CN110669866A - 用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记及其组合与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记及其组合与应用。所述InDel标记包括InDel1和InDel2，本发明利用InDel指纹图谱鉴别四种紫色茶树品种紫嫣、紫仙、紫红和紫娟，在茶树全基因组中选取30对InDel引物进行多态性筛选，鉴定流程主要包括茶树总DNA提取、引物设计、PCR扩增、等位基因多态性统计，最终确立了两对InDel引物(SEQ ID NO：5‑8)作为品种鉴定的核心引物，能有效地将四种紫色茶树品种完全区分开，不仅有利于对紫色茶树品种的保护和推广，同时，为市场上这四种容易混淆的紫茶品种提供了简单、快速、准确、高效的鉴别方法。

Description

用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记及其组合与应用

技术领域

本发明属于分子生物学及植物遗传育种领域，具体地说，涉及用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记及其组合与应用。

背景技术

紫茶，是茶叶中的稀有品种。茶圣陆羽曾说过：“茶，紫者上”。紫茶之所以呈现紫色，主要因为其中的花青素含量丰富。研究表明，花青素作为一种强有力的抗氧化剂，不仅能够保护人体免受自由基的有害物质的损伤，还能够增强血管弹性，改善循环系统和增进皮肤的光滑度，抑制炎症和过敏，改善关节的柔韧性。花青素的抗氧化性能力比维生素E高50倍，比维生素C高20倍。同时花色苷在热水中溶解性好，可通过饮茶有效摄取。因此以紫色为特点、富含天然花青素的茶树品种和以其作为原料的茶产品具有极大的市场推广前景。目前市场上较为常见的紫茶品种有紫嫣、紫仙、紫红和紫娟。“紫嫣”为四川农业大学茶学系和四川一枝春茶业有限公司从乐山市沐川县李家山的野生茶树资源中经单株育种法选育而成的品种。“紫仙”为四川省沐川县李家山的野生茶树。“紫红”是广西省一地方品种。“紫娟”是云南省茶叶研究所科技人员从云南大叶群体国家级茶树良种－－勐海大叶茶中单株培育而成，具有紫芽、紫叶、紫茎的特点。当前茶树育苗技术简单、市场准入门槛低、品种繁多杂乱，存在以假乱真、品种不纯的现象。以不同的紫色茶叶制作出的名优茶，在品质和售价上也不尽相同，消费者仅凭肉眼很难从外观形态上辨别真伪。另外，由于茶树可采用“短穗扦插”技术进行快速繁殖，优异品种一旦流入市场，难以控制其传播。随着国家对植物新品种保护制度不断的完善，越来越多的育种者对新品种权保护的意识增强，积极申请植物新品种保护。因此准确的品种鉴定手段对于保护育种者的权益非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记及其组合与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记1(InDel1)，所述紫色茶树品种选自紫嫣、紫仙、紫红、紫娟；

所述InDel标记1的左、右侧翼序列分别如SEQ ID NO：1、2所示。

优选地，用于扩增所述InDel标记1的引物序列如SEQ ID NO：5-6所示。

第二方面，本发明提供用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记2(InDel2)，所述紫色茶树品种选自紫嫣、紫仙、紫红、紫娟；

所述InDel标记2的左、右侧翼序列分别如SEQ ID NO：3、4所示。

优选地，用于扩增所述InDel标记2的引物序列如SEQ ID NO：7-8所示。

第三方面，本发明提供用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记组合，该组合包括所述InDel标记1和InDel标记2。

第四方面，本发明提供用于扩增所述InDel标记1的引物，引物序列如SEQ ID NO：5-6所示。

第五方面，本发明提供用于扩增所述InDel标记2的引物，引物序列如SEQ ID NO：7-8所示。

第六方面，本发明提供用于扩增所述InDel标记组合的引物，用于扩增所述InDel标记1的引物序列如SEQ ID NO：5-6所示，用于扩增所述InDel标记2的引物序列如SEQ IDNO：7-8所示。

第七方面，本发明提供含有上述引物的检测试剂或试剂盒。

第八方面，本发明提供所述InDel标记1、InDel标记2，所述InDel标记组合，所述引物或者含有所述引物的检测试剂或试剂盒在鉴别或选育紫色茶树品种中的应用；

所述紫色茶树品种选自紫嫣、紫仙、紫红、紫娟。

前述的应用，包括以下步骤：

1)提取待测样品(如茶树叶片)中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO：5-6所示引物和/或SEQ ID NO：7-8所示引物进行PCR扩增；

3)分析PCR产物。

优选地，步骤2)进行PCR扩增时所用退火温度为55-60℃(优选60℃)。

进一步地，PCR反应体系为：DNA模板1μL，10μM上、下游引物各0.5μL，2×TaqPlusMaster Mix(Dye)5μL，ddH₂O3μL。其中，Taq Plus Master Mix来自北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW2849M。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

优选地，步骤3)通过毛细管电泳检测PCR产物。如果SEQ ID NO：5-6、SEQ ID NO：7-8所示引物扩增出的待测茶样的多态性条带大小分别为282±3bp和201±3bp，则待测茶样为紫嫣；如果SEQ ID NO：5-6、SEQ ID NO：7-8所示引物扩增出的待测茶样的多态性条带大小分别为272±3bp和201±3bp，则待测茶样为紫仙；如果SEQ ID NO：5-6、SEQ ID NO：7-8所示引物扩增出的待测茶样的多态性条带大小分别为290±3bp和220±3bp，则待测茶样为紫红；如果SEQ ID NO：5-6所示引物扩增出的待测茶样的多态性条带大小为285±3bp，SEQ IDNO：7-8所示引物扩增出的待测茶样的多态性条带大小分别为202±3bp和211±3bp，则待测茶样为紫娟。如果扩增出的茶样的多态性带的大小不属于上述的所有带型，可基本确定该茶样不是四种紫茶品种中的任一种。

第九方面，本发明提供所述InDel标记1、InDel标记2，所述InDel标记组合，所述引物或者含有所述引物的检测试剂或试剂盒在茶树分子标记辅助育种中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供的InDel标记是建立在茶树全基因组上，与EST-SSR相比，数量多和双等位基因位点的特点。通过大量的引物筛选，最终确定两个核心标记用于对紫色茶树品种的鉴定。

(二)本发明采用InDel指纹图谱技术，该技术是近年来随着分子生物学发展而迅速发展起来的一种应用性遗传种质分析方法，具有稳定性好、操作简单，准确率高的特点，为不同茶树优良品种鉴定提供了精确、快速、简单、高效的方法。

(三)本发明所选用的茶树材料不受季节、环境和测试时间的限制，可以对品种生长任何时期内的任意器官，或者已储存一段时间的干茶进行DNA提取，均不影响其鉴定结果。

(四)本发明在引物筛选所选用的是Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统，该系统具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点。

附图说明

图1为本发明实施例1提取的四种紫色茶树品种鲜叶DNA琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明实施例4提供的两对核心引物对四种紫色茶树品种PCR产物的Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳胶图。

图3A～图3D为本发明实施例4提供的两对核心引物分别对四种紫色茶树品种紫嫣、紫仙、紫红和紫娟三次重复的毛细管电泳峰图。

具体实施方式

本发明提供一种利用InDel指纹图谱鉴别四种紫色茶树品种的方法，涉及茶树基因组中两个特异的InDel位点，InDel1对应的茶树基因组中特异的InDel位点左侧保守序列如SEQ ID NO：1所示、右侧序列如SEQ ID NO：2所示，InDel2对应的茶树基因组中特异的InDel位点左侧保守序列如SEQ ID NO：3所示、右侧序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，根据InDel标记的引物设计原则设计如下引物：

用于扩增InDel1的引物(SEQ ID NO：5-6)：

上游：5′-AGAATGATGTTCGTGTGGCCT-3′，Tm：59.5℃；

下游：5′-TGGCATTCATAGCGTGTTGTT-3′，Tm：57.5℃。

用于扩增InDel2的引物(SEQ ID NO：7-8)：

上游：5′-ACTGAAATCAGGCCAAAATC-3′，Tm：54.3℃；

下游：5′-ATCATAGCAGACCAACGACT-3′，Tm：56.4℃。

更进一步地，所述引物的筛选步骤如下：茶树总DNA的提取，根据茶树全基因组序列进行InDel位点的选择和引物的设计筛选，PCR扩增和Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统初筛，根据电泳结果筛选出核心引物。

再进一步地，所述茶树总DNA提取是用改良的CTAB方法以鲜叶为材料进行提取。所述茶树全基因组序列进行InDel位点的选择和引物设计筛选。根据如下原则成功设计出30对引物，其中InDel引物筛选的原则如下：

①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp-380bp左右；

②GC含量为45％-55％，引物序列中避免出现三个或者四个连续碱基；

③退火温度50℃-60℃，最好在58℃左右，上、下游引物Tm值相差不大于4℃；

④引物3′端避免出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结构。

再进一步地，PCR扩增和毛细管电泳初筛，具体是将PCR产物吸取3μL通过FragmentAnalyzer^TM全自动毛细管电泳系统进行初筛，通过与目的片段比对进行引物的初筛，选取扩增率高、条带亮，峰型好的PCR产物通过Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统进行复筛，能够精确地反映等位位点间的差异，筛选出多态性高的引物。

上述利用InDel指纹图谱鉴别市场上四种紫色茶树品种的方法，利用InDel指纹图谱技术将四种紫茶区分开来，在DNA水平上给四种紫茶品种以独特的指纹身份，从而达到保护紫茶优良品种权的目的，将有利于对紫茶优良品种的保护和推广，为市场上出售各种紫色茶树的真伪鉴别提供了一种简单、快速、准确、高效的检测方法。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1茶鲜叶总DNA的提取

1、实验材料及试剂

茶树品种：紫嫣、紫仙、紫红和紫娟。由安徽农业大学皖中试验站茶树种质资源圃提供(合肥，安徽，31°49′21″N，117°13′18″E)。

DNA提取采用试剂盒EZgeneTM CP Plant Miniprep Kit，货号GD2621-02。

2、实验方法

以所选用茶树品种为材料，采用CTAB法提取总DNA，具体操作过程如下：

①称取0.1g茶树叶片放入预冷的研钵中，迅速加入液氮研磨，直至样品材料成粉末状。加700μL CTAB提取液(提前预热至65℃)，加6μL β-巯基乙醇，65℃水浴15min，每隔5min上下摇匀几次。

②加600μL氯仿：异戊醇(24∶1，v/v)，12000rpm离心10min。取上清液300μL于1.5mL离心管中，加150μL CP2和300μL无水乙醇，上下颠倒几次，混匀后转至2mL制备管，12000rpm离心1min。弃滤液。

③加650μL DNA Wash Buffer(确认已加入乙醇)，12000rpm离心1min，弃滤液。再重复一遍。空柱13000rpm离心1min。将制备管置于通风橱吹干残留的乙醇。

④将制备管置于1.5mL离心管中，在制备膜中央滴加100μL Elution Buffer(65℃预热)，室温静置2min，12000rpm离心1min，洗脱DNA。将DNA产物再重复洗脱一次可提高DNA收集效率。

⑤利用核酸定量仪测定DNA含量，并用1.2％琼脂糖电泳。电泳结果见图1。实施例2InDel位点的选择和引物的初筛

根据如下原则成功设计出30对引物(由通用生物系统(安徽)有限公司合成)，其中InDel引物筛选的原则如下：

①引物的长度为18-22bp，目的片段在250bp-380bp之间；

②GC含量为40％-60％，引物序列中避免出现三个或者四个连续碱基；

③退火温度50℃-60℃，最好在58℃左右，上、下游引物Tm值相差不大于4℃；

④引物3′端避免出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结构。

实施例3引物初筛

PCR扩增和Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统初筛，具体如下：

反应总体系为10μL，其中S0ng/μL的DNA溶液1μL，10μM上下游引物各0.5μL，2×TaqPlus Master Mix(Dye)5μL，ddH₂O3μL。离心后加入20μLMineral oil封住。其中，Taq PlusMaster Mix来自北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW2849M。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

PCR扩增和毛细管电泳初筛，具体是将PCR产物吸取2μL通过Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统进行初筛，通过与目的片段比对进行引物的初筛。选取扩增率高、条带亮，峰型好的PCR产物通过Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统进行复筛，能够精确的反映等位位点间的差异，筛选出多态性高的引物。

实施例4引物复筛

利用Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统进行复筛。所用试剂均来自DNF-90035-500bp试剂盒。

具体方法如下：

①Gel：40mL dsDNA 800Separation Gel中加2μL的Inter calating Dye，充分混匀。

②930dsDNA Inter Buffer：将5×Inter Buffer稀释5倍。

③Capillary conditioning solution：将5×Capillary conditioningsolution稀释5倍，在96孔板里分别加入1mL Capillary conditioning solution，避免出现气泡。

④Marker：在96孔板里分别加入30μL 35bp-500bp Markers，各孔加入20μLMineral oil封住，离心。

⑤样品制备：在96孔板中每个孔里加20μL Dilution buffer和2μL PCR产物，最后一个孔加入24μL 35-500bp Range DNALadder，离心避免出现气泡。

⑥操作步骤：将所配制好的试剂放入仪器指定位置，点击仪器运行程序。

⑦数据记录和结果分析：每条带中选取峰值最高的带，记录具体数值大小。

引物复筛的标准如下：1)主带清晰，没有多余杂带；2)多态性值高，等位位点多；3)在两个相近的等位位点之间条带相差大小要大于4bp；4)对符合前三点的引物进行三次重复性扩增，选择重复性、稳定性好的引物，由于Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统最低分辨为2bp，因此引物对紫茶品种所扩增出的条带所允许误差范围是±3bp，最终选择其中两个作为核心引物，能够准确、快速地区分四种紫色茶树品种(表1)，

四种紫色茶树品种PCR产物的Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳胶图见图2。引物三次重复毛细管电泳指纹图谱见图3A～图3D。

表1引物在四种紫色茶树品种扩增出的基因型

注：等位基因以不同的峰值表示。

实施例5四种紫色茶树品种的真实性鉴定

供试材料：四份未被区分的紫嫣、紫仙、紫红和紫娟茶树品种，分别编码为茶样A、B、C、D。

1、试验方法：①分别对四份茶样提取DNA；②两对核心引物对这四份DNA进行PCR扩增；③用Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统对PCR产物分析。

2、结果与讨论：通过对四种紫茶品种峰值的比对，分别统计四份茶样出现的特异性等位位点，由于Fragment Analyzer TM全自动毛细管电泳系统最低分辨为2bp，因此引物对紫茶品种所扩增出的条带误差在±3bp。如果SEQ ID NO：5-6、SEQ ID NO：7-8所示引物扩增出的待测茶样的多态性条带大小分别为282±3bp和201±3bp，则待测茶样为紫嫣；如果SEQ ID NO：5-6、SEQ ID NO：7-8所示引物扩增出的待测茶样的多态性条带大小分别为272±3bp和201±3bp，则待测茶样为紫仙；如果SEQ ID NO：5-6、SEQ ID NO：7-8所示引物扩增出的待测茶样的多态性条带大小分别为290±3bp和220±3bp，则待测茶样为紫红；如果SEQID NO：5-6所示引物扩增出的待测茶样的多态性条带大小为285±3bp，SEQ ID NO：7-8所示引物扩增出的待测茶样的多态性条带大小分别为202±3bp和211±3bp，则待测茶样为紫娟。如果扩增出的茶样的多态性带的大小不属于上述的所有带型，可基本确定该茶样不是四种紫茶品种中的任一种。

本发明提供一种利用InDel指纹图谱鉴别四种紫色茶树品种紫嫣、紫仙、紫红和紫娟的方法，在茶树全基因组中选取30对InDel引物进行多态性筛选，鉴定流程主要包括茶树总DNA提取、引物设计、PCR扩增、等位基因多态性统计，最终确立了两对InDel引物作为品种鉴定的核心引物，能有效地将四种紫色茶树品种完全区分开，不仅有利于对紫色茶树品种的保护和推广，同时，为市场上这四种容易混淆的紫茶品种提供了简单、快速、准确、高效的鉴别方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记及其组合与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 450

<212> DNA

<213> 茶(Camellia sinensis)

<400> 1

tgtaaggacc tgaatggaaa taaactttca tattcaaagt tatatataca aacacttatg 60

tccataaaac acatatatac aagaaaaaac acaagttagg gaattaaatt ccattatcga 120

aaacagtatt aacaaaagtc tcaaacattc ttaacactta gcaacatcaa aagggtggat 180

ttgaactacc caaaagcctt gacaaattca ggttcggaac ctctctatga ggcacaatag 240

ctggcttgac aaagcaaggg ttcgggtcgg cgccactagc tttggtccag tgctcggtca 300

cctacatata tataacaaat tgtgagctaa aacccagtga ataacaaatg tgtaaagagg 360

ttaagaatga tgttcgtgtg gcctttgaaa caattgattt caatcaatat cctttgtcaa 420

tcaatcgttc aattcaatca atcattttca 450

<210> 2

<211> 450

<212> DNA

<213> 茶(Camellia sinensis)

<400> 2

atcatattca tattcatata ggccatacgt ggtacatcca atagcaacaa tacaatacaa 60

taggtcttaa agaccgaaca atcaattgat ggccatcaaa caataacaat agttctaaga 120

tttggaactg acagagattt ctgtaacaat aacgatatca acaataacaa taacaacacg 180

ctatgaatgc catgaataca attcaaaaga ggatcattat tcaatcgata gaaagtaacc 240

atttagaaac aatataattt atcattcaca aaataaatac aatttgaata tatctttaca 300

acattgttac tcacagtggg cttctcgata cacgtattat tggttcggcg tccgacctaa 360

caaacaaatt cgagcacaat aattcaatga cattcatgtc gctagttaat tctattcgat 420

tcgattgtta cttactcaat aactattcat 450

<210> 3

<211> 150

<212> DNA

<213> 茶(Camellia sinensis)

<400> 3

cgaagtcgat gaagggccca gatgattcga actgaaatca ggccaaaatc taatgacgcg 60

tcgcttcttt tcgcctcacg cttcatcgcc taagcctcgc gtctccatcg cctcaccatt 120

tcacctcgcc tcgccttaag gtgtgtgaag 150

<210> 4

<211> 150

<212> DNA

<213> 茶(Camellia sinensis)

<400> 4

cgcttagcgc ttaggctcgc ctctgataac agtggtatag aatgaggaga gtcgttggtc 60

tgctatgatg tcccctgtct ctactgaccg ctcagtatta ctgtctgctc ctcgagatgg 120

cctcagcctg actcccatcc cttcgtctgc 150

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agaatgatgt tcgtgtggcc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggcattcat agcgtgttgt t 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actgaaatca ggccaaaatc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcatagcag accaacgact 20

Claims (10)

1.用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记1，其特征在于，所述紫色茶树品种选自紫嫣、紫仙、紫红、紫娟；

所述InDel标记1的左、右侧翼序列分别如SEQ ID NO：1、2所示；

优选地，用于扩增所述InDel标记1的引物序列如SEQ ID NO：5-6所示。

2.用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记2，其特征在于，所述紫色茶树品种选自紫嫣、紫仙、紫红、紫娟；

所述InDel标记2的左、右侧翼序列分别如SEQ ID NO：3、4所示；

优选地，用于扩增所述InDel标记2的引物序列如SEQ ID NO：7-8所示。

3.用于鉴别紫色茶树品种的InDel标记组合，其特征在于，包括权利要求1所述的InDel标记1和权利要求2所述的InDel标记2。

4.用于扩增权利要求1所述InDel标记1的引物，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO：5-6所示。

5.用于扩增权利要求2所述InDel标记2的引物，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO：7-8所示。

6.用于扩增权利要求3所述InDel标记组合的引物，其特征在于，用于扩增所述InDel标记1的引物序列如SEQ ID NO：5-6所示，用于扩增所述InDel标记2的引物序列如SEQ ID NO：7-8所示。

7.含有权利要求4-6任一项所述引物的检测试剂或试剂盒。

8.权利要求1所述的InDel标记1、权利要求2所述的InDel标记2、权利要求3所述InDel标记组合、权利要求4-6任一项所述引物或者权利要求7所述检测试剂或试剂盒在鉴别或选育紫色茶树品种中的应用；

所述紫色茶树品种选自紫嫣、紫仙、紫红、紫娟。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求3和/或权利要求4所述引物进行PCR扩增；

3)分析PCR产物；

优选地，步骤2)进行PCR扩增时所用退火温度为55-60℃；

优选地，步骤3)通过毛细管电泳检测PCR产物。

10.权利要求1所述的InDel标记1、权利要求2所述的InDel标记2、权利要求3所述InDel标记组合、权利要求4-6任一项所述引物或者权利要求7所述检测试剂或试剂盒在茶树分子标记辅助育种中的应用。

Images