CN114561487A - 一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，涉及一种基于分子标记的经济作物品种鉴别方法，具体涉及一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法。所述InDel分子标记的上游核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述InDel分子标记的下游核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。检测方法包括以下依次进行的步骤：S1：提取待测茶树样本中的总DNA，获得待扩增DNA；S2：使用F1和R1对待扩增DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；S3：对所述扩增产物进行电泳检测。本技术方案在分子生物学领域对大叶种茶树和小叶种茶树进行鉴别，解决了传统的大小叶种茶的鉴别方法繁琐且不准确的技术问题，具有广阔的应用前景。

Description

一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，涉及一种基于分子标记的经济作物品种鉴别方法，具体涉及一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法。

背景技术

茶是世界三大无酒精饮料之一，因其丰富的口感、悦人的香气和较高的保健价值而深受人们的喜爱。我国是茶树主产国之一，截至2020年底，18个主要产茶省(自治区、直辖市)茶园总面积约4747.69万亩，产量在297万吨以上。茶产业已经成为广大丘陵山区脱贫攻坚的支柱产业。叶片是植物最重要的营养器官，其通过光合作用和呼吸作用提供植物生长发育所需要的能量，同时储存有机物和矿质营养。对于茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)而言，叶片还是主要的经济收获物。在我国西南和华南茶区，阿萨姆变种(Camellia sinensis var.Assamica，CSA，又称为大叶种)和中国变种(Camellia sinensisvar.Sinensis，CSS，又称为小叶种)茶树均有广泛栽培。而在江南和江北等茶区，由于冬季漫长且气温较低，导致阿萨姆变种茶树无法适应低温而死亡，因而以栽培中国变种茶树为主。两者无论在品质、形态和抗逆性均具有显著差异，其中最明显的是，阿萨姆变种茶树(乔木、小乔木为主)比中国变种茶树(灌木为主)具有更大的叶面积。然而，造成茶树叶片差异发育的关键突变位点或者调控因子尚未被成功鉴定。目前，对于茶树叶片发育机制的研究仍然较少。An等人通过全基因组重测序和图谱整合技术，以“金萱”和“云茶1号”杂交产生的96份F1代材料为基础构建了一张高密度遗传图谱，并在茶树2号染色体上鉴定到25个可能与叶面积相关的潜在QTL位点。但这些潜在的位点距离进一步的应用还有较大差距。目前，还没有高效快速的分子标记能够快速对阿萨姆变种和中国变种茶树进行准确的鉴定。现有技术通常采用目测以及用工具测量叶片大小的方法。但是人为划分大小叶的范围，该方法及其不准确，这对于茶树品种的鉴定和消费者权益的保护，都是十分不利的。因此，开发能快速对阿萨姆变种和小叶变种鉴定的标记对促进茶树功能基因、分子标记辅助育、茶树亲子关系鉴定和品种权保护都具有重要意义。

发明内容

本发明意在提供一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，以解决传统的大小叶种茶的鉴别方法繁琐且不准确的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，所述InDel分子标记的上游核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述InDel分子标记的下游核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本方案还提供了一种茶树的InDel分子标记，所述InDel分子标记位于舒茶早基因组2号染色体的基因CSS0006562的终止密码子下游135bp处，长度为184bp。

本方案还提供了一种InDel分子标记在鉴别茶树大小叶品种中的应用。

本方案的原理及优点是：本方案与传统的区分大小叶种的方法不同，在分子生物学领域找到了更具有科学性的方法区分大小叶种。本方案利用InDel插入或缺失技术鉴别大小叶种，其中所涉及茶树基因组中一个特异的插入位点，该位点的插入使得大叶茶树和小叶茶树表现不同的基因型。本方案采用的是InDel多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记,其本质仍属于长度多态性标记,可利用便捷的电泳平台进行分型。传统分子标记开发一般只基于一份序列,而InDel标记开发完全基于序列差异,所以开发过程中无多型位点较少。InDel标记准确性高、稳定性好,避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。

在发现本方案的InDel分子标记的过程中，发明人将数百个茶树样品20Tb以上的重测序数据和三代Pacbio测序数据与参考基因组进行比对，进行InDel位点的鉴定。之后，基于选择清除分析鉴定不同茶树群体基因组上的分化区域，进一步利用高通量毛细管电泳技术，对分化区域存在的突变位点设计引物进行基因型验证，在200对引物中，最终发现了一个与叶面积密切相关的Indel标记，进而利用该标记进行大叶种和小叶种的鉴定。该InDel分子标记位于舒茶早基因组2号染色体的基因CSS0006562的终止密码子下游135bp处，长度为184bp，尚无现有技术报道相关InDel分子标记位点。利用该标记进行阿萨姆变种茶树(Camellia sinensis var.Assamica，CSA，又称为大叶种)和中国变种茶树(Camelliasinensis var.Sinensis，CSS，又称为小叶种)的鉴别，对于分子标记辅助育、茶树亲子关系鉴定和品种权保护等具有重要意义。

进一步，用于检测所述InDel分子标记的引物对包括序列如SEQ ID NO.3所示的F1以及序列如SEQ ID NO.4所示的R1。

本方案通过在茶树全基因组中找到差异基因的插入位点，最终通过多次复筛找到一对核心引物鉴定大小叶种，即SEQ ID NO.3所示的F1以及序列如SEQ ID NO.4所示的R1。

进一步，一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，包括以下依次进行的步骤：

S1：提取待测茶树样本中的总DNA，获得待扩增DNA；

S2：使用F1和R1对待扩增DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

S3：对所述扩增产物进行电泳检测。

进一步，在S3中，所述电泳检测为毛细管电泳检测。

本方案选用Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统，该系统具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点，对构建一套快速、精确的InDel分子标记技术起到很大的作用，并缩短了不同茶树品种大小叶鉴定的周期。

进一步，在S3中，电泳检测结果显示仅在700bp DNA marker附近出现条带，则待测茶树样本为纯合的大叶品种；电泳检测结果显示仅在500bp DNA marker附近出现条带，则待测茶树样本为纯合的小叶品种；电泳检测结果显示在700bp和500bp DNA marker附近出现条带，则待测茶树样本为大叶品种和小叶品种的杂合品种。纯合的大叶品种在Indel分子标记处存在184bp的插入。因此，如果电泳结果出现了可识别相差200bp左右两个条带，即可判定该品种为大叶品种和小叶品种的杂合品种。只出现长条带或者只出现段条带，该茶树品种为大叶品种或者小叶品种。

进一步，在S1中，使用CTAB法提取待测茶树样本中的总DNA。CTAB法为提取植物DNA的常规方法，可充分除去杂质，获得完整不受污染的植物总DNA。

进一步，在S2中，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min、30个循环、72℃延伸10min、4℃保存；在30个循环中，每个循环的程序为：94℃变性30s、退火30s、72℃延伸50s；F1和R1的退火温度均为58℃。

进一步，在S2中，PCR扩增的反应体系为：50ng/μL的DNA溶液1μL、10μM的F1 0.5μL、10μM的R1 0.5μL、2×Taq MasterMix酶5μL、双蒸水3μL。

采用上述PCR扩增条件和PCR体系的设置，可以对目的InDel分子标记进行有效扩增，使得目的片段的量得到放大，确保了后续电泳检测的顺利进行。

附图说明

图1为实施例4的182种茶叶的电泳结果(marker位于最右侧，从上至下依次为700bp、600bp和500bp)。

图2为实施例5的45种茶叶的电泳结果。

图3为实施例5的测序结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：鲜叶总DNA的提取

(1)选用的茶树品种见表1(共182种)。

表1：182份茶树品种列表

以所选用茶树品种为材料，采用CTAB法提取总DNA，CTAB提取液的配方如下(称取药品至棕色试剂瓶中，并用纯水定容至200ml，并将PH调至8.0)：CTAB(溴化十六烷基三甲铵)4g、Tris 2.42g、EDTA·Na 1.89g、NaCl 16.38g。将配好后的CTAB溶液放在65℃水浴锅中加热溶解或者在超声仪中溶解，溶解后室温下保存。核酸提取液配方为体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合溶液。

(2)DNA提取具体操作过程是：

①样品收集完成后，取2ml离心管加充分磨碎的茶叶样品粉末100mg，加700μL的DNA/CTAB提取液(提前在65℃水浴锅预热5min)，加10μL的β-巯基乙醇。65℃水浴15min,每隔5min上下轻轻摇匀6-8次。

②加600μL的核酸提取液，12000r/min，离心10min。

③离心后，取上清液500μL加到新的1.5ml的灭过菌的离心管中，再加入等体积(500μL)的异丙醇，上下颠倒混匀6-8次，12000r/min，离心5min。

④离心后弃上清(不要把沉淀倒掉)，加入500μL的70％的无水乙醇，将沉淀吹打起来，再12000r/min，离心5min，弃上清。

⑤重复第四步。

⑥将带有沉淀的离心管放在超型工作台吹干管内的无水乙醇。

⑦加入100μL的无菌水，吹打沉淀，并使沉淀溶解，得到的溶液即为所提的样品DNA。

实施例2：InDel位点的发现和引物的筛选

我们将收集到的20Tb的重测序数据与参考基因组进行比对，鉴定群体基因库中存在的Indel变异位点。然后，将茶树样品根据叶面积和变种类型分为大叶和小叶两组进行选择清除分析。根据选择清除结果，查看分化区域存在的基因以及基因的相关功能，在与植物组织发育相关的基因及其上下游设计引物进行毛细管电泳以验证基因型信息，最终在200对引物中(候选位点)，发现了一个能够快速对大叶和小叶茶树样品进行快速准确鉴定的Indel标记。电泳结果显示，该InDel位点在大叶种和小叶种茶树具有不同的等位基因型，其位于舒茶早基因组2号染色体上，距离基因CSS0006562(染色位置：Chr2：40036201-40036539)终止密码子下游135bp处。测序结果显示，该Indel突变长度为184bp。该Indel位点上游和下游保守序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

5’-TGAAATTCTGGGTCCGTCCTATGTGTAGATCATCAGTGTCGACGCCAGAGAGCGAGTCGCCGGCGAGACTGTCGGTGTTTCAGAAGCTGATACCGTGTGTGGTGGAAGGGAAAGTGAAGGAGAGTTTCGCGGTGGTGAAGAAATCAGAGGACCCTTACGAGGATTTCAAGAGGTCGATGATGGAGATGATTTTGGAGAAGCAGATGTTTGAAGCAGAAGATTTAGAGCAGCTGTTGCGGTGTTTCTTGTCGCTGAATTCGAGACGCTTCCACGGGATGATTGTTGAGGCTTTCACCGAGATTTGGGAGGTTTTGTTTTGTAGAACTTCGACTCACCTACGAGTTTCCAAAGCTCTTTGAGAAGATCATTAAAAAATGTTGTTATTGTTTTACTTTTGATGTAGTTATGGTAAGTTTATTCTACTAATATGTAAGATTATTTGTGTTGACATATGGGTGATATTACATATGTGTATGTTTTTGTA-3’(SEQ ID NO.1)；

5’-TTTCTATAGCTCTCTTTATAATTCACTGTACTGTTAGCAAACCCTGCATGCATTGCCACGAACACTTGAA-3’(SEQ ID NO.2)。

按照上述保守序列，设计引物如下：

F1：5’-TGAAATTCTGGGTCCGTCCTA-3’(SEQ ID NO.3，Tm：58℃)；

R1：5’-TTCAAGTGTTCGTGGCAATGC-3’(SEQ ID NO.4，Tm：58℃)；

实施例3：PCR扩增

反应总体系为10μL，其中50ng/μL的DNA溶液1μL,10μM上下游引物各0.5μL，2×TaqMasterMix酶5μL，ddH₂O 3μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min,30个循环(94℃变性30s，退火30s，72℃延伸50s)，72℃延伸10min，4℃保存，其中退火温度根据每个引物决定。

实施例4：Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统初筛和复筛

仪器配套试剂：主要包含六种试剂，货号分别为：DNF-810-0240，DNF-600-U030，DNF-355-0125，DNF-475-0050，DNF-495-0060,DNF-0006595380，购自美国安捷伦公司，可要求购买和胶匹配的一整套的毛细管试剂，以下均为试剂盒中的配套试剂。

具体试剂配置与操作流程如下：

①试剂的准备：

1)配胶：75mL dsDNA 810Gel(货号：DNF-810-0240,购自美国安捷伦公司，可要求购买和胶匹配的一整套的毛细管试剂，以下均为试剂盒中的试剂)中加4μL的Intercalating Dye(10板的量，货号：DNF-600-U030)，充分混匀。

2)5×930dsDNA Inlet Buffer(10板换一次,货号：DNF-355-0125)，20ml的InletBuffer加超纯水至100ml混匀,在96孔板中每孔加1ml。

3)5×Capillary Conditioning Solution(货号：DNF-475-0050):20ml的Conditioning Solution加超纯水至100ml.放在毛细管的Conditioning管中。

4)Marker：在96孔板里分别加入30μL 35bp-1500bp Marker(货号：DNF-0006595380),每个孔里加入20μL Mineral oil(配套试剂)封住，离心。

5)样品制备：在96孔板中每个孔里加22μL Dilution buffer 1×TE(货号：DNF-495-0060)和3μL PCR产物，最后一个孔加入25μL 35-1500bp Range DNA Ladder,离心避免出现气泡。

②操作步骤：将所配制好的试剂放入仪器指定位置，点击仪器的运行程序。

③结果分析：在对引物进行初筛和复筛的要求标准有以下几点：1)主带清晰，没有多余的杂带，2)多态性值高，3)能够明显区分大小叶品种的条带，选择重复性、稳定性好的引物，最终选取F1和R1作为鉴定大小叶种的核心引物。由Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统分离的条带见附图1。

实施例5：大小叶品种的真实性鉴定

1)供试材料：①选取45份可能为大叶种也可能为小叶种的材料(表2)，其中也有杂交选育的后代，不清楚到底是大叶还是小叶的茶树品种；②选取云选9号(表1中编号17)、佛香1号(表1中编号16)、双江黑大叶(表1中编号18)、舒茶早(表1中编号94)。

表2：45份茶树样品表

2)实验方法：分别对这些茶树鲜叶提取DNA，使用引物F1和R1对这上述材料提取获得的DNA进行PCR扩增，用Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统对PCR产物分析，实验结果参见图2。

3)结果与讨论：

通过对电泳后的条带分析，仅有上面较长条带的即为纯合的大叶品种，仅下面一条较短条带的即为纯合的小叶品种，上下两条带都有的即为杂交选育的后代。但由于单碱基SNP和小Indel位点的存在，在不同的品种中，较大条带或较小条带间也存在不同程度的长度差异。

我们又选取了云选9号(两条带)、佛香(两条带)、双江黑大叶(仅有上面一条带)、舒茶早(仅有下面一条带)进行分析,使用引物F1和R1进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，回收产物送测，由附图的序列比对结果可知(参见图3)，只要有位于上方的条带的均出现了184bp的插入(即上下两条带的长度差为184bp)，出现两条带的品种即认定为杂合的大叶种。在图3中，up代表样品电泳结果中长度较大的条带，down代表样品扩增结果中长度较小的条带；从上之下依次为：云选9号长条带的测序结果、云选9号短条带的测序结果、佛香长条带的测序结果、佛香短条带的测序结果、双江黑大叶的测序结果、舒茶早的测序结果。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 茅台学院

<120> 一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法

<130> 2022.3.16

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 484

<212> DNA

<213> 茶树

<400> 1

tgaaattctg ggtccgtcct atgtgtagat catcagtgtc gacgccagag agcgagtcgc 60

cggcgagact gtcggtgttt cagaagctga taccgtgtgt ggtggaaggg aaagtgaagg 120

agagtttcgc ggtggtgaag aaatcagagg acccttacga ggatttcaag aggtcgatga 180

tggagatgat tttggagaag cagatgtttg aagcagaaga tttagagcag ctgttgcggt 240

gtttcttgtc gctgaattcg agacgcttcc acgggatgat tgttgaggct ttcaccgaga 300

tttgggaggt tttgttttgt agaacttcga ctcacctacg agtttccaaa gctctttgag 360

aagatcatta aaaaatgttg ttattgtttt acttttgatg tagttatggt aagtttattc 420

tactaatatg taagattatt tgtgttgaca tatgggtgat attacatatg tgtatgtttt 480

tgta 484

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> 茶树

<400> 2

tttctatagc tctctttata attcactgta ctgttagcaa accctgcatg cattgccacg 60

aacacttgaa 70

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaaattctg ggtccgtcct a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcaagtgtt cgtggcaatg c 21

Claims (10)

1.一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，其特征在于：所述InDel分子标记的上游核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述InDel分子标记的下游核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，其特征在于：用于检测所述InDel分子标记的引物对包括序列如SEQ ID NO.3所示的F1以及序列如SEQ ID NO.4所示的R1。

3.根据权利要求2所述的一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：

S1：提取待测茶树样本中的总DNA，获得待扩增DNA；

S2：使用F1和R1对待扩增DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

S3：对所述扩增产物进行电泳检测。

4.根据权利要求3所述的一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，其特征在于：在S3中，所述电泳检测为毛细管电泳检测。

5.根据权利要求4所述的一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，其特征在于：在S3中，电泳检测结果显示仅在700bp DNA marker附近出现条带，则待测茶树样本为纯合的大叶品种；电泳检测结果显示仅在500bp DNA marker附近出现条带，则待测茶树样本为纯合的小叶品种；电泳检测结果显示在700bp和500bp DNA marker附近出现条带，则待测茶树样本为大叶品种和小叶品种的杂合品种。

6.根据权利要求5所述的一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，其特征在于：在S1中，使用CTAB法提取待测茶树样本中的总DNA。

7.根据权利要求6所述的一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，其特征在于：在S2中，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min、30个循环、72℃延伸10min、4℃保存；在30个循环中，每个循环的程序为：94℃变性30s、退火30s、72℃延伸50s；F1和R1的退火温度均为58℃。

8.根据权利要求7所述的一种利用InDel分子标记鉴别茶树大小叶品种的方法，其特征在于：在S2中，PCR扩增的反应体系为：50ng/μL的DNA溶液1μL、10μM的F1 0.5μL、10μM的R10.5μL、2×Taq MasterMix酶5μL、双蒸水3μL。

9.一种茶树的InDel分子标记，其特征在于：所述InDel分子标记位于舒茶早基因组2号染色体的基因CSS0006562的终止密码子下游135bp处，长度为184bp。

10.根据权利要求9所述的InDel分子标记在鉴别茶树大小叶品种中的应用。

Images