

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accataccgc tttggacttt tag 23

<210> 8

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atttgcttta gttattttct tagtttgc 28

<210> 9

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagtgatgaa gaaagtggtg gaag 24

<210> 10

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacgaaaaag tagcagcacc g 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgaggagacc actgtcaggg ag 22

<210> 12

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgtcgtcta acaataaagt aggcatc 27

Claims

1.一种检测与大白菜黄子叶基因连锁的SSR分子标记的引物组合物，所述引物组合物由引物对SSR280-3-1、SSR06-29、SSR280-21、SSR280-23、SSR280-39和SSR280-42组成，其中SSR280-3-1引物对序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

SSR06-29引物对序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

SSR280-21引物对序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

SSR280-23引物对序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

SSR280-39引物对序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；

SSR280-42引物对序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。