CN111349709A - 一种基于分子生物学的黑白芝麻检测方法 - Google Patents

一种基于分子生物学的黑白芝麻检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了本发明通过分子生物学方法(例如，荧光实时PCR和高分辨率熔解曲线分析)来定性鉴别黑芝麻和白芝麻的方法。本发明还提供了用于鉴别黑芝麻和白芝麻的特异性引物。

Description

一种基于分子生物学的黑白芝麻检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。具体而言，本发明通过分子生物学方法 (例如，荧光实时PCR和高分辨率熔解曲线分析)来定性鉴别黑芝麻和白芝麻。
背景技术
芝麻属胡麻科植物，一年生直立草本植物，它遍布世界上的热带地区以及部分温带地区，种子卵形，两侧扁平，黑色、白色或淡黄色。其中以黑芝麻和白芝麻为主。芝麻含有多种营养成分，具有很高的营养价值和食用功能价值，其用途较广泛，不但是一种油料种子，也是药材和食材。黑芝麻药食两用，自古以来就被认为是养生保健的佳品。然而，同为胡麻科的白芝麻在众多医药宝典中没有医疗价值的记录，人们一直认为黑芝麻比白芝麻等其他颜色的芝麻更有益于人体健康。研究表明，黑芝麻的游离态、结合态和总多酚及黄酮含量均比白芝麻的含量高，值得注意的是，多酚及黄酮与抗氧化活性存在显著相关性，因此，黑芝麻的总抗氧化能力高于白芝麻[1]。黑芝麻中含有的黑色素对温度、光照有很好的耐受性，受氧化剂、还原剂、抗坏血酸、防腐剂和酸化剂的影响较小，是优良的天然色素来源。黑色素还有显著的光保护下抗氧化还原性和干扰体内病毒形成等生理活性，显示出黑芝麻独特的作用[2]。现在市场出现很多假冒黑芝麻，经过商贩的加工染色，拿到市场销售，蒙骗消费者。
董维卿[3]等从形态特征和薄层色谱两方面区分出黑芝麻和地肤种子。江新永[4]提出了用直接水洗法、白纱布水浸出法、滤纸层析鉴别法 3种方法来鉴别染色黑芝麻，为防止染色黑芝麻出口提供了一条简单快速可行的方法。虽然这些方法简单、易操作，但是其受主观影响较大，而且芝麻的化学成分容易受到芝麻生长环境和储藏条件的影响，因此根据理化性质来检测芝麻的种皮颜色有一定的局限性。
发明内容
本发明的发明人发现，黑芝麻和白芝麻的olea基因上存在有两个位点的碱基差异(即SEQ ID NO:6的第99位、和第138位核苷酸)，因此，可针对上述差异(SEQ ID NO:6的第99位和/或第138位核苷酸)，设计合适的引物，以待鉴定的芝麻中提取的DNA为模板，进行 PCR扩增，再对扩增产物进行分析即可鉴别出黑白芝麻。具体而言，本发明的发明人利用分子生物学方法区分黑白芝麻，从芝麻中提取足量高质量的DNA，用根据芝麻种皮特异性基因相关序列设计的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再对扩增产物进行分析，例如高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)分析或测序分析，就能对芝麻种皮颜色进行判断。这种方法的优势在于可以定性鉴别出黑白芝麻，且不受地域、环境、脂肪酸比例带来的影响。
第一方面，本发明提供了用于PCR扩增的引物，所述引物用于特异性扩增SEQ IDNO:6或其包含的子序列，其中所述子序列包含SEQ ID NO:6的第99位和/或第138位核苷酸并且长度不小于50bp。
第二方面，本发明提供了一种PCR试剂盒，所述试剂盒包含第一方面的引物。
第三方面，本发明提供了第一方面的引物用于鉴别黑芝麻和白芝麻的用途或用于制备用于鉴别黑芝麻和白芝麻的检测试剂的用途。
第四方面，本发明提供了一种用于鉴别黑芝麻和白芝麻的方法，所述方法包括：(1)提取芝麻种子DNA；(2)以提取的DNA为模板，第一方面的引物为上下游引物，进行PCR；(3)分析PCR产物。
附图说明
图1表示使用引物对Sesame-oleaHRMF2和Sesame-olea-HRMR2 得到的扩增产物的HRM分析和使用引物对Sesame-olea-black-F和 Sesame-olea-black-R获得的PCR产物的测序分析。A为使用 Sesame-oleaHRMF2和Sesame-olea-HRMR2的扩增产物HRM分析，其中蓝色线代表黑芝麻样品1、2、3、4、5，绿色线代表白芝麻样品1、2、 3、4、5、6。B为使用Sesame-olea-black-F和Sesame-olea-black-R获得的PCR产物测序结果分析。
图2表示使用Sesame-oleaHRMF2和Sesame-olea-HRMR2，从市售的芝麻样品得到的扩增产物的HRM分析。
图3表示黑芝麻样品6和7的测序结果。A为黑芝麻样品6，B为黑芝麻样品7。
具体实施方式
一方面，本发明提供了用于PCR扩增的引物，所述引物用于特异性扩增SEQ ID NO:6或其包含的子序列，其中所述子序列包含SEQ ID NO:6的第99位和/或第138位核苷酸并且长度不小于50bp，优选不小于 55bp，更优选不小于57bp。优选地，所述引物用于特异性扩增SEQ ID NO:5。
在具体实施方案中，所述引物的序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2和/或SEQID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示。
在本领域中，在进行PCR扩增反应时，通常会加入引物对以进行PCR 扩增。在本案的一个具体实施方案中，进行PCR扩增时，所使用的引物对包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在本案的另一个具体实施方案中，进行PCR扩增时，所使用的引物对包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO: 4。
另一方面，本发明提供了一种PCR试剂盒，所述试剂盒包含本发明的引物。通常情况下，所述试剂盒中包含合适的引物对。在本案的一个具体实施方案中，所述试剂盒包含的引物对包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在本案的另一个具体实施方案中，所述试剂盒包含的引物对包括 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
在一个具体实施方案中，所述试剂盒还包含DNA聚合酶、dNTP和无菌水。
在另一个具体实施方案中，所述试剂盒为实时荧光PCR试剂盒。
另一方面，本发明提供了本发明的引物用于鉴别黑芝麻和白芝麻的用途或用于制备用于鉴别黑芝麻和白芝麻的检测试剂的用途。
在一个具体实施方案中，所述检测试剂是PCR试剂盒，优选为实时荧光PCR试剂盒。
再一方面，本发明提供了一种用于鉴别黑芝麻和白芝麻的方法，所述方法包括：(1)提取芝麻种子DNA；(2)以提取的DNA为模板，本发明的引物为上下游引物，进行PCR；(3)分析PCR产物。
在本案的一个具体实施方案中，进行PCR扩增时，所使用的上下游引物包括SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2。在本案的另一个具体实施方案中，进行PCR扩增时，所使用的上下游引物包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
在一个具体实施方案中，步骤(3)中的分析PCR产物为将所述PCR 产物直接进行高分辨率熔解曲线(HRM)分析。
在一个具体实施方案中，步骤(3)中的分析PCR产物为对所述PCR 产物进行DNA测序并分析测序结果。
在一个具体实施方案中，所述PCR为实时荧光PCR。
提取芝麻种子DNA的方法为本领域的常规方法，可采用的方法包括但不限于为：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法、SDS(十二烷基磺酸钠)法、GuSCN(异硫氰酸胍)法，也可以采用试剂盒，例如，天根植物基因组DNA提取试剂盒、TaKaRa Mini BEST通用基因组DNA提取试剂盒进行提取，具体提取过程为本领域的技术人员所熟知。
高分辨率熔解曲线(HRM)分析为本领域的技术人员所熟知，具体过程可参考Amplicon melting analysis with labeled primers:a closed-tube method fordifferentiating homozygotes and heterozygotes[5]和 High-resolution meltinganalysis of cDNA-derived PCR amplicons for rapid and cost-effectiveidentification of novel alleles in barley[6]。
以下实施例用于示例性地说明本发明，而不意欲对本发明进行限制。
实施例
以下实施例中使用的黑芝麻和白芝麻通过市购获得；酶与其他试剂均购自Takara公司；荧光定量PCR仪型号为Bio-Rad CFX96；实验中用到的引物均由上海生工生物工程公司合成。
实施例1：黑白芝麻种子DNA提取及浓度测定
使用研磨机把黑白芝麻样品(黑芝麻样品1-5；白芝麻样品1-6) 的种子磨碎，称取30mg粉末，按TakaRa通用基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取黑白芝麻种子DNA。
吸取1μL配制的DNA溶液，在Nonodrop2000分光光度计(赛默飞世尔科技)上测量DNA浓度，DNA的最佳浓度范围为50-100 ng/μL，OD260/OD280为1.8-2.0。
实施例2：芝麻种皮特异性引物设计
设计两对特异性引物，如表1所示：
表1：特异性引物序列
Figure BDA0001915646350000051
其中，引物对Sesame-oleaHRMF2和Sesame-olea-HRMR2针对的目的扩增片段长度为57bp，序列为：
(SEQ ID NO:5)
TTCTCGTCCTCTCTGGCCTCACTTTAGCCGGAACTGTTATTGC GCTCACCATCGCCA(5’-3’)；
引物对Sesame-olea-black-F和Sesame-olea-black-R针对的目的扩增片段长度为185bp，序列为：
(SEQ ID NO:6)
GAGCATTATGGTCAACAACAGCAGACCAGGGCGCCTCACCCG CAGCTGCAGCCGCGCGCCCAGCGGGTAGTGAAGGCGGCCAC CGCCGTGACAGCCGGCGGCTCGCTTCTCGTCCTCTCTGGCCT CACTTTAGCCGGAACTGTTATTGCGCTCACCATCGCCACTCC GCTGCTTGTGATCTTTAG(5’-3’)。
实施例3：实时荧光PCR检测
以提取的DNA为模板，采用引物对Sesame-oleaHRMF2和Sesame-olea-HRMR2进行实时荧光PCR。PCR反应体系为20μL，其中 SsoAdvancedTM
Figure BDA0001915646350000061
Green Supermix 10μL，上下游引物(浓度为 10μM)各0.5μL，模板DNA(浓度为50-100ng/μL)2μL，无菌水补齐至20μL。空白对照以无菌水代替模板DNA。每个反应做三个重复，PCR扩增程序采用两步法：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火延伸1分钟，共45个循环。
实施例4：HRM分析
实时荧光PCR扩增完成后，将扩增产物直接应用于Bio-Rad精确熔解分析软件，进行熔解曲线分析。HRM分析条件：95℃1min，70℃ 1min，然后以0.2℃/0.1s的速度从70℃升温至95℃，收集熔解曲线数据。
分析结果如图1A所示。从图中可以看出，黑芝麻样品1-5和白芝麻样品1-6呈现出不同的熔解曲线。
实施例6：测序验证
以黑白芝麻提取的DNA为模板，采用引物对Sesame-olea-black-F 和Sesame-olea-black-R进行PCR扩增。反应体系为50μL，其中10×缓冲剂(浓度为20mM)5μL，dNTPMixture(浓度分别为2.5mM)5μL，上下游引物(浓度分别为10μM)各1.5μL，taq酶(5U/μL)1μL，模板(浓度为50-100ng/μL)2μL，无菌水补齐至50μL。空白对照以无菌水代替模板DNA。每个反应做三个重复，PCR扩增程序：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共40个循环。扩增产物切胶回收，寄送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
测序结果如图1B所示。黑芝麻和白芝麻的olea基因上有两个位点的碱基不同(即SEQ ID NO:6的第99位、和第138位核苷酸)，与HRM 的分析结果相符合。
实施例7：市售样品检测
收集市场上售卖的14个黑白芝麻样品(7个黑芝麻样品，7个白芝麻样品)，用实施例1-6中所述方法进行检测。结果如图2所示。7个白芝麻样品为一种类型，5个黑芝麻样品为一种类型，而黑芝麻样品6和黑芝麻样品7在两种类型之间，这是由于有掺假黑芝麻存在造成的。
对于黑芝麻样品6和7，使用引物对Sesame-olea-black-F和 Sesame-olea-black-R进行PCR扩增测序，结果如图3所示。图谱表明，黑芝麻样品6(图3A)和黑芝麻样品7(图3B)在变异位点处有明显的峰谱嵌套，说明黑芝麻样品里掺有白芝麻，与HRM分析结果一致。参考文献
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序列表
<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司
<120> 一种基于分子生物学的黑白芝麻检测方法
<141> 2018-12-21
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttctcgtcct ctctggcctc act 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggcgatggt gagcgcaata ac 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagcattatg gtcaacaac 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaaagatca caagcagcg 19
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttctcgtcct ctctggcctc actttagccg gaactgttat tgcgctcacc atcgcca 57
<210> 6
<211> 185
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagcattatg gtcaacaaca gcagaccagg gcgcctcacc cgcagctgca gccgcgcgcc 60
cagcgggtag tgaaggcggc caccgccgtg acagccggcg gctcgcttct cgtcctctct 120
ggcctcactt tagccggaac tgttattgcg ctcaccatcg ccactccgct gcttgtgatc 180
tttag 185

Claims (10)

1.用于PCR扩增的引物，所述引物用于特异性扩增SEQ ID NO:6或其包含的子序列，其中所述子序列包含SEQ ID NO:6的第99位和/或第138位核苷酸并且长度不小于50bp；优选地，所述引物用于特异性扩增SEQ ID NO:5。
2.权利要求1的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2和/或SEQ IDNO:3和/或SEQ ID NO:4所示。
3.一种PCR试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1或2的引物；优选地，所述试剂盒为实时荧光PCR试剂盒。
4.权利要求3的试剂盒，所述试剂盒还包含DNA聚合酶、dNTP和无菌水。
5.权利要求1或2的引物用于鉴别黑芝麻和白芝麻的用途。
6.权利要求1或2的引物用于制备用于鉴别黑芝麻和白芝麻的检测试剂的用途；优选地，所述检测试剂是PCR试剂盒；更优选地，所述PCR试剂盒是实时荧光PCR试剂盒。
7.一种用于鉴别黑芝麻和白芝麻的方法，所述方法包括：(1)提取芝麻种子DNA；(2)以提取的DNA为模板，权利要求1或2所述的引物为上下游引物，进行PCR；(3)分析PCR产物。
8.权利要求7的方法，其中步骤(3)中的分析PCR产物为将所述PCR产物直接进行高分辨率熔解曲线(HRM)分析。
9.权利要求7的方法，其中步骤(3)中的分析PCR产物为对所述PCR产物进行DNA测序并分析测序结果。
10.权利要求7-9中任一项的方法，其中所述PCR为实时荧光PCR。
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