CN107557369B

CN107557369B - 薄壳山核桃品种Nacono的特征序列、标记引物及鉴定方法

Info

Publication number: CN107557369B
Application number: CN201710782310.7A
Authority: CN
Inventors: 朱汤军; 彭华正; 金群英; 叶华琳
Original assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Current assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Priority date: 2017-09-02
Filing date: 2017-09-02
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2037-09-02
Also published as: CN107557369A

Abstract

本发明涉及一对特异性高的薄壳山核桃品种Nacono的特征序列，分子特异性标记引物，以及一种能对薄壳山核桃品种Nacono进行快速鉴定的方法。所述分子特异性标记引物序列如下：上游引物：5′‑GTCACTTCCCTTTCTCGGCA‑3′；下游引物：5′‑CCCCGGGTGCAGGTATAAAA‑3′。本发明分子特异性标记引物可对薄壳山核桃品种Nacono进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别薄壳山核桃品种所不能替代的分子手段。

Description

薄壳山核桃品种Nacono的特征序列、标记引物及鉴定方法

(一)技术领域

本发明涉及薄壳山核桃品种Nacono的特征序列、分子特异性标记引物以及利用该分子特异性标记引物对薄壳山核桃品种Nacono进行快速鉴定的方法。

(二)背景技术

薄壳山核桃(Carya

(Wangenh.)K.Koch)是胡桃科山核桃属中最有经济价值的树种。薄壳山核桃是典型的异交植物，现有生产实践发现，薄壳山核桃的品种配置是影响其产量主要因素之一。美国是薄壳山核桃的原产地之一，也是其中心产区，多年来，其已选育命名的栽培品种约1000个。我国引种薄壳山核桃已有100多年历史,目前生产上常用的品种也有几十个，多年的生产实践已证明我国广大亚热带地区是薄壳山核桃的适生区。

但是，现有我国薄壳山核桃产区面临的主要问题是产量低下和不稳定，造成这一现象原因有多个方面，其中之一就是现有引进的品种尚缺乏明确的亲缘关系分析，再加上一些杂交后代定名的混乱，导致难以进行有效的亲本选择和合理配置，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育，因此着力从分子水平上开发出这些品种稳定、特异的DNA指纹标记才是实现薄壳山核桃品种准确快速鉴定的科学途径。

国内外已报导基于SSR分子标记的薄壳山核桃品种鉴定和亲缘关系分析，但存在检测较为繁琐，结果不稳定的情况。

(三)发明内容

本发明目的是提供薄壳山核桃品种Nacono的特征序列、分子特异性标记引物以及利用该分子特异性标记引物对薄壳山核桃品种Nacono进行快速鉴定的方法。

本发明采用的技术方案是：

薄壳山核桃品种Nacono的特征序列，其序列如下：5’-AATTCCTCCCAGCATCTTCCGACCGGTTGCCTATCTCATCCTGCATTGTCGTCTACACCTTTCTAGTCACTTCCCTTTCTCGGCATTTTTCTATGCTAGGTCTAGCTACTGGGTGGACAGTCGGGCGAAGCCTCTGATGCTTAAGTTAGTTAGGAGAAAAGGAATTTTTCTCAGAGTTTTAGTTGAGGATTGTTCGAACCACCTACTCGGCGCTCGAAGGGCTGTTTTTATACCTGCACCCGGGGTC-3’(SEQ ID No.1)

本发明还涉及薄壳山核桃品种Nacono的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物：5′-GTCACTTCCCTTTCTCGGCA-3′；

下游引物：5′-CCCCGGGTGCAGGTATAAAA-3′。

该引物对是采用PCR技术，从常见的24个品种中筛选形状差异较大的品种进行简化基因的测序和比较分析，经过大量筛选试验获得薄壳山核桃品种Nacono的特异性DNA片段(SEQ ID No.1)之后，将该片段克隆测序，针对序列相差较大的基因片段设计了1000多对引物，在24个样品中进行筛选和验证，经过初筛和三次以上重复性取样的复筛，最终获得的分子特异性标记引物，以该特异性引物对薄壳山核桃品种进行PCR扩增，仅Nacono可获得180bp大小的特异性片段(SEQ ID No.2)，其他薄壳山核桃品种均不能获得特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于薄壳山核桃品种的鉴定，即待测样品仅限于薄壳山核桃。

针对上述特征序列部分序列设计的特异性引物扩增产物为180bp：5’-GTCACTTCCCTTTCTCGGCATTTTTCTATGCTAGGTCTAGCTACTGGGTGGACAGTCGGGCGAAGCCTCTGATGCTTAAGTTAGTTAGGAGAAAAGGAATTTTTCTCAGAGTTTTAGTTGAGGATTGTTCGAACCACCTACTCGGCGCTCGAAGGGCTGTTTTTATACCTGCACCCGGGG-3’(SEQ ID No.2)。

Nacono是美国农业部农业科研局(USDA-ARS)和德州农业试验站通过杂交育种推出的品种，于2000年7月18日发布，由‘Cheyenne’×‘Sioux’的杂交后代于1974年选出的。‘Nacono’品种适宜种植范围广，搞病虫能力较好。树体高大，生长势较强，主干明显。坚果椭圆形，果顶和果底尖；中果型，平均单果重10.0g左右，果仁很容易被完全地分成两半，坚果品质好，加工出仁破损率低，很适合加工，果仁奶油色至金黄色，背中脊较粗，主凹槽较浅。雌花先熟型，花序较长。

本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对薄壳山核桃品种Nacono进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测薄壳山核桃品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现180bp大小的DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为Nacono，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5′-GTCACTTCCCTTTCTCGGCA-3′；

下游引物：5′-CCCCGGGTGCAGGTATAAAA-3′。

本发明方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

本发明方法比现有薄壳山核桃品种的SSR标记鉴定方法的可靠性提高了很多，而且不像SSR标记扩增后还需要达1-2bp分辨率的电泳分析或者测序，本方法在只需普通PCR后进行普通电泳判断条带的有无即可，此外本发明方法由于高度的准确性和特异性，因此对样品的要求较低，叶片等组织的DNA样品均可以满足品种鉴定的需要。

优选的，本发明所述PCR扩增体系组成如下：

所述PCR扩增条件如下：94℃预变性300s；95℃变性30s，56℃退火60s，72℃延伸50s，共30～40个循环；最后于72℃补平300s，终止温度为4℃。

PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCR Buffer。10×PCR Buffer成分为：100mM Tris-HCl(pH 8.5)、500mM KCl、25mM MgCl₂和1.0％Triton-X-100，溶剂为ddH₂O。

具体的，所述方法如下：

(1)取待测薄壳山核桃叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测薄壳山核桃叶片的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

通常，PCR扩增体系每25μL组成如下：

或者，PCR反应体系每15μL组成如下：

PCR反应条件如下：

94℃预变性300s；95℃变性30s，56℃退火60s，72℃延伸50s，共30～40个循环；最后于72℃补平300s，终止温度为4℃；

(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶成像系统上照相，若电泳结果出现180bp的DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为Nacono；反之则否。

本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对薄壳山核桃品种Nacono进行快速鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别薄壳山核桃品种所不能替代的分子手段。

(四)附图说明

图1为对24种薄壳山核桃品种进行PCR扩增的结果；M为Takara DL2000marker；仅编号为2的薄壳山核桃品种Nacono扩增出了分子量为180bp的特异DNA条带；其余编号为其它的薄壳山核桃品种，未见有180bp大小的特异DNA条带产生。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(1)薄壳山核桃品种基因组DNA的提取：

取待测薄壳山核桃品种幼嫩叶片0.01g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得薄壳山核桃品种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化(博日Bioer，杭州，中国)后，通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(GeneQuant Pro，GE Healthcare)来检测完整性、纯度及浓度。OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：

上游引物：5′-GTCACTTCCCTTTCTCGGCA-3′；和下游引物：5′-CCCCGGGTGCAGGTATAAAA-3′，由上海生物工程技术有限公司合成。

(4)PCR扩增：

PCR反应液组成(15μL)：

2×TsingKE master mix master mix(擎科生物，北京) 7.5μL

10μM上、下游引物各0.6μL

20ng/μL模板DNA 2μL

dd H₂O 4.3μL；

扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。扩增条件：94℃预变性300s；95℃变性30s，56℃退火60s，72℃延伸50s，共30个循环；最后于72℃补平300s，终止温度为4℃。

(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物3μL，与1μL0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/mL EB的水溶液中染色30分钟，然后在Bio-rad凝胶成像系统Gel Doc上照相。

按照上述方法，分别对24个薄壳山核桃品种(编号1～24代表薄壳山核桃品种依次为：1、Moore，2、Nacono，3、Van Deman，4、Mohawk，5、Davis，6、Caddo，7、Choctaw，8、Osage，9、Mahan，10、Hirschi，11、Peruque，12、Gloria Grande，13、Sioux，14、Dependable，15、Kiowa，16、湖南1号，17、Stuart，18、Desirable，19、Pawnee，20、Elliott，21、Pyzner，22、Schley，23、Sumner，24、ShaoXing的PCR扩增图谱进行电泳检测，结果见图1。

其中仅从编号分别为2的薄壳山核桃品种Nacono中扩增出了一条清晰明亮、稳定的分子量为180bp大小的特异DNA条带，而其余编号的薄壳山核桃品种，未见有180bp大小的特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异性标记引物用于薄壳山核桃品种Nacono的早期鉴定，其稳定性、特异性非常高。

序列表

<110> 浙江省林业科学研究院

<120> 薄壳山核桃品种Nacono的特征序列、标记引物及检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 247

<212> DNA

<213> Carya illinoensis

<400> 1

aattcctccc agcatcttcc gaccggttgc ctatctcatc ctgcattgtc gtctacacct 60

ttctagtcac ttccctttct cggcattttt ctatgctagg tctagctact gggtggacag 120

tcgggcgaag cctctgatgc ttaagttagt taggagaaaa ggaatttttc tcagagtttt 180

agttgaggat tgttcgaacc acctactcgg cgctcgaagg gctgttttta tacctgcacc 240

cggggtc 247

<210> 2

<211> 180

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

gtcacttccc tttctcggca tttttctatg ctaggtctag ctactgggtg gacagtcggg 60

cgaagcctct gatgcttaag ttagttagga gaaaaggaat ttttctcaga gttttagttg 120

aggattgttc gaaccaccta ctcggcgctc gaagggctgt ttttatacct gcacccgggg 180

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

gtcacttccc tttctcggca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

ccccgggtgc aggtataaaa 20

Claims

1.薄壳山核桃品种Nacono的特征序列，其序列如下：5’-AATTCCTCCCAGCATCTTCCGACCGGTTGCCTATCTCATCCTGCATTGTCGTCTACACCTTTCTAGTCACTTCCCTTTCTCGGCATTTTTCTATGCTAGGTCTAGCTACTGGGTGGACAGTCGGGCGAAGCCTCTGATGCTTAAGTTAGTTAGGAGAAAAGGAATTTTTCTCAGAGTTTTAGTTGAGGATTGTTCGAACCACCTACTCGGCGCTCGAAGGGCTGTTTTTATACCTGCACCCGGGGTC-3’。

2.薄壳山核桃品种Nacono的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：

上游引物：5′-GTCACTTCCCTTTCTCGGCA-3′；

下游引物：5′-CCCCGGGTGCAGGTATAAAA-3′。

3.一种利用权利要求2所述的分子特异性标记引物对薄壳山核桃品种Nacono进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测薄壳山核桃品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现唯一180bp的特异DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为薄壳山核桃品种为Nacono，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5′-GTCACTTCCCTTTCTCGGCA-3′；

下游引物：5′-CCCCGGGTGCAGGTATAAAA-3′。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：94℃预变性300s；95℃变性30s，56℃退火60s，72℃延伸50s，共30～40个循环；最后于72℃补平300s，终止温度为4℃。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下：

PCR扩增体系每25μL组成如下：

PCR扩增条件如下：

(3)取步骤(2)扩增产物3μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶成像系统上照相，若电泳结果出现唯一180bp的DNA条带，则待测薄壳山核桃品种为Nacono，反之则否。