CN109694865B - 薄壳山核桃品种Desirable的特征序列、标记引物及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多对薄壳山核桃品种Desirable的高特异性特征序列、分子特异性标记引物、以及一种能对薄壳山核桃品种Desirable进行快速、准确地鉴定的方法。所述分子特异性标记引物组序列如下：1)上游引物：5′‑TGCCCAAGTGATTTTGCTGC‑3′；下游引物：5′‑TTTTGCCTTCTCGAGGGGAG‑3′2)上游引物：5′‑TGAGACTCTGTTTCGTACTTTCGA‑3′；下游引物：5′‑ACAGGAAGAGTGTGCAGCAA‑3′3)上游引物：5′‑TGCTCCAACTGCTGAGGTTT‑3′；下游引物：5′‑ACTCCCCATCAATGATTTAACCCA‑3′本发明分子特异性标记引物可对薄壳山核桃品种Desirable进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别薄壳山核桃品种所不可替代的分子手段。
Description
技术领域
本发明涉及薄壳山核桃品种Desirable的特征序列、分子特异性标记引物组合以及利用该分子特异性标记引物组合对薄壳山核桃品种Desirable进行特异性鉴定的方法。
背景技术
薄壳山核桃（Carya illinoënsis (Wangenh.) K.Koch）是胡桃科山核桃属中最有经济价值的树种。薄壳山核桃是典型的异交植物，现有生产实践发现，薄壳山核桃的品种配置是影响其产量主要因素之一；美国是薄壳山核桃的原产地之一，也是中心产区，多年来，美国已选育命名的栽培品种约1000个；我国引种薄壳山核桃已有100多年历史，目前生产上常用的品种有几十个，多年的生产实践证明我国广大亚热带地区是薄壳山核桃的适生区；
但是，我国现有薄壳山核桃产区面临的主要问题是产量低下和不稳定，造成这一现象原因有多个方面，其中之一就是现有引进的品种尚缺乏明确的亲缘关系分析，再加上一些杂交后代定名的混乱，导致难以进行有效的亲本选择和合理配置，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育，因此着力从分子水平上开发出一些稳定、特异的DNA品种指纹标记是实现薄壳山核桃品种准确快速鉴定的科学途径；
国内外已报导一些用于薄壳山核桃品种鉴定和亲缘关系分析的分子标记方法，比较好的有SSR分子标记法，但这些旧有的检测方法还是较为繁琐，且结果不稳定。
发明内容
本发明目的是提供薄壳山核桃品种Desirable的特征序列、分子特异性标记引物组合以及利用该分子特异性标记引物组合对薄壳山核桃品种Desirable进行特异性鉴定的方法；
本发明采用的技术方案是：
薄壳山核桃品种Desirable的特征序列组，其序列组如下：
1)5′-AATTCACTGTAAATGGGAACAAAGCTTCTTGCGGCCAGCTCTAGAATTGCCCAATATTTAGATTTTACGGCGTTGCAAAATCATCATCAATGACCCAACTTTGCGACGTTAAACCGATTTGCCCAAGTGATTTTGCTGCTAGAAATGTCTGCCGAGTTAGCTATGGTAATTGCAGGGGGCATAATTTCTCACCGAAATTTCTCTGACCAGACAATTTATTTTCGACCGATTAACGACAAGTGAAAATCGTAGTTTGTGAACTGTTGCTGCAAGAAAACATGGGATATGCAGGGATCTTGCTCCCCTCGAGAAGGCAAAATTCTTGTAGTGTTATTTGCAACGAGTTTTGATTGGTTTCAAAAATTTTGTATAGTATTCAAATTACAAGAGATC-3′
2)5′-AATTCCTATATTTGAGACTCTGTTTCGTACTTTCGAATCTTCACAACATTATCATTAATGTCATATATTGCTAGTATCAGAATATGGGTTGCTCTAGGAAATATTGCATCCAAAACATAATCTTATTAGAAATTAGATAACAGAATAAACTTCCACACTGAATTGCTTGCAGGATCATTTGAAGTTATGTTTATATATGCTATTGGATACGAACTCAATATTCTGAATTTTGATAATATCGTTTTGGAAACAGCTTTTGTTTTGCTGCACACTCTTCCTGTTCTGTACGAGAAGTATGAGGACAAGGTTGATCCATTTGCAGAGAAGGCGATGA-3′
3)5′-AATTCACATGCTCCAACTGCTGAGGTTTCTCCTCTCACGACCTTTAAGTTCATCTTGGGAGTAGCTCTAGTATCTGTGATATTTGGCATAATTGTTGGGAAACGATATTATATGGGCAAGGGGTAAAAATGAAGACAAATTCCCTGACCAACCTCAACACCTAAGTTTGAAAGCATCCAAACATAGCTTTCAAATCTCTTACTGCATAATTTATATTGATGGGAAAAGAAAAGGGAAAACAAAGTAAGAAACAAAAGAAGATCAAAACCAAAATCCACAAAAACCCCAAGCCTTCATTTTTACCCCTTGCCCATATAATATGTAAAGTGAAAATTACAGTTCATGTATTACTATTCAAGTTTGTATTTAATTTGTTGATTGGGTTGCATATCTTTCCAACTTTGTTTCTGGGTTAAATCATTGATGGGGAGTTTTATTTCC-3′
本发明还涉及薄壳山核桃品种Desirable的分子特异性标记引物组，所述引物序列为：
1)上游引物：5′-TGCCCAAGTGATTTTGCTGC-3′；
下游引物：5′-TTTTGCCTTCTCGAGGGGAG-3′
2)上游引物：5′-TGAGACTCTGTTTCGTACTTTCGA-3′；
下游引物：5′-ACAGGAAGAGTGTGCAGCAA-3′
3)上游引物：5′-TGCTCCAACTGCTGAGGTTT-3′；
下游引物：5′-ACTCCCCATCAATGATTTAACCCA-3′
上述3对引物组合的来源：首先，从常见的24个品种中筛选出性状差异较大的5个品种进行简化基因的测序和比较分析；接着，根据分析结果设计1000多对引物，在24个样品中进行筛选和验证，获得薄壳山核桃品种Desirable的特异性DNA片段；然后，将该片段克隆测序，再经过三次以上重复性取样的复筛，最终获得的分子特异性标记引物组合；以上述特异性引物组合对薄壳山核桃品种进行PCR扩增，仅Desirable可获得分别为200bp，269bp，424bp大小的3条特异性片段，其他薄壳山核桃品种均不能获得选出引物组合的特异性片段；需要说明的是，本发明的分子特异性标记引物组合仅限于薄壳山核桃品种的鉴定，即待测样品仅限于薄壳山核桃；
针对上述特征序列，设计的3对特异性引物，所扩增的3个产物分别为：
1)200bp:5’-TGCCCAAGTGATTTTGCTGCTAGAAATGTCTGCCGAGTTAGCTATGGTAATTGCAGGGGGCATAATTTCTCACCGAAATTTCTCTGACCAGACAATTTATTTTCGACCGATTAACGACAAGTGAAAATCGTAGTTTGTGAACTGTTGCTGCAAGAAAACATGGGATATGCAGGGATCTTGCTCCCCTCGAGAAGGCAAAA-3’
2)269bp:5’-AATTCCTATATTTGAGACTCTGTTTCGTACTTTCGAATCTTCACAACATTATCATTAATGTCATATATTGCTAGTATCAGAATATGGGTTGCTCTAGGAAATATTGCATCCAAAACATAATCTTATTAGAAATTAGATAACAGAATAAACTTCCACACTGAATTGCTTGCAGGATCATTTGAAGTTATGTTTATATATGCTATTGGATACGAACTCAATATTCTGAATTTTGATAATATCGTTTTGGAAACAGCTTTTGTTTTGCTAAT-3’
3)424bp:5’-TGCTCCAACTGCTGAGGTTTCTCCTCTCACGACCTTTAAGTTCATCTTGGGAGTAGCTCTAGTATCTGTGATATTTGGCATAATTGTTGGGAAACGATATTATATGGGCAAGGGGTAAAAATGAAGACAAATTCCCTGACCAACCTCAACACCTAAGTTTGAAAGCATCCAAACATAGCTTTCAAATCTCTTACTGCATAATTTATATTGATGGGAAAAGAAAAGGGAAAACAAAGTAAGAAACAAAAGAAGATCAAAACCAAAATCCACAAAAACCCCAAGCCTTCATTTTTACCCCTTGCCCATATAATATGTAAAGTGAAAATTACAGTTCATGTATTACTATTCAAGTTTGTATTTAATTTGTTGATTGGGTTGCATATCTTTCCAACTTTGTTTCTGGGTTAAATCATTGATGGGGAGT-3’
Desirable是C. Forkert通过杂交育种推出的品种，但父母本不清楚，杂交于1903年，于1914年发布。目前在美国种植面积较大，被当作为一个品种对比的标准种。树体结构好，生长势旺。雄花先，花期早，雌花花期迟。坚果椭圆形，大果型，顶端尖锐度中等而底部较圆，坚果外壳粗糙，平均单果重9.7g左右；果仁金黄色，背部主凹槽宽，中脊渐尖型，基部裂隙明显，腹尾部隆起；
本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物组合，对薄壳山核桃品种Desirable进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测薄壳山核桃品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物组作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果同时出现分别为200bp，269bp，424bp大小的3条DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为薄壳山核桃品种Desirable，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：
1)上游引物：5′-TGCCCAAGTGATTTTGCTGC-3′；
下游引物：5′-TTTTGCCTTCTCGAGGGGAG-3′
2)上游引物：5′-TGAGACTCTGTTTCGTACTTTCGA-3′；
下游引物：5′-ACAGGAAGAGTGTGCAGCAA-3′
3)上游引物：5′-TGCTCCAACTGCTGAGGTTT-3′；
下游引物：5′-ACTCCCCATCAATGATTTAACCCA-3′
本发明方法关键在于扩增引物组合的选择，DNA提取，PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行；
本发明方法与现有薄壳山核桃品种的分子标记方法相比，如SSR等标记方法，有以下优点：（1）因为所用引物经测序和反复验证，故可靠性提高了很多；（2）检测方便、直观，直接通过普通电泳观察条带的有无组合即可判断，而像SSR标记扩增后还需要利用高分辨率电泳进一步分析或者测序；（3）对样品的要求较低，叶片等组织的DNA样品均可以满足品种鉴定的需要；
优选的，本发明所述PCR扩增体系组成如下：
PCR Buffer 终浓度为1×
dNTPs 1 mmol/L
MgCl2 2.5 mmol/L
Taq 酶 1.0 U/反应
上、下游引物 各0.2 μM
模板DNA 60 ng/反应
余量为ddH2O；
所述PCR扩增条件如下：94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s；终止温度为4℃；
PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCR Buffer。10×PCR Buffer成分为：100 mM Tris-HCl（pH 8.5）、500 mM KCl、25 mM MgCl2和1.0% Triton-X-100，溶剂为ddH2O；
具体的，所述方法如下：
（1） 取待测薄壳山核桃叶片，加液氮磨碎，采用bioteke新型快速植物基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取待测薄壳山核桃叶片的基因组DNA；
（2） 以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR反应体系每15μl组成如下：
2×TsingKE master mix 7.5μl
10 μM上、下游引物 各0.2μl
20 ng/μl模板DNA 2μl
dd H2O 4.3μl；
PCR反应条件如下：
94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s；终止温度为4℃；
（3） 取步骤（2）扩增产物3μl，与1μl 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现分别为200bp、269bp、424bp的3条DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为Desirable；反之则否。
附图说明
图1为对24种薄壳山核桃品种进行PCR扩增的结果（编号1-24代表薄壳山核桃品种依次为：1、Moore，2、Dependable，3、Nacono，4、靖州1号，5、Van Deman，6、Sturat5，7、Forkert，8、Desirable，9、Davis，10、Elliott，11、Caddo，12、Schley，13、Choctaw，14、绍兴，15、Wichita，16、Sumner，17、Mahan，18、Gloria Grande，19、Peruque，20、Sioux，21、Pyzner，22、Pawnee，23、Osage，24、Oconee）；M为Takara DL2000 marker；仅编号8为薄壳山核桃品种Desirable扩增出了分别为200bp、269bp、424bp大小的3条特异DNA条带；其余编号为其它的薄壳山核桃品种，未见有特异DNA条带产生。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
（1）薄壳山核桃品种基因组DNA的提取：
取待测薄壳山核桃品种幼嫩叶片0.05 g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用bioteke新型快速植物基因组DNA提取试剂盒的操作说明，经多次抽提，来获得薄壳山核桃品种的基因组DNA提取物；DNA提取物再经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳来检测完整性、纯度及浓度；判断条带亮度用于后续PCR扩增；DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；
（2）设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：
A:上游引物：5′-TGCCCAAGTGATTTTGCTGC-3′；
下游引物：5′-TTTTGCCTTCTCGAGGGGAG-3′
B:上游引物：5′-TGAGACTCTGTTTCGTACTTTCGA-3′；
下游引物：5′-ACAGGAAGAGTGTGCAGCAA-3′
C:上游引物：5′-TGCTCCAACTGCTGAGGTTT-3′；
下游引物：5′-ACTCCCCATCAATGATTTAACCCA-3′
由上海生物工程技术有限公司合成；
（3） PCR扩增：
PCR反应液组成（15μl）：
2×TsingKE master mix master mix（擎科生物，北京） 7.5μl
10 μM上、下游引物 各0.2μl
20 ng/μl模板DNA 2μl
dd H2O 4.3μl；
扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行；扩增条件：94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s；终止温度为4℃；
（4）电泳检测：取步骤（3）PCR扩增产物3μl，与1μl 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5 μg/ml EB的水溶液中染色30分钟，然后在Bio-rad 凝胶成像系统Gel Doc上照相；
按照上述方法分别对24个薄壳山核桃品种（编号1-24代表薄壳山核桃品种依次为：1、Moore，2、Dependable，3、Nacono，4、靖州1号，5、Van Deman，6、Sturat5，7、Forkert，8、Desirable，9、Davis，10、Elliott，11、Caddo，12、Schley，13、Choctaw，14、绍兴，15、Wichita，16、Sumner，17、Mahan，18、Gloria Grande，19、Peruque，20、Sioux，21、Pyzner，22、Pawnee，23、Osage，24、Oconee）的PCR扩增图谱进行电泳检测，结果见图1；
其中仅从编号为8的薄壳山核桃品种Desirable中扩增出了三条清晰明亮、稳定的分别为约为200bp、269bp、424bp的特异DNA条带，而其余编号的薄壳山核桃品种，未见有特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异性标记引物对用于薄壳山核桃品种Desirable的早期鉴定，其稳定性、特异性非常高。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省林业科学研究院
<120> 薄壳山核桃品种Desirable的特征序列、标记引物及鉴定方法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 393
<212> DNA
<213> Carya illinoensis
<220>
<221> unsure
<400> 1
aattcactgt aaatgggaac aaagcttctt gcggccagct ctagaattgc ccaatattta 60
gattttacgg cgttgcaaaa tcatcatcaa tgacccaact ttgcgacgtt aaaccgattt 120
gcccaagtga ttttgctgct agaaatgtct gccgagttag ctatggtaat tgcagggggc 180
ataatttctc accgaaattt ctctgaccag acaatttatt ttcgaccgat taacgacaag 240
tgaaaatcgt agtttgtgaa ctgttgctgc aagaaaacat gggatatgca gggatcttgc 300
tcccctcgag aaggcaaaat tcttgtagtg ttatttgcaa cgagttttga ttggtttcaa 360
aaattttgta tagtattcaa attacaagag atc 393
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<223> 人工序列
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cataatttct caccgaaatt tctctgacca gacaatttat tttcgaccga ttaacgacaa 120
gtgaaaatcg tagtttgtga actgttgctg caagaaaaca tgggatatgc agggatcttg 180
ctcccctcga gaaggcaaaa 200
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<212> DNA
<213> unknown
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<221> unsure
<223> 人工序列
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tcttattaga aattagataa cagaataaac ttccacactg aattgcttgc aggatcattt 180
gaagttatgt ttatatatgc tattggatac gaactcaata ttctgaattt tgataatatc 240
gttttggaaa cagcttttgt tttgctgcac actcttcctg ttctgtacga gaagtatgag 300
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tcttattaga aattagataa cagaataaac ttccacactg aattgcttgc aggatcattt 180
gaagttatgt ttatatatgc tattggatac gaactcaata ttctgaattt tgataatatc 240
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taccccttgc ccatataata tgtaaagtga aaattacagt tcatgtatta ctattcaagt 360
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ttcaaatctc ttactgcata atttatattg atgggaaaag aaaagggaaa acaaagtaag 240
aaacaaaaga agatcaaaac caaaatccac aaaaacccca agccttcatt tttacccctt 300
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aatttgttga ttgggttgca tatctttcca actttgtttc tgggttaaat cattgatggg 420
gagt 424
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<400> 12
actccccatc aatgatttaa ccca 24
Claims (5)
1. 薄壳山核桃品种Desirable的分子标记组由3个共存的特异性DNA片段组成，其碱基序列如下：
1)5′-AATTCACTGTAAATGGGAACAAAGCTTCTTGCGGCCAGCTCTAGAATTGCCCAATATTTAGATTTTACGGCGTTGCAAAATCATCATCAATGACCCAACTTTGCGACGTTAAACCGATTTGCCCAAGTGATTTTGCTGCTAGAAATGTCTGCCGAGTTAGCTATGGTAATTGCAGGGGGCATAATTTCTCACCGAAATTTCTCTGACCAGACAATTTATTTTCGACCGATTAACGACAAGTGAAAATCGTAGTTTGTGAACTGTTGCTGCAAGAAAACATGGGATATGCAGGGATCTTGCTCCCCTCGAGAAGGCAAAATTCTTGTAGTGTTATTTGCAACGAGTTTTGATTGGTTTCAAAAATTTTGTATAGTATTCAAATTACAAGAGATC-3′
2)5′-AATTCCTATATTTGAGACTCTGTTTCGTACTTTCGAATCTTCACAACATTATCATTAATGTCATATATTGCTAGTATCAGAATATGGGTTGCTCTAGGAAATATTGCATCCAAAACATAATCTTATTAGAAATTAGATAACAGAATAAACTTCCACACTGAATTGCTTGCAGGATCATTTGAAGTTATGTTTATATATGCTATTGGATACGAACTCAATATTCTGAATTTTGATAATATCGTTTTGGAAACAGCTTTTGTTTTGCTGCACACTCTTCCTGTTCTGTACGAGAAGTATGAGGACAAGGTTGATCCATTTGCAGAGAAGGCGATGA-3′
3)5′-AATTCACATGCTCCAACTGCTGAGGTTTCTCCTCTCACGACCTTTAAGTTCATCTTGGGAGTAGCTCTAGTATCTGTGATATTTGGCATAATTGTTGGGAAACGATATTATATGGGCAAGGGGTAAAAATGAAGACAAATTCCCTGACCAACCTCAACACCTAAGTTTGAAAGCATCCAAACATAGCTTTCAAATCTCTTACTGCATAATTTATATTGATGGGAAAAGAAAAGGGAAAACAAAGTAAGAAACAAAAGAAGATCAAAACCAAAATCCACAAAAACCCCAAGCCTTCATTTTTACCCCTTGCCCATATAATATGTAAAGTGAAAATTACAGTTCATGTATTACTATTCAAGTTTGTATTTAATTTGTTGATTGGGTTGCATATCTTTCCAACTTTGTTTCTGGGTTAAATCATTGATGGGGAGTTTTATTTCC-3′。
2.薄壳山核桃品种Desirable的分子特异性标记引物组，所述引物序列如下：
1)上游引物：5′-TGCCCAAGTGATTTTGCTGC-3′；
下游引物：5′-TTTTGCCTTCTCGAGGGGAG-3′
2)上游引物：5′-TGAGACTCTGTTTCGTACTTTCGA-3′；
下游引物：5′-ACAGGAAGAGTGTGCAGCAA-3′
3)上游引物：5′-TGCTCCAACTGCTGAGGTTT-3′；
下游引物：5′-ACTCCCCATCAATGATTTAACCCA-3′。
3.一种利用权利要求2所述的分子特异性标记引物对薄壳山核桃品种Desirable进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测薄壳山核桃品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果同时出现200bp、269bp、424bp大小的特异DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为薄壳山核桃品种Desirable，反之则否；所述分子特异性标记引物组序列为：
1)上游引物：5′-TGCCCAAGTGATTTTGCTGC-3′；
下游引物：5′-TTTTGCCTTCTCGAGGGGAG-3′
2)上游引物：5′-TGAGACTCTGTTTCGTACTTTCGA-3′；
下游引物：5′-ACAGGAAGAGTGTGCAGCAA-3′
3)上游引物：5′-TGCTCCAACTGCTGAGGTTT-3′；
下游引物：5′-ACTCCCCATCAATGATTTAACCCA-3′。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s；终止温度为4℃。
5.如权利要求3或4任一项所述的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）取待测薄壳山核桃叶片，加液氮磨碎，基因组DNA的提取采用bioteke新型快速植物基因组DNA提取试剂盒的操作说明；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增；
PCR扩增条件如下：
94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s；终止温度为4℃；
（3）取步骤（2）扩增产物3μl，与1μl 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶成像系统上照相，若电泳结果同时出现200bp、269bp、424bp大小的DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为Desirable，反之则否。
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