CN110964844B - 一种用于定性参苓白术散的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测中成药“参苓白术散”中多个主药的引物、检测试剂以及试剂盒和方法。本发明采用一种改进的CTAB方法从中成药“参苓白术散”提取基因组DNA，对基因组DNA进行全基因组扩增，改善DNA的质量，设计特异性引物，并采用突变扩增系统‑荧光定量PCR方法实现同时检测“参苓白术散”的多种主药成分。本发明可以精确地对人参、茯苓、白术、山药、莲子和薏苡仁等六种成分的特异基因，从而准确地判断出参苓白术散样品中是否含这六种组分，为中成药的监测提供强有力的支持。

Description

一种用于定性参苓白术散的引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体地说，涉及一种基于ARMS-荧光定量PCR法同时检测“参苓白术散”多种主药成分的引物、试剂盒及方法。
背景技术
药用植物可以作为药品、保健品，相关产业发达，但是药用植物的掺假现象极其严重。中药掺假不仅降低了药效，还容易产生毒副作用。由多种药用植物加工的复合型产品，如中成药，成分隐蔽，更难以鉴别。当前，多种科学方法用于药用植物的鉴定，包括宏观形态学分析、显微观察、多种色谱分析，基因鉴定。中成药“参苓白术散”是一种常见的散剂，根据《宋·太平惠民和剂局方》和《中国药典》的记载，其加工方法为：莲子肉(去皮)、薏苡仁、缩砂仁、桔梗(炒令深黄色)，各一斤。白扁豆(姜汁浸.去皮.微炒)一斤半，白茯苓、人参(去芦)、甘草(炒)、白术、山药，各二斤，粉碎成细粉，过筛，混匀，得到成品。由于“参苓白术散”经过深加工，形态学分析，显微观察等宏观方法无法进行，多种色谱分析的设备昂贵，时间漫长，无法成为一种方便的检测方法。因此，基因鉴定是一种方便性，可靠性俱佳的中药成分鉴定方法。
既往研究发现，一组基因可以作为植物物种基因鉴定的一种标准，其编码的基因序列被称为DNA条形码。用做DNA条形码的基因的特点是：同一种植物，其编码序列完全相同，或者高度相似；而其他物种随着亲缘关系由近到远，其编码序列相似性逐步越低。对中成药的物种鉴定，本质上对多个物种基因组的混合物，进行基因分型。多个物种的ITS2基因差异，主要是各种点突变，包括单核苷酸突变，单核苷酸缺失，单核苷酸插入等。
中成药的基因分型主要有四大类：第一类是目前常规的Sanger测序法，也称DNA条形码方法。主要实验步骤为：首先，对植物进行基因组DNA的提取；其次，用一套ITS2基因的通用引物，对基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行Sanger测序；最后，将测序结果与数据库中各个物种ITS2的基因序列进行比对分析，确定药用植物的物种。该方法是物种鉴定的标准，但是需要昂贵的仪器设备、周期长、工作繁琐。第二类是基于PCR的方法，如PCR-PFLP、PCR-芯片杂交法等。这一类方法的共同缺陷是在进行PCR以后，还需要进行酶切、电泳、杂交等操作，反应时间长，检测准确率低、通量低，这类方法都不适用于大量样本，也不适合常规操作。第三类是基于高通量测序方法。高通量测序法基本过程与Sanger测序方法相似，尤其是可以获得任意植物混合物中所有未知的物种的信息。但是高通量测序的缺点为成本太过高昂，时间周期过长，不适用于常规操作及推广。
第四类基于荧光定量PCR方法，更广泛适用于各种常规基因鉴定。其中，TaqMan探针法，针对特定的物种设计PCR引物和TaqMan探针。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针的序列与待鉴定物种完全匹配，而与其他容易混淆的物种不完全匹配。当荧光定量PCR反应体系中存在特定物种的基因组时，该探针与模板形成互补双链，产生了适合于核酸外切酶活性的底物。当PCR扩增时，DNA聚合酶将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，发出荧光。这种方法精确，但主要缺点为探针合成的成本高，保存期短。
突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system，ARMS)又称等位基因特异性扩增法，其基本原理是合成一对引物，其中一条或者两条引物的3’-端碱基，与特定模板的独有碱基完全互补，而与容易混淆的物种在3’-端有一个或者多个碱基的差异。引物3’-端的特异碱基分别与模板形成错配，链延伸反应就会因3′,5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻。当在溶液中加入荧光染料，比如SYBR Green I，就可以定量的看到靶基因的扩增。这种检测方法无需序列特异性探针，成本低，结果准确。
发明内容
本发明提供了基于ITS2基因的单核苷酸变异的可用于定性“参苓白术散”的主药成分的特异引物序列，并采用ARMS-荧光定量PCR方法实现同时检测“参苓白术散”的多种主药成分。
本发明的另一目的，是建立一种通用的多种植物混合物中的ARMS荧光PCR鉴定方法，可以推广到绝大多数中成药的基因鉴定方法，为中成药的基因鉴定建立一种模式。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于定性参苓白术散的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括：人参、茯苓、白术、山药、莲子、薏苡仁的扩增引物、内控引物、PCR试剂。
进一步地，上述人参、茯苓、白术、山药、莲子、薏苡仁扩增引物序列如下：
人参扩增引物序列：
Rensen-F：5’-CGGGACAATAAATAACAATACCGGGCTGATTC-3’；
Rensen-R：5’-GCCAGTTAAGGACAGGAGCGC-3’；
茯苓引物序列如下：
Fuling-F：5’-GAACGGGAACCCTAGAAATCGTTAAGG-3’；
Fuling-R：5’-CTAATCTGTTTGTCCATCCGACCCG-3’；
白术引物序列如下：
Baizhu-F：5’-GTGACGCAACTATCGGGTCCT-3’；
Baizhu-R：5’-CGGTGTTTGTTTACGTGCCGG-3’；
山药引物序列如下：
Shanyao-F：5’-AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA-3’；
Shanyao-R：5’-GTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGA-3’；
莲子引物序列如下：
lianzi-F：5’-AGAGTTGGTGCAGATGTTGGCCTC-3’；
lianzi-R：5’-TCACACACTCGACACCCCAATGA-3’；
薏苡仁引物序列如下：
Yiyiren-F：5’-AAGACGAGGTGGGCCAAAGTT-3’；
Yiyiren-R：5’-ACGTGATGTGCACGACACGA-3’。
进一步地，上述内控引物为真核生物18s rDNA扩增引物。
更进一步地，上述真核生物18s rDNA扩增引物序列如下：
18s rDNA-F：5’-GGAAGGATCATTGTCGAAACCTGC-3’；
18s rDNA-R：5’-GTGCCAGTATTTAGCCTTGGACGGAATTTACC-3’。
一种用于定性检测参苓白术散的检测试剂盒，包括上述检测试剂和阳性对照。
进一步地，上述阳性对照人参基因组DNA、茯苓基因组DNA、白术基因组DNA、山药基因组DNA、莲子基因组DNA、薏苡仁基因组DNA。
参苓白术散定性检测盒在参苓白术散定性检测中的应用，其中，参苓白术散定性检测试剂使用方法如下所示：
1)从“参苓白术散”样品中提取DNA；
2)使用如权利要求5～6所述试剂盒对样品DNA进行PCR扩增；
3)参照阳性对照，定性样品。
进一步地，上述PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0002348307060000031
Figure BDA0002348307060000041
进一步地，上述PCR反应条件为：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性10s，72℃延伸30s；循环40次。
一种定性检测散剂中药的系统，其特征在于，包括核酸提取装置和对比分析装置；
其中，所述核酸提取装置含有目标中药的扩增引物；
核酸提取装置含有参苓白术散阳性对照基因组
本发明具有以下优点：
本发明设计并使用人参、茯苓、白术、山药、莲子和薏苡仁等特异性的引物，采用ARMS-荧光定量PCR方法，可以准确定性参苓白术散样品中人参、茯苓、白术、山药、莲子和薏苡仁等主药成分。且其检测方法还可以广泛适用于其他由多种植物复合的中成药或其他相关制品。相较现有的Taqman探针法和Sanger测序法，节约了试剂成本，更有利于长期保存，检测准确度和成功率更高。
附图说明
图1为参苓白术散DNA与18s阳性对照扩增图谱；
图2为参苓白术散DNA与人参阳性对照扩增图谱；
图3为参苓白术散DNA与茯苓阳性对照扩增图谱；
图4为参苓白术散DNA与白术阳性对照扩增图谱；
图5为参苓白术散DNA与山药阳性对照扩增图谱；
图6为参苓白术散DNA与莲子阳性对照扩增图谱；
图7为参苓白术散DNA与薏苡仁阳性对照扩增图谱。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，通常采用常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的荧光定量PCR仪型号为ABI 7500或BioRadCFX96。
实施例1参苓白术散的基因提取
(1)取参苓白术散0.050g，加入1.5ml的离心管中，加入500ul 2XCTAB缓冲液(2％CTAB；100mmo1/L Tris-HC1(pH 8.0)；20mmo1/LEDTA(pH 8.0)；1.4mol/L NaCl；2％β-巯基乙醇)，50ul 20％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)将离心管置于65℃水浴锅中，水浴20min-30min，每间隔5min轻柔摇晃。
(2)将上述步骤的上清合并，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇混合物(25:24:1)将离心管转移至离心机中，12,000rpm室温离心1min，取上清400ul至新的1.5ml离心管中。
(3)加入400ul异丙醇，10ul磁珠，混匀后，放置在磁力架上两分钟，磁分离10s，吸走上清。
(4)将离心管取下，加入500ul漂洗缓冲液，涡旋器振荡混匀，将离心管放在磁力架上，磁分离10s，倾倒废液。重复一次。
(5)在离心管加入100ul(洗脱缓冲液)，用枪头进行搅拌、吹吸，室温静置5min，磁分离30s(或直接离心12000rpm，3min)，小心吸取上清至新的离心管。
(6)紫外分光光度计检测DNA浓度(注意仪器清洁，擦镜纸擦拭)，记录各管浓度，并在离心管上做好标记，DNA放在-20℃冰箱保存。
实施例2.引物、对照品的制备
(1)引物设计
根据人参基因组DNA、茯苓基因组DNA、白术基因组DNA、山药基因组DNA、莲子基因组DNA、薏苡仁基因组DNA，进行AMRS-qPCR引物设计。其中，所设计的引物都能特异性的扩增各物种的ITS2序列。
所设计引物的整个序列与靶基因完全互补，且在剔除引物3末端的最后1个碱基后，前面的序列可能与其他物种的序列完全互补。
人参引物序列如下：
上游引物：Rensen-F：5’-CGGGACAATAAATAACAATACCGGGCTGATTC-3’(SEQ IDNO.1)；
下游引物：Rensen-R：5’-GCCAGTTAAGGACAGGAGCGC-3’(SEQ ID NO.2)；
茯苓引物序列如下：
上游引物：Fuling-F：5’-GAACGGGAACCCTAGAAATCGTTAAGG-3’(SEQ ID NO.3)；
下游引物：Fuling-R：5’-CTAATCTGTTTGTCCATCCGACCCG-3’(SEQ ID NO.4)；
白术引物序列如下：
上游引物：Baizhu-F：5’-GTGACGCAACTATCGGGTCCT-3’(SEQ ID NO.5)；
下游引物：Baizhu-R：5’-CGGTGTTTGTTTACGTGCCGG-3’(SEQ ID NO.6)；
山药引物序列如下：
上游引物：Shanyao-F：5’-AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA-3’(SEQ ID NO.7)；
下游引物：Shanyao-R：5’-GTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGA-3’(SEQ ID NO.8)；
莲子引物序列如下：
上游引物：lianzi-F：5’-AGAGTTGGTGCAGATGTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.9)；
下游引物：lianzi-R：5’-TCACACACTCGACACCCCAATGA-3’(SEQ ID NO.10)；
薏苡仁引物序列如下：
上游引物：Yiyiren-F：5’-AAGACGAGGTGGGCCAAAGTT-3’(SEQ ID NO.11)；
下游引物：Yiyiren-R：5’-ACGTGATGTGCACGACACGA-3’(SEQ ID NO.12)；
上述引物最后一个碱基可与相应物种进行特异性碱基互补，保证了高效延伸的对象只能是该特定的物种。
(2)内控引物
为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取真核生物保守基因18s rDNA(其参考序列编号为：NR_003278.3)，分析其保守序列，采用ABI公司的PrimerExpress 3.0软件设计检测引物，具体序列如下所示：
内控引物组：
18s rDNA F：5’-GGAAGGATCATTGTCGAAACCTGC-3(SEQ ID NO.13)；
18s rDNA R：5’-GTGCCAGTATTTAGCCTTGGACGGAATTTACC-3(SEQ ID NO.14)。
实施例3引物的制备
将设计好的实施例2的引物交由基因合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。
实施例4参苓白术散的ARMS荧光定量PCR检测试剂盒
本发明用于检测参苓白术散的试剂盒的一种实施例，包含PCR反应必需的缓冲液、镁离子、dNTPs等物质外，还包含检测引物与探针，阳性对照人参、茯苓、白术、山药、莲子和薏苡仁的DNA。其具体组成如下表1所示。
表1参苓白术散的ARMS荧光定量PCR检测试剂盒的组成
编号 试剂
1 Tris-HCl(pH＝8.4)
2 KCl
3 MgCl<sub>2</sub>
4 dNTPs
5 Triton X100
6 SYBR Green I
7 Taq DNA pol
8 18s rDNA的上游和下游引物
9 人参上游引物和下游引物
10 茯苓上游引物和下游引物
11 白术上游引物和下游引物
12 山药上游引物和下游引物
13 莲子上游引物和下游引物
14 薏苡仁上游引物和下游引物
15 人参基因组DNA
16 茯苓基因组DNA
17 白术基因组DNA
18 山药基因组DNA
19 莲子基因组DNA
20 薏苡仁基因组DNA
21 去离子水
对比例5参苓白术散主药成分鉴定对比
现有Sanger鉴定参苓白术散：
按实施例1提取参苓白术散的核酸。参苓白术散根据某药房根据《太平惠民和剂局方》制备。
用ITS2通用引物进行PCR扩增，对扩增产物纯化处理后，将纯化的DNA连接并转化入大肠杆菌。取转化后大肠杆菌克隆提取质粒，用ABI 3130XL测序仪进行Sanger测序分析。
分析发现将转化后大肠杆菌克隆的测序结果与GeneBank中核酸序列比对，都是人参序列，且大肠杆菌转化成功率(含有参苓白术散主药基因的克隆则判定为成功)仅为6.7％。该结果说明从中成药“参苓白术散”中，提取的DNA进行PCR扩增后，每种主药的提取效果差异较大，人参的提取效率高，所以人参DNA所占总DNA含量的比例大，而PCR又有偏倚作用，模板含量高的基因会更高效的被扩增，所要最终人参的PCR产物占据了绝大多数。且现有Sanger法测序法花费的时间长(超过2天)，可以充分说明Sanger测序方法并不适用于中成药鉴定，本发明方法在成本、周期、效率以及成功率更优于现有技术。
实施例6参苓白术散的荧光定量PCR试剂盒的应用
第一步：核酸提取。
按实施例1提取参苓白术散的核酸。参苓白术散为某药房根据《太平惠民和剂局方》制备。
第二步：使用实施例4中的PCR试剂盒，配制7套荧光定量PCR体系，每组引物分别为下表所示：
Figure BDA0002348307060000081
模板放置：导入荧光定量PCR扩增反应。
Figure BDA0002348307060000082
Figure BDA0002348307060000091
荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性10s，72℃延伸30s；循环40次，然后65℃-95℃，进行溶解曲线分析。
第三步：分析结果。
1)如果第1组的18s rDNA的上游引物和下游引物的荧光定量PCR反应体系内，模板DNA获得的荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线，则表示该种参苓白术散的DNA提取成功；
2)如果人参物种特异性上游引物和下游引物的荧光定量PCR反应体系内，获得的荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线，表示该参苓白术散中含有人参；
3)茯苓、白术、山药、莲子和薏苡仁的分析，同上述步骤2)(图1～7)。
图1～7为各阳性对照与参苓白术散的扩增图谱示例，证实本发明方法采用ARMS-荧光定量PCR方法，可以准确定性参苓白术散样品中人参、茯苓、白术、山药、莲子和薏苡仁等主药成分。且其检测方法还可以广泛适用于其他由多种植物复合的中成药或其他相关制品。
SEQUENCE LISTING
<110> 星阵（广州）基因科技有限公司
<120> 一种用于定性参苓白术散的引物、试剂盒及方法
<130>
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<170> PatentIn version 3.5
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cgggacaata aataacaata ccgggctgat tc 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccagttaag gacaggagcg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaacgggaac cctagaaatc gttaagg 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctaatctgtt tgtccatccg acccg 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggtgtttgt ttacgtgccg g 21
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<211> 27
<212> DNA
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aagaacgcag cgaaatgcga taagtaa 27
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<212> DNA
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<212> DNA
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agagttggtg cagatgttgg cctc 24
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<212> DNA
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tcacacactc gacaccccaa tga 23
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aagacgaggt gggccaaagt t 21
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<212> DNA
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gtgccagtat ttagccttgg acggaattta cc 32

Claims (6)

1.一种用于定性参苓白术散的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括：人参、茯苓、白术、山药、莲子、薏苡仁的扩增引物和内控引物；
所述人参、茯苓、白术、山药、莲子和薏苡仁的扩增引物序列如下：
人参扩增引物序列：
Rensen-F：5’-CGGGACAATAAATAACAATACCGGGCTGATTC-3’；
Rensen-R：5’-GCCAGTTAAGGACAGGAGCGC-3’；
茯苓引物序列如下：
Fuling-F：5’-GAACGGGAACCCTAGAAATCGTTAAGG-3’；
Fuling-R：5’-CTAATCTGTTTGTCCATCCGACCCG-3’；
白术引物序列如下：
Baizhu-F：5’-GTGACGCAACTATCGGGTCCT-3’；
Baizhu-R：5’-CGGTGTTTGTTTACGTGCCGG-3’；
山药引物序列如下：
Shanyao-F：5’-AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA-3’；
Shanyao-R：5’-GTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGA-3’；
莲子引物序列如下：
lianzi-F：5’-AGAGTTGGTGCAGATGTTGGCCTC-3’；
lianzi-R：5’-TCACACACTCGACACCCCAATGA-3’；
薏苡仁引物序列如下：
Yiyiren-F：5’-AAGACGAGGTGGGCCAAAGTT-3’；
Yiyiren-R：5’-ACGTGATGTGCACGACACGA-3’；
所述内控引物为真核生物18s rDNA扩增引物；
所述真核生物18s rDNA扩增引物序列如下：
18s rDNA-F：5’- GGAAGGATCATTGTCGAAACCTGC-3’；
18s rDNA-R：5’- GTGCCAGTATTTAGCCTTGGACGGAATTTACC-3’。
2.一种用于定性检测参苓白术散的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述检测试剂和阳性对照。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为分别含有真核生物18s rDNA基因以及人参基因组DNA、茯苓基因组DNA、白术基因组DNA、山药基因组DNA、莲子基因组DNA和薏苡仁基因组DNA的pUC57载体质粒。
4.权利要求2~3任一项所述的检测试剂盒在参苓白术散定性检测中的应用，其特征在于，参苓白术散定性检测试剂使用方法如下所示：
1）从“参苓白术散”样品中提取DNA；
2）使用如权利要求2~3任一项所述试剂盒对样品DNA进行PCR扩增；
3）参照阳性对照，定性样品。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增反应体系为：
Figure 960746DEST_PATH_IMAGE001
。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR反应条件为：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性10s，72℃延伸30s；循环40次。
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