KR101532566B1

KR101532566B1 - 참깨의 품종 분석을 위한 프라이머 및 이를 이용한 참깨의 품종 분석 방법

Info

Publication number: KR101532566B1
Application number: KR1020110144349A
Authority: KR
Inventors: 양기웅; 박장환; 심강보; 이명희; 황정동; 배석복; 정찬식; 백인열
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2011-12-28
Filing date: 2011-12-28
Publication date: 2015-06-30
Also published as: KR20130075984A

Abstract

본 발명은 프라이머쌍을 이용하여 참깨의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 참깨의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 참깨 DNA 판별 방법을 이용하면, 참깨의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 참깨의 품종을 판별할 수 있다.
또한 고유품종에 관련하여 종자의 혼입 및 곤충에 의한 타식 유무를 판별할 수 있다.
참깨의 DNA 프로파일을 작성하여 국내 참깨 유통시장의 건정성을 확보하고, 품종 보증으로 소비자 만족도를 증대시키는데 기여할 수 있고, FTA 등의 시장 개방에 대비하여 육종자 및 재배자의 권익을 보호할 수 있다.

Description

참깨의 품종 분석을 위한 프라이머 및 이를 이용한 참깨의 품종 분석 방법{Primer for the Identification of Sesame Cultivar and Method for Identifying Sesame Cultivar}

본 발명은 참깨의 품종 분석을 위한 프라이머 및 이를 이용한 참깨의 품종 분석 방법에 관한 것이다.

인류가 참깨를 이용한 것은 기원전 3,000년경이며, 국내에는 삼국시대 이전에 재배했던 작물로 알려져 있다. 참깨는 유지작물 중에서도 특히 귀한 작물로 세계에서 널리 사용하고 있는데 그 이유는 여러 가지 기능성을 갖는 건강식품이기 때문이다. 참깨는 참기름이나 깨소금 등 조미원료로 재배되는 작물로 1인당 연 소비량은 평균 2 kg으로 나타나고 있다. 참깨는 기름뿐만 아니라 단백질 함량도 풍부해 방향성이 뛰어나고 맛이 좋아 우리나라에서는 예로부터 한과류, 식용 및 약용으로 이용되어 온 중요한 식품 재료이다. 그러나 국산깨 품종들에 대한 유전자적 차이 및 수입깨에 대한 정확한 차별기준이 없어 소비자들에게 많은 혼란을 야기하고 있다. 또한, 참깨는 자가수정을 하지만 포장조건에서 2~5%의 높은 자연교잡이 이루어진다. 이러한 자연교잡은 참깨 품종의 혼입을 초래하게 되고, 품종 간의 특성을 구분할 수 없어 고유 품종을 차별화하는데 어려움이 있다. 현재 품종화 되어있는 참깨 중 종자 혼입 및 타식에 관련하여 과학적으로 판명할 수 없어 고유 품종에 대한 판별이 필요하다.

이에 본 발명자들은 참깨의 품종을 정확하면서도 간편하게 판별할 수 있는 마커를 찾아내고자 연구하여 참깨 품종에 대한 반응이 우수한 프라이머쌍 중 6종의 프라이머쌍이 참깨 품종 판별에 사용될 수 있음을 발견하였다.

이를 위해 양백깨의 유전자 부위에서 DNA 염기서열을 확인하여 이를 이용한 분자표지를 개발하고자 수행하였다. 개발한 분자표지의 다형성 확인은 양백깨를 포함한 육성품종 44종의 시험재료로 확인하였다.

이에 본 발명의 목적은 참깨의 품종 판별에 사용되는 프라이머 쌍을 제공하는데 있다.

또한 본 발명은 상기 분자표지를 이용한 DNA 증폭을 통해 참깨 품종을 판별하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 참깨 품종 판별용 분자표지를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, (a) 분석하고자 하는 참깨 품종으로부터 프라이머쌍을 포함하는 DNA를 추출하는 단계;

(b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를

포함하는 참깨 DNA 다형성 분석 방법을 제공한다.

본원 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명에서 제공되는 본 발명의 분자표지를 이용하는 경우, 유전자 부위에서 작성한 분자표지이기 때문에 정확한 결과로 고유 참깨 품종을 간편하게 판별할 수 있으며, 교배 육종 과정에서 쉽게 교배유무를 판별할 수 있어 세대를 더욱 빠르게 진전시켜 품종화하는 시간을 단축시킬 수 있어 효율성이 향상되며, 품종을 개량하는데 있어서 비용절감의 효과를 제공할 수 있다. 또한 고유품종에 관련하여 종자의 혼입 및 곤충에 의한 타식 유무를 판별할 수 있다.

(ii) 이를 통해 참깨의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 참깨의 품종을 판별할 수 있다.

(iii) 참깨의 DNA 프로파일을 작성하여 국내 참깨 유통시장의 건정성을 확보하고, 품종 보증으로 소비자 만족도를 증대시키는데 기여할 수 있고, FTA 등의 시장 개방에 대비하여 육종자 및 재배자의 권익을 보호할 수 있다.

도 1은 양백깨를 이용하여 확인한 SES-87의 염기서열로서 SES-205 생성물 유무를 확인하기 위한 양성 대조군(positive control)로 분자표지를 작성하였다.
도 2는 양백깨를 이용하여 확인한 염기서열로서 SES-123의 생성물 유무를 확인하기 위한 분자표지를 작성하였다.
도 3은 양백깨를 이용하여 확인한 염기서열로서 SES-140의 생성물 크기 차이를 확인하기 위한 분자표지를 작성하였다.
도 4는 양백깨를 이용하여 확인한 염기서열로서 SES-164의 생성물 유무를 확인하기 위한 분자표지를 작성하였다.
도 5는 양백깨를 이용하여 확인한 염기서열로서 SES-205의 생성물 유무를 확인하기 위한 분자표지를 작성하였다.
도 6은 양백깨를 이용하여 확인한 염기서열로서 SES-226의 생성물 유무를 확인하기 위한 분자표지를 작성하였다.
도 7은 PCR 증폭 생산물의 유무로 참깨 품종을 판별할 수 있는 분자표지를 2% 아가로스 겔에서 확인하였다.
도 8은 PCR 증폭 생산물의 크기 차이로 참깨 품종을 판별할 수 있는 분자표지를 2% 아가로스 겔에서 확인하였다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 프라이머쌍을 제공한다.

본 발명은, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 참깨 품종 판별용 프라이머쌍을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 참깨의 DNA 다형성 검출 방법 및 참깨의 품종 동정 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 참깨의 유전적 다형성을 특이적으로 분석할 수 있는 마커를 제공하는 것을 특징으로 한다.

참깨로부터 추출한 DNA를 제한효소로 처리하여 DNA 단편을 제작하였고, PCR을 수행하여 증폭한 후 서열을 분석하여 참깨의 초위성체를 포함하는 DNA 단편을 얻었다.

본 발명에서 제공하는 마커는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다. 바람직하게는 SES-87(서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍), SES-123(서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머쌍), SES-140(서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머쌍), SES-164(서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머쌍), SES-205(서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머쌍), SES-226(서열번호 11과 12로 표시되는 프라이머쌍)로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명에서 제공되는 프라이머쌍은 참깨에서 DNA 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 참깨의 유전자원과 품종을 효율적으로 평가 또는 보존할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행 하는 것을 포함하는 참깨의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.

구체적으로 참깨의 DNA 다형성 검출 방법은

(a) 분석하고자 하는 참깨 품종으로부터 프라이머쌍을 포함하는 DNA를 추출하는 단계;

(c) 상기 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함한다.

상기 (a)단계에서 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Pla nt Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., N uc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

또한 상기 (b)단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다.

본 명세서에 기술된 용어“PCR”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR(24), 핫 스타트(hot start) PCR(25, 26), 네스티드(nested) PCR(2) 및 부스터(booster) PCR(27)이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 참깨에서 추출된 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함 한다. 이 때 MgCl₂ 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5 ~ 2. 5mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg² ⁺가 과량인 경우는 비 특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg² ⁺가 부족한 경우 PCR산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충 용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94 ~ 95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94 ~ 95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있다. 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 55 ~ 60℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응조건은 다음과 같다. 94℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 60초를 35 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다.

상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치 (ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. PCR 증폭 결과는 바람직 하게는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 보다 바람직하게는 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)과 형광염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

아울러, 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 참깨의 품종 동정 방법을 제공한다.

구체적으로 참깨의 품종 동정 방법은

(a) 분석하고자 하는 참깨 및 대조군 참깨 품종으로부터 DNA를 추출하는 단계;

(b) 추출한 상기 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(c) PCR 산물을 전기영동하는 단계; 및

(d) 상기 참깨 및 대조군 참깨의 전기영동 결과를 비교하는 단계를 포함한다.

(a) 내지 (c) 단계의 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 상기에서 기재한 바와 같으며, 상기 (d) 단계에서 참깨 및 대조군 참깨 품종에 대한 비교는 동일한 조합의 프라이머쌍에 대한 시료가 되는 참깨와 대조군 참깨 품종의 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 프라이머쌍에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 참깨와 대조군 참깨 품종의 결과와 모두 일치하면 시료가 되는 참깨는 대조군 참깨 품종과 동일한 품종으로 동정할 수 있다. 이와 같은 품종의 동정 방법은 신규 유전자원 도입시 중복여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 동정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.

대조군 참깨 품종에 대한 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 참깨와 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 참깨 보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 참깨에 대한 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머쌍을 포함하 는 참깨의 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머쌍을 포함하는 참깨의 품종 동정용 키트를 제공한다. 품종 동정 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합 효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확 인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(1) 실시예 1: 참깨 품종 선별 단계

실험에 사용된 분자표지는 양백깨를 이용한 Euchromatin Enriched gDNA(EEG)를 절단효소(HeaⅢ와 SpeⅠ)로 생산물을 확인하고 cloning하였다. 각 clone으로부터 염기서열을 확인하고 분자표지를 작성하여 육성품종에서 다형성을 확인하였다(도 1~6). 구체적으로 246점의 clone으로부터 염기서열을 확인한 후 PCR 증폭을 위한 적정한 프라이머를 작성하기 위해 Primer3 사이트(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)에서 작성하여 바이오니아(주)에 주문 제작하였다. 제작한 프라이머가 분자표지로서 활용성이 있는지 확인해 보기 위해 현재 국립식량과학원 기능성작물부 두류유지작물과에서 보유하고 있는 참깨 44품종에서 다형성을 확인하였다.

분자표지 확인을 위한 참깨 44 품종
연번	품종명	연번	품종명	연번	품종명	연번	품종명
1	양백깨	12	풍산깨	23	남백깨	34	흑선깨
2	진백깨	13	황백깨	24	남안깨	35	만흑깨
3	진주깨	14	서둔깨	25	고품깨	36	강흑깨
4	한섬깨	15	남산깨	26	평안깨	37	진기깨
5	두벌깨	16	성분깨	27	밀성깨	38	미흑깨
6	안산깨	17	만금깨	28	유백깨	39	윤흑깨
7	강백깨	18	다삭깨	29	양흑깨	40	선흑깨
8	선백깨	19	한산깨	30	건흑깨	41	익산16호
9	수원깨	20	풍남깨	31	경흑깨	42	DT45
10	안남깨	21	남다깨	32	화흑깨	43	수원195호
11	오산깨	22	풍안깨	33	순흑깨	44	양안깨

상기 참깨 품종을 이용하여 개발한 분자표지를 확인하였다.

상기 참깨 품종을 이용하여 제작한 프라이머를 확인하여 본 결과 5점의 분자표지를 확인할 수 있었다.

분자표지 이름	프라이머	염기서열(5´-3´)	생산물
SES-87	정방향, 서열번호 1 역방향, 서열번호 2	ATATCCGCACCTTAGCCTGA GCAAGAGAATATGATGGAGT	SES-205의 양성 대조군(positive control)
SES-123	정방향, 서열번호 3 역방향, 서열번호 4	GCAACTGGAAGAGCCTGAGT AACTTGGGCCCATATGACTG	생산물의 유무
SES-140	정방향, 서열번호 5 역방향, 서열번호 6	GTCTTGGAACTTGTGTCTTC GCGGTAGCGTTATCATCACA	생산물의 크기차이
SES-164	정방향, 서열번호 7 역방향, 서열번호 8	GGAGCTAGATGGGCAAACAA CTTGCCGCATATCACCACAT	생산물의 유무
SES-205	정방향, 서열번호 9 역방향, 서열번호 10	CATGTCTCGTAAACGCATCAA CCATGTCGCTTGGAATCATA	생산물의 유무
SES-226	정방향, 서열번호 11 역방향, 서열번호 12	AAAGGTAGGGCAGCGTAGTT GAGAACATGTCAAGGAAAAC	생산물의 유무

상기 서열번호 1과 2의 프라이머쌍은 SES-205 생산물의 유무를 확인하기 위한 양성 대조군(positive control)의 서열을 제공한다.

상기 서열번호 3과 4, 7과 8, 9와 10 또는 11과 12는 참깨 품종에서 생산물의 유무를 확인할 수 있는 서열을 제공한다.

상기 서열번호 5와 6은 참깨 품종에서 생산물의 크기 차이를 확인할 수 있는 서열을 제공한다.

본 발명은 다양한 국산참깨에서 특이 품종의 차별화와 교배 유무를 확인할 수 있는 DNA 분자표지를 개발하고자 유전자 부위에서 PCR 증폭 생산물 차이를 확인하였다. 본 발명에 따른 분자표지는 참깨의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 참깨 품종을 효율적으로 평가함으로써 기존 보유 유전자원과의 중복성 분석 및 신규성 확보와 우리나라에서 육성된 참깨 품종 보호를 효과적으로 수행할 수 있는 분자생물학적 초기단계의 정보를 제공하였다.

본 발명에 따른 참깨 품종 판별 방법에서, 상기 DNA의 증폭은 당업계에 공지된 다양한 방법 중 PCR을 이용하여 증폭하는 경우, 당업계에서 PCR 반응에 필요한 것으로 공지된 성분들을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합핵은 참깨에서 추출된 DNA와 본 발명에 따른 분자표지, DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물 등을 포함하고, 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl₂, KCl 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 PCR 반응조건은 94℃ 3분 반응 후, 94℃에서 30초 47~52℃에서 30초 72℃에서 30초 34회 수행하고 72℃에서 7분간 반응하여 증폭된 DNA 산물을 전기영동에 의해 분석하여 확인하였다. 상기 전기영동에 의한 분석단계에서 증폭된 DNA 산물을 아가로스 겔 상에서 전기영동하고, EtBr 등으로 염색한 후 생산물을 확인할 수 있다. 증폭된 DNA 산물을 확인하기 위한 전기영동 및 생산물의 확인은 당업계에서 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.

(2) 실시예 2: 참깨 품종 판별 분자 표지 제조 단계

양백깨의 genomic DNA에서 절단효소(HeaⅢ와 SpeⅠ)로 생산물을 확인하고 각 생산물로부터 cloning하여 염기서열을 확인하였다. 전체 245개의 생산물의 염기서열을 확인하였고, 그 중 보유하고 있는 참깨 품종에서 뚜렷하게 차이를 확인할 수 있는 서열을 선별하였다(도 1 내지 6).

참깨 품종 판별을 위한 분자표지의 특성
분자표지 이름	염기서열	염기서열크기	생산물 크기
SES -87	도 1	1112	313
SES -123	도 2	1181	983
SES -140	도 3	1148	357
SES -164	도 4	1490	820
SES -205	도 5	1314	993
SES -226	도 6	1341	593

(3) 실시예 3: 참깨 품종 판별 분자 표지의 특이성 검증 단계

상기 실시예 1에서 제작한 분자표지가 다양한 참깨 품종에서 다형성 분석이 가능한지 검증하기 위해 PCR을 수행하였다.

① 식물재료

본 발명에 사용된 분자표지가 참깨 품종에서 다형성을 나타내는지 확인하기 위해 농촌진흥청 국립식량과학원 기능성작물부에서 보유하고 있는 참깨 품종 44점을 이용하였다(표 1).

② DNA 추출

실험에 사용될 참깨의 DNA를 추출하기 위하여, 상기한 참깨 품종의 어린 참깨 잎 0.5 g을 막자사발에 넣고 액체질소를 이용하여 파쇄한 후 퀵프랩 버퍼(200mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 1.5 mL과 함께 튜브에 넣은 후, 60 ℃에 1시간 반응시켰다. 10,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 얻어진 상층액 400 ㎕를 새 튜브에 넣고, 이소프로판올(isopropanol) 300 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 -80 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후 20,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 70 % 에탄올(ethanol)을 넣고 가볍게 씻어준 후 30 분간 건조하였다. 이후 DNA 추출 버퍼(10 mM NH₄OAC, 0.25 mM EDTA) 150 ㎕를 첨가한 후 잘 섞어 주었다. 이를 60 ℃에서 1 시간 반응 후 10,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 참깨 DNA인 상층액 100 ㎕을 얻었다.

③ 분자표지 분석을 위한 PCR

상기 제작한 분자 표지를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 상기에서 얻어진 참깨 DNA 시료는 각 100 ng을 사용하였으며, 프라이머쌍은 각각 20 pmol 씩 사용하였다(표 2). PCR 증폭을 위해 중합효소(polymerase) 및 PCR 반응용 완충용액이 혼합되어 있는 (주)제넷바이오 premix(Cat. No. G2002)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 증폭 조건으로는 먼저 94 ℃에서 3 분 반응 후, 94 ℃에서 30 초, 53 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초간 반응하는 사이클을 34 번 반복하였고, 마지막으로 72 ℃에서 5 분간 반응하였다. PCR 증폭이 끝난 생산물은 2% 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동하여 밴드를 확인하였다(EtBr 0.5 ㎍/ml, UV 상에서 확인). 품종에 따른 상기 밴드 분석 결과를 하기 표 4 및 도 7, 8에 나타내었다.

특히, 상기 서열번호 1과 2 및 9와 10의 프라이머쌍은 PCR 증폭시 함께 혼합하여 서열번호 9와 10의 생산물의 유무를 확인하였다.

분자표지에 따른 참깨 품종의 다형성 확인
분자표지 이름	참깨 품종의 구분( 양백깨 기준)
SES123	진백깨, 다삭깨, 고품깨, 강흑깨, 진기깨, 익산14호, 양안깨에서 생산물이 나타나지 않음
SES140	1) 선백깨, 오산깨, 풍산깨, 다삭깨, 화흑깨, 흑선깨, 강흑깨에서 생산물 크기가 다르게 나타남 2) 안남깨, 남산깨, 성분깨, 양흑깨, 만흑깨에서 생산물이 2가지로 나타남
SES164	오산깨, 성분깨, 고품깨, 화흑깨, 흑선깨, 수원195호에서 생산물이 하나 더 나타남
SES205	경흑깨, 수원195호에서 생산물이 나타나지 않음
SES226	진주깨, 두벌깨, 풍산깨, 만금깨, 다삭깨, 고품깨, 건흑깨, 화흑깨, 순흑깨, 흑선깨, 만흑깨, 강흑깨, 진기깨, 미흑깨, 익산16호, DT45에서 생산물이 나타나지 않음

상기 표 4 및 도 7, 8의 결과에서 볼 수 있듯이, 개발한 분자표지가 참깨 품종에 따라 다형성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

<110> Republic of Korea (Management: Rural Development Administration) <120> Primer for the Identification of Sesame Cultivar and Method for Identifying Sesame Cultivar <130> DP-2011-0766 <140> 10-2011-0144349 <141> 2011-12-28 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-87 : forward primer for detecting Sesame Cultivar <400> 1 atatccgcac cttagcctga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-87 : reverse primer for detecting Sesame Cultivar <400> 2 gcaagagaat atgatggagt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-123 : forward primer for detecting Sesame Cultivar <400> 3 gcaactggaa gagcctgagt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-123 : reverse primer for detecting Sesame Cultivar <400> 4 aacttgggcc catatgactg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-140 : forward primer for detecting Sesame Cultivar <400> 5 gtcttggaac ttgtgtcttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-140 : reverse primer for detecting Sesame Cultivar <400> 6 gcggtagcgt tatcatcaca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-164 : forward primer for detecting Sesame Cultivar <400> 7 ggagctagat gggcaaacaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-164 : reverse primer for detecting Sesame Cultivar <400> 8 cttgccgcat atcaccacat 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-205 : forward primer for detecting Sesame Cultivar <400> 9 catgtctcgt aaacgcatca a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-205 : reverse primer for detecting Sesame Cultivar <400> 10 ccatgtcgct tggaatcata 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-226 : forward primer for detecting Sesame Cultivar <400> 11 aaaggtaggg cagcgtagtt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SES-226 : reverse primer for detecting Sesame Cultivar <400> 12 gagaacatgt caaggaaaac 20

Claims

서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 참깨 DNA 다형성 판별용 프라이머쌍.
청구항 1에 있어서, 상기 참깨 DNA 다형성 판별용 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍;을 추가적으로 모두 포함하는 참깨 DNA 다형성 판별용 프라이머쌍.
청구항 2의 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 참깨 품종 판별용 분자마커 조성물.
청구항 1의 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 참깨 품종 판별용 분자마커 조성물.
청구항 2의 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 참깨 품종 판별용 분자마커 조성물.
청구항 2의 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 참깨 품종 판별용 분자마커 조성물.
청구항 2의 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 참깨 품종 판별용 분자마커 조성물.
(a) 분석하고자 하는 참깨 품종으로부터 서열번호 5 및 6로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계
를 포함하는 참깨 DNA 다형성 검출 방법.
청구항 1의 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 참깨 DNA 다형성 판별용 키트.