KR102669820B1 - 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 참당귀의 원산지를 판별하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 참당귀의 원산지 판별 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트는, 높은 정확도로 참당귀가 국산 참당귀인지, 중국산 참당귀인지 판별할 수 있다.
Description
본 발명은 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 참당귀의 원산지를 판별하는 방법에 관한 것이다.
참당귀(Angelica gigas)는 쌍떡잎식물 이판화군 산형화목 산형과의 숙근초로서, 산골짜기 습유한 계곡이나 냇가 근처에서 자라나며, 굵은 뿌리와 함께 분지된 뿌리를 가진다. 참당귀의 뿌리는 크고 향기가 강하며, 줄기는 곧게 서고, 높이 1 ~ 2 m 까지 자라나며, 지상부 전체에 자줏빛이 도는 형태를 가진다. 이러한 참당귀는 혈압 강하 작용을 하고, 월경불순 및 월경정지 등의 개선, 산후 진정, 두통 및 복통 등의 개선에 효과적이며, 데커신(decursin), 데커시놀(decursinol), 움벨리페론(umbelliferon), 베타시토스테롤(β-sitosterol) 등 유용 성분을 다량 함유하고 있다.
이에, 참당귀를 다양한 질환의 예방, 치료 또는 개선에 활용하고자 하는 시도들이 활발하나, 최근 참당귀의 수요 증가로 인해, 저가의 중국산 참당귀가 불법 또는 변칙 유통되어 혼합 사용됨에 따라, 품질 및 효능이 기대에 미치지 못하는 문제가 발생되고 있는 상황이다.
따라서, 국산 참당귀와 중국산 참당귀의 판별이 필수적인 상황이나, 국산 참당귀와 중국산 참당귀의 경우, 외형 및 내부 형태학적 형질에는 차이가 크지 않아, 육안으로 원산지를 판별하는 데에는 어려움이 있는 실정이다.
이에 따라, 참당귀의 원산지를 정확히 판단하기 위하여, 성분 분석 등을 이용한 원산지 판별 방법에 대한 연구가 활발하다. 일례로, 대한민국 등록특허 제10-0806539호에서는, 기체가스크로마토그래피(Gas Chromatography)로 시료를 분석하고, 데커신, 데커시놀 등의 검출 조건을 분석함으로써, 당귀의 원산지를 판별하는 방법에 대해 개시하고 있다. 그러나, 기체크로마토그래피 등을 이용한 성분 분석은 압력, 온도, 칼럼 등의 분석 조건과 시료의 품질 등에 의해, 정확도에 편차가 발생되는 문제가 있었다.
이에, 상기와 같은, 종래 기술의 한계를 극복하고자, 본 출원인은 외부 조건에 의한 영향이 적으면서도 안정한 물질인 유전자를 이용하여, 참당귀의 원산지를 판별할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 판별 방법을 확립함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 간단하면서도 높은 정확도로 참당귀의 원산지를 판별할 수 있는, 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 판별 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은 상기된 바와 같은 기술적 과제로 한정되지 않으며, 이하의 설명으로부터 또 다른 기술적 과제가 도출될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제1 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제2 프라이머 세트;를 포함하는, 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 참당귀의 원산지 판별은 국산 참당귀(Angelica gigas) 및 중국산 참당귀(Angelica gigas)를 판별할 수 있다.
상기 제1 프라이머 세트는 국산 참당귀(Angelica gigas) 판별용일 수 있다.
상기 제2 프라이머 세트는 중국산 참당귀(Angelica gigas) 판별용일 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은 정방향 프라이머이고, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은 역방향 프라이머일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 상기의 프라이머 세트를 포함하는, 참당귀의 원산지 판별용 키트를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 상기의 프라이머 세트를 이용한 참당귀의 원산지 판별 방법을 제공한다.
상기 참당귀의 원산지 판별 방법은 참당귀로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제 1 항의 프라이머 세트를 이용하여, 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR의 증폭 산물을 전기영동하는 단계; 및 상기 전기영동된 증폭 산물의 크기를 측정하여 참당귀의 원산지를 판별하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 PCR은 하기 중 하나의 조건을 포함할 수 있다.
90 ~ 100 ℃에서 3 ~ 7분 동안 초기 변성(initial denaturation);
90 ~ 100 ℃에서 15 ~ 25초 동안 변성(denaturation);
35 ~ 50 ℃에서 5 ~ 20초 동안 결합(annealing);
70 ~ 75 ℃에서 25 ~ 35초 동안 신장(extension); 및
70 ~ 75 ℃에서 3 ~ 7분 동안 최종신장(elongation).
상기 결합은 국산 참당귀(Angelica gigas)는 35 ~ 45 ℃에서 실시하고, 중국산 참당귀(Angelica gigas)는 40 ~ 50 ℃에서 실시하는 것을 포함할 수 있다.
상기 참당귀의 원산지를 판별하는 단계는, PCR의 증폭 산물의 크기가, 470 ~ 570 bp 인 경우 국산 참당귀(Angelica gigas)로 판단하고, 125 ~ 225 bp인 경우 중국산 참당귀(Angelica gigas) 로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명에 따르는, 프라이머 세트는, 간단하면서도 높은 정확도로, 참당귀의 원산지를 판별할 수 있다.
특히, 본 발명에 따르면, 저가이면서 품질이 낮은 중국산 참당귀가, 상대적으로 고가이며 품질이 우수한 국산 참당귀로 불법 또는 변칙 유통되는 문제를 방지할 수 있으므로, 국산 참당귀의 가격을 안정화하면서도 소비자의 피해를 방지할 수 있다.
도 1은 참당귀의 원산지 판별용 프라이머를 이용한 PCR 결과를 도시한 도면이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, "프라이머"는 검출하고자 하는 유전자를 포함하는 유전자 시료의 증폭에 통상적으로 사용되는 일반적인 시발체를 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, "상보적인 서열(complementary sequence)"은 특정서열과 서로 염기쌍을 이루어 이중가닥 구조를 형성할 수 있는 염기배열을 의미한다.
이하에서 본 발명을 구체적으로 설명하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제1 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제2 프라이머 세트;를 포함하는, 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 실시예의 상기 참당귀의 원산지를 판별하는 것은, 국산 참당귀(Angelica gigas) 및 중국산 참당귀(Angelica gigas)를 판별하는 것을 의미할 수 있다.
구체적으로, 본 실시예의 제1 프라이머 세트는 국산 참당귀(Angelica gigas) 판별용일 수 있으며, 상기 제2 프라이머 세트는 중국산 참당귀(Angelica gigas) 판별용일 수 있다.
이에 따라, 본 실시예의 프라이머 세트는 국산 참당귀(Angelica gigas) 및 중국산 참당귀(Angelica gigas)를 판별할 수 있으며, 특히, 국산 참당귀(Angelica gigas) 및 중국산 참당귀(Angelica gigas)가 혼합된 혼합물에서, 어떠한 원산지에서 재배된 참당귀가 혼합되어 있는지 여부를 확인하는데 활용될 수 있다.
구체적으로, 본 실시예의 프라이머 세트는 국산 참당귀(Angelica gigas) 등을 비롯하여 원산지가 상이한 복수의 참당귀가 혼합된 혼합물에서, 혼합물 총 중량 기준으로 0.5 중량%의 국산 참당귀(Angelica gigas)에 대해서 국산 참당귀(Angelica gigas)의 존재를 판별할 수 있으므로, 높은 정확도로 국산 참당귀를 판별해낼 수 있는 것으로 확인이 되었으며, 아주 미량의 국산 참당귀가 혼합된 경우에도 높은 정확도로 국산 참당귀를 판별해낼 수 있다. 본 발명의 정확도 분석은 예컨대, real-time pcr을 이용한 정시량 분석 시 혼입 함량을 확인할 수 있다.
본 실시예의 프라이머는, SCAR marker(sequence-characterized amplified region marker)일 수 있다. 상기 프라이머는, RAPD(random amplified polymorphic DNA), ISSR(inter simple sequence repeat), SRAP(sequence-related amplified polymorphism)를 통해 확보된 다형성 밴드를 이용하여 제작된 것일 수 있다.
본 실시예의 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트는, 하기 표 1과 같은, 서열번호 1의 서열 내지 서열번호 4의 서열로 구성될 수 있다.
본 실시예에 따르는, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은 정방향 프라이머이고, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은 역방향 프라이머일 수 있다.
본 발명에서는 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트를 포함하는 키트를 제공한다.
본 실시예에 따르는, 상기 참당귀의 원산지 판별용 키트는 상기 프라이머 세트 이외의 공지의 키트 구성 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트 구성 요소는 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자, dNTPs 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 실시예에서는 상기 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 상기 프라이머 세트와 함께, 공지의 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자, dNTPs 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 상기 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트를 이용한 참당귀의 원산지 판별 방법을 제공한다.
본 실시예에 따르는 참당귀의 원산지 판별 방법은 참당귀로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제 1 항의 프라이머 세트를 이용하여, 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR의 증폭 산물을 전기영동하는 단계; 및 상기 전기영동된 증폭 산물의 크기를 측정하여 참당귀의 원산지를 판별하는 단계;를 포함한다.
상기 참당귀로부터 DNA를 추출하는 단계는, 통상적으로 공지된 방법에 의해 실시될 수 있으며, 예를 들어, DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실시될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계는, 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 상기된 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트를 이용하여, 실시될 수 있다.
구체적으로, 상기 PCR은 90 ~ 100 ℃에서 3 ~ 7분 동안 초기 변성(initial denaturation); 90 ~ 100 ℃에서 15 ~ 25초 동안 변성(denaturation); 35 ~ 50 ℃에서 5 ~ 20초 동안 결합(annealing); 70 ~ 75 ℃에서 25 ~ 35초 동안 신장(extension); 및 70 ~ 75 ℃에서 3 ~ 7분 동안 최종신장(elongation); 조건으로 실시될 수 있으며, 이 경우, 효과적으로 유전자 증폭을 실시할 수 있다.
더 구체적으로, 상기 PCR은 94 ~ 96 ℃에서 4 ~ 6 분 동안 초기 변성(initial denaturation); 94 ~ 96 ℃에서 19 ~ 21 초 동안 변성(denaturation); 40 ~ 43 ℃에서 9 ~ 11 초 동안 결합(annealing); 71 ~ 73 ℃에서 29 ~ 31 초 동안 신장(extension); 및 71 ~ 73 ℃에서 4 ~ 6 분 동안 최종신장(elongation); 조건으로 실시될 수 있으며, 이 경우, 더욱 효과적으로 유전자 증폭을 실시할 수 있다.
상기 결합은, 국산 참당귀(Angelica gigas)를 판별할 경우에는 35 ~ 45 ℃, 구체적으로는 39 ~ 41 ℃에서 실시될 수 있으며, 중국산 참당귀(Angelica gigas)를 판별할 경우에는 40 ~ 50 ℃, 구체적으로는 42 ~ 44 ℃에서 실시될 수 있다.
이때, 상기 초기 변성은 적어도 1 회 이상 반복 실시될 수 있다.
상기 변성, 결합 및 신장은 적어도 30 회 이상 반복 실시될 수 있으며, 구체적으로는 적어도 35 회 이상 반복 실시될 수 있고, 더 구체적으로는 적어도 45 회 반복 실시될 수 있다.
상기 최종신장은 적어도 1 회 이상 반복 실시될 수 있다.
상기 PCR의 증폭 산물을 전기영동하는 단계는 PCR에 의해 증폭된 산물의 검출을 위해 실시되며, 통상적으로 공지된 방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR의 증폭 산물을 전기영동하는 단계는 아가로스 겔 전기영동 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 실시될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 전기영동된 증폭 산물의 크기를 측정하여 참당귀의 원산지를 판별하는 단계에서는 증폭 산물의 크기에 따라, 국산 참당귀(Angelica gigas) 및 중국산 참당귀(Angelica gigas)를 판별할 수 있다.
구체적으로는, 상기 PCR의 증폭 산물의 크기가, 470 ~ 570 bp 인 경우 국산 참당귀(Angelica gigas)로 판단할 수 있고, 상기 PCR의 증폭 산물의 크기가, 125 ~ 225 bp인 경우 중국산 참당귀(Angelica gigas) 로 판단할 수 있다.
더 구체적으로는, 상기 PCR의 증폭 산물의 크기가, 500 ~ 540 bp 인 경우 국산 참당귀(Angelica gigas)로 판단할 수 있고, 상기 PCR의 증폭 산물의 크기가, 155 ~ 200 bp인 경우 중국산 참당귀(Angelica gigas) 로 판단할 수 있다.
가장 구체적으로는, 상기 PCR의 증폭 산물의 크기가, 520 bp 인 경우 국산 참당귀(Angelica gigas)로 판단할 수 있고, 상기 PCR의 증폭 산물의 크기가, 175 bp인 경우 중국산 참당귀(Angelica gigas) 로 판단할 수 있다.
이하 실시예, 비교예, 및 실험예를 통하여 본 발명의 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트, 키트 및 판별 방법에 대해 구체적으로 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[ 실시예 ]
실시예 1 : 시료 준비
국내산 참당귀 시료는 강원도, 경상북도, 충청북도 등에서 재배 중인 참당귀를 표준시료로 직접 방문하여 채취한 것을 사용하였고, 중국산 참당귀 시료는 중국 참당귀 주요 산지인 연변, 감숙성, 길림성 등에서 재배된 참당귀를 표준시료로 사용하였으며, 이는 표 2와 같다.
또한, 국산 참당귀 및 중국산 참당귀를 혼합한 시료 12번 및 13번을 추가로 제조하였으며, 이는 3과 같다.
실시예 2 : 유전자 추출
DNA는 DNeasy plant mini 키트(QIAGEN) 등을 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라, 추출하였다. 구체적으로는, 하기 a 내지 f 에 따라 추출하였다.
a. 각각의 시료(약 0.1 g)에 AP1 완충액 400 ㎕ 및 RNase A (100 ㎎/㎖) 4 ㎕를 넣어 혼합 후 65 ℃에서 10 분간 반응시켰다(반응 중 샘플을 2 ~ 3회 혼합).
b. 반응액에 AP2 완충액 130 ㎕를 넣고 혼합하여 얼음에 5 분간 방치 후 원심분리(14,000 x g, 5분)하였다.
c. 상층액을 QIAshredder mini spin 컬럼에 옮긴 후 원심분리(14,000 x g, 2 분)하였다.
d. AP3/E 완충액을 용출액 1.5 배에 해당되게 혼합 후 DNeasy Mini spin 컬럼에 넣고 원심분리(8,000 x g, 1분)하였다.
e. AW 완충액 500 ㎕로 DNeasy Mini spin 컬럼을 2회 세척하였다.
f. AE 완충액 100 ㎕를 컬럼에 넣고 5분간 방치 후 원심 분리하여 (8,000 x g, 1분) 최종 용출하였다.
실시예 3 : 유전자 순도 확인
DNA 원액의 농도는 멸균증류수(또는 TE 완충용액, pH 8.0)로 적절히 희석한 후, 분광광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하고, 그 값이 1일 때, DNA 농도가 50 ng/㎕인 것으로 하여 계산하였다.
한편, 추출된 DNA의 순도를 확인하기 위하여 230, 260, 280 nm에서 흡광도를 각각 측정하였으며, A260/A280과 A260/A230이 1.7 ~ 2.0일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판단하였다.
실시예 4 : SCAR marker(
sequence-characterized amplified region marker)
설계
3 종의 Random Primer(RAPD, ISSR, SRAP : primer 250set)를 이용하여 유의성 있는 다형성 밴드를 확인하였다. Gel-extraction방법을 이용하여 다른 밴드와 완전히 분리하고, 정제 한 다음, 염기서열 분석을 진행하였다.
각각의 염기서열 중 Primer 인접한 부위에서, SCAR marker 위치를 선정하였으며, Primer-Blast(NCBI)에서 Tm 값 및 self complementarity 여부 등과 다른 종의 유전자와의 결합유무를 확인한 후, 그 결과를 토대로 프라이머를 제작하였다.
본 발명에서 제작한 프라이머의 정보는 상기 표 1과 같다.
실시예 5 : PCR을 통한 유전자 증폭
유전자 증폭(PCR)에는 AccuPower PCR Premix (BIONEER, Korea)를 사용하였으며, 유전자 증폭 반응액 조성은 표 4와 같다.
또한, 상기 유전자 증폭 반응액을 이용한 PCR 조건은 하기 표 5와 같으며, 표 5의 PCR 조건은 참당귀의 원산지를 판별하는데 최적화된 것이다.
실시예 6 : 유전자 증폭 결과 확인(전기영동)
유전자 증폭(PCR) 후 결과 확인을 위해, 본 실시예에서는 아가로스 겔 전기영동을 실시하였다. 본 실시예에서는 최종 농도 1.5 ~ 2 %의 아가로스를 칭량하고, 전기영동 TAE (Tris-acetate/EDTA) 완충액을 넣은 후 가열하여, 아가로스를 녹여 사용하였다.
구체적으로, 상기 전기영동의 경우, PCR 증폭산물에 염색액(gel loading buffer)을 혼합한 후, 겔의 각 홈에 시료를 넣으며, 양끝의 각 홈에는 PCR 증폭 산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA (Marker DNA)을 넣고, 전압 100 V로 25 ~ 30분 진행되었으며, 전기영동을 멈추고 화상분석기 등을 이용하여, 유전자 증폭 결과를 확인하였으며, 그 결과는 도 1과 같다.
도 1을 보면, 참당귀의 원산지 판별용 특이 프라이머를 이용한 유전자 증폭 결과, 국산 참당귀에서만 특이적으로 520 bp 크기의 증폭 산물을 확인할 수 있으며, 중국산 참당귀에서만 특이적으로 175 bp 크기의 증폭 산물을 확인할 수 있다.
또한, 국산 참당귀 및 중국산 참당귀가 혼합된 시료의 경우, 520 bp 크기의 증폭 산물과 175 bp 크기의 증폭 산물을 모두 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명에 따르면, 특이 프라이머를 이용하여 참당귀의 원산지를 판별할 수 있다. 다시 말해, 상기 프라이머 세트는 원산지가 상이한 참당귀가 혼합된 혼합물에서, 어떠한 원산지를 가지는 참당귀가 혼합되어 있는지 여부를 확인하는데 활용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOLMAR KOREA
<120> PRIMER SET FOR DETERMINING SPECIES AND ORIGIN OF CNIDIUM, AND
METHOD FOR DETERMINING SPECIES AND ORIGIN OF CNIDIUM USING THE
SAME
<130> PF210208
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SmKDF(Scar marker Korea dang gui Forward)
<400> 1
ggttcattct ttctcg 16
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SmKDR(Scar marker Korea dang gui Reverse)
<400> 2
ggattaatgt gacctctg 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SmCDF(Scar marker China dang gui Forward)
<400> 3
cgaattgcat agggatg 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SmCDR(Scar marker China dang gui Reverse)
<400> 4
tcctggaaat gttgtcc 17
Claims (11)
- 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제1 프라이머 세트; 및
서열번호 3의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열을 포함하는 제2 프라이머 세트;를 포함하는, 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트로서,
상기 참당귀의 원산지 판별은 국산 참당귀(Angelica gigas) 및 중국산 참당귀(Angelica gigas)를 판별하는 것을 포함하는, 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 제1 프라이머 세트는
국산 참당귀(Angelica gigas) 판별용인, 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트.
- 제 1 항에 있어서,
상기 제2 프라이머 세트는
중국산 참당귀(Angelica gigas) 판별용인, 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트.
- 제 1 항에 있어서,
상기 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 상기 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은 정방향 프라이머이고,
상기 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열, 및 상기 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 서열은 역방향 프라이머인, 참당귀의 원산지 판별용 프라이머 세트.
- 제 1 항의 프라이머 세트를 포함하는, 참당귀의 원산지 판별용 키트로서,
상기 참당귀의 원산지 판별은 국산 참당귀(Angelica gigas) 및 중국산 참당귀(Angelica gigas)를 판별하는 것을 포함하는, 참당귀의 원산지 판별용 키트.
- 제 1 항의 프라이머 세트를 이용한, 참당귀의 원산지 판별 방법으로서,
상기 참당귀의 원산지 판별은 국산 참당귀(Angelica gigas) 및 중국산 참당귀(Angelica gigas)를 판별하는 것을 포함하는, 참당귀의 원산지 판별 방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 참당귀의 원산지 판별 방법은
참당귀로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제 1 항의 프라이머 세트를 이용하여, 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계;
상기 PCR의 증폭 산물을 전기영동하는 단계; 및
상기 전기영동된 증폭 산물의 크기를 측정하여 참당귀의 원산지를 판별하는 단계;를 포함하는, 참당귀의 원산지 판별 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 PCR은 하기 중 하나의 조건을 포함하는, 참당귀의 원산지 판별 방법:
90 ~ 100 ℃에서 3 ~ 7분 동안 초기 변성(initial denaturation);
90 ~ 100 ℃에서 15 ~ 25초 동안 변성(denaturation);
35 ~ 50 ℃에서 5 ~ 20초 동안 결합(annealing);
70 ~ 75 ℃에서 25 ~ 35초 동안 신장(extension); 및
70 ~ 75 ℃에서 3 ~ 7분 동안 최종신장(elongation).
- 제 9 항에 있어서,
상기 결합은
국산 참당귀(Angelica gigas)는 35 ~ 45 ℃에서 실시하고,
중국산 참당귀(Angelica gigas)는 40 ~ 50 ℃에서 실시하는 것을 포함하는, 참당귀의 원산지 판별 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 참당귀의 원산지를 판별하는 단계는,
PCR의 증폭 산물의 크기가,
470 ~ 570 bp 인 경우 국산 참당귀(Angelica gigas)로 판단하고,
125 ~ 225 bp인 경우 중국산 참당귀(Angelica gigas) 로 판단하는 것인, 참당귀의 원산지 판별 방법.
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