CN111088383B - 鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记及其开发方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记及其开发方法与应用，鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记IndelP146，以辣椒为物种，分子标记IndelP146的正向引物为：AGAATCCATTACTTTTGCATCCACC，分子标记IndelP146的反向引物为：GTTGACCTTTTTATAGTTTGTTGTGGG。该分子标记IndelP146适用性较强，在育种实际应用中可以利用该分子标记对辣椒青果紫色性状进行快速鉴定筛选。

Description

鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记及其开发方法与应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体来说，涉及一种鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记及其开发方法与应用。
背景技术
辣椒（Capsicum annuum L.），是世界上重要的农艺作物，因其独特的口味和营养现已成为世界上广泛栽培的蔬菜之一。辣椒果实中的叶绿素和类胡萝卜素使其呈现绿色、黄色、橙色及红色等颜色果实。在栽培辣椒种质资源中，存在几个紫果基因型，可能是一个花青素的重要来源。然而，紫色的色素沉着只出现在未成熟的果实中。紫色辣椒因富含花青素而呈现紫色，是我国比较稀有的种质资源，紫色辣椒体内含有丰富的花青素。
花青素（anthocyanins）是一类重要的水溶次生代谢物，广泛的存在于自然界中，主要分布于作物的花和果实当中，但在作物的叶、茎和种子中也都普遍存在。花青素是一种很强的抗氧化物质，能有效地阻止人和动物体内活性氧对饼心、脂类、蛋白质和其它大分子物质的氧化损害，具有预防和治疗多种疾病的作用。花青素作为一种重要的抗氧化性物质，不仅可以延长辣椒果实的耐储运性，提高其对病害的抵抗能力，同时还可提高辣椒果实的营养品质；在营养器官中，花青素则可提高辣椒对环境胁迫的抵抗能力。
近年来，提高辣椒的抗逆性及其果实营养品质一直是辣椒育种的重要目标，品质育种逐渐成为热点。紫色基因的遗传很复杂，不同植物、不同遗传背景下其显隐性和基因间的互相作用也不同，有的还存在微效基因作用。目前针对辣椒紫色性状遗传的研究很少，因此有必要分析辣椒紫色性状的遗传规律，为培育优质的紫色辣椒新品种、紫色基因的挖掘、特色农业及都市农业辣椒品种的培育奠定基础。
利用同源克隆及表达分析，在辣椒中存在多个与花青素合成相关的基因，位于不同的染色体，这些基因在不同组织中，不同程度的影响辣椒中花青素的含量。2005年，Yelena Borovsky 等通过番茄EST标签对An2基因同源克隆获得辣椒MYB A 基因，该基因编码R2R3 MYB型转录因子，为调控花青素合成过程的调控型基因，位于辣椒10号染色体，并获得一个与A基因共分离的分子标记，但未应用在花青素含量或紫色性状的鉴定及筛选中。2018年中国农业大学发表以鉴定辣椒青果期的颜色，检测辣椒基因组的SNP-78-708分子标记，准确性高，但该标记为dCAPS标记，PCR产物需要酶切后进行检测，鉴定成本较高。
目前，分子标记辅助育种仍是育种工作中一项重要辅助手段，其关键就是开发出高效的分子标记。与目标性状紧密连锁并且稳定、检测方便快捷的分子标记直接对基因型进行选择, 能极大的提高育种中选择的准确性和效率，显著缩短育种周期。因此，开发高效的分子标记对于品种改良及新品种选育具有重要意义。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记及其开发方法与应用，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
根据本发明的第一方面，提供了一种鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记IndelP146，以辣椒为物种，所述分子标记IndelP146的正向引物为：AGAATCCATTACTTTTGCATCCACC，所述分子标记IndelP146的反向引物为：GTTGACCTTTTTATAGTTTGTTGTGGG。
根据本发明的第二方面，提供了所述的鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记IndelP146的开发方法，包括以下步骤：
1）以青果紫色辣椒、青果绿色辣椒作为亲本，通过杂交获得F1，然后自交获得F2；
2）采用改良的 CTAB 法提取亲本植株及后代植株的DNA，冷冻备用；
3）采用SSR标记对调控辣椒青果基因初定位，采用SSR、CAPS及Indel 分子标记对调控辣椒青果基因精细定位，确定候选基因；
4）将克隆青果紫色辣椒亲本候选基因与克隆青果绿色辣椒亲本候选基因对比，开发出Indel分子标记IndelP146。
进一步地，步骤1）中青果紫色辣椒为母本，青果绿色辣椒为父本。
进一步地，步骤3）的具体步骤为：通过对F2群体多态性引物的统计，将候选基因定位到辣椒10号染色体SSR99、SSR103之间，候选区间内存在5个ORFs，通过5个ORFs基因功能注释及表达分析，确定候选基因。
根据本发明的第二方面，提供了所述的鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记IndelP146的应用，用于对辣椒青果紫色性状进行鉴定筛选。
本发明的有益效果：鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记IndelP146是与紫色青果基因紧密连锁的标记，该分子标记IndelP146适用性较强，在育种实际应用中可以利用该分子标记对辣椒青果紫色性状进行快速鉴定筛选，为培育优质的紫色辣椒新品种、紫色基因的挖掘、特色农业及都市农业辣椒品种的培育奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例所述的分子标记IndelP146在亲本及F1代单株中的扩增结果；
图2是47份已知基因型材料对分子标记IndelP146的验证结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
分子标记IndelP146的获得
1）试验材料：母本：3379，青果紫色（为先正达公司育成的品种“紫贵人”自交纯化的自交系，房换香，彩色甜椒日光温室栽培技术要点 [J]. 乡村科技2013(4):20-20），父本：3391，青果绿色（CM334辣椒高代自交系，徐小万等，辣椒疫病抗性资源‘CM334’的抗性遗传分析[J]. 植物保护2011(05)32-33），通过杂交获得F1，然后自交获得F2，800株F2代群体中青果紫色、青果绿色植株分别为610株和190株，经卡方检验，遗传分离符合孟德尔遗传分离比例，辣椒青果紫色性状为单基因显性遗传。
辣椒青果紫色基因定位：F2分离群体8010分离群体于2018年9月定植于中国农业大学上庄实验站温室大棚内，在青果时期调查果实颜色。
2）辣椒DNA提取：亲本植株及后代植株长至5叶一心时期，取0.5g左右叶片，采用改良的 CTAB 法提取植株总 DNA。微量分光光度计测定样品 DNA 浓度和纯度，再用 1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量，冷冻备用。
3）分子标记筛选与辣椒青果紫色基因定位：调控辣椒青果基因的初定位所用的分子标记来源于辣椒全基因组SSR标记。精细定位所用到的分子标记为SSR、CAPS及Indel 分子标记，所有引物由上海捷瑞生物公司合成。通过对800株F2群体多态性引物的统计，将候选基因定位到辣椒10号染色体SSR99、SSR103之间，两标记之间遗传距离为1.0cM，物理距离约为203.65kb。候选区间内存在5个ORFs，通过5个ORFs基因功能注释及表达分析，确定候选基因。
4）分子标记开发：克隆亲本候选基因ATG上游2000bp序列发现，与绿色亲本相比，紫色亲本ATG上游146bp处存在30个碱基序列的缺失，该位点的缺失位于辣椒基因组第10号染色体的第193359988位，根据缺失片段开发Indel标记“IndelP146”，如表1所示，所述分子标记IndelP146的正向引物SEQ ID No.1为：AGAATCCATTACTTTTGCATCCACC，所述分子标记IndelP146的反向引物SEQ ID No.2为：GTTGACCTTTTTATAGTTTGTTGTGGG。
如图1所示（M为Marker；A为青果紫色亲本；B为青果绿色亲本；C为F1代单株），该IndelP146标记在两亲本及F2代单株间具有稳定的多态性，在亲本间差异明显。图1表明：分子标记IndelP146在纯合青果紫色基因组DNA扩增产物大小为178bp，在纯合青果绿色基因组DNA 扩增产物大小为208bp，利用多态性分子标记IndelP146鉴定800株F2群体的基因型，与青果紫色、青果绿色特异性条带一致的分别为592株、218株，约97.05%与田间调查表型一致，遗传距离为1.0 cM，说明IndelP146是与紫色青果基因紧密连锁的标记。
表1. IndelP146 引物序列
Indel标记 正向引物SEQ ID No.1 反向引物SEQ ID No.2
IndelP146 AGAATCCATTACTTTTGCATCCACC GTTGACCTTTTTATAGTTTGTTGTGGG
实施例2
分子标记IndelP146的应用
试验材料：用如表2所示的47份已知青果颜色表型的辣椒自交系品种，对分子标记IndelP146的适用性进行验证。所用自交系品种可从中国农业大学园艺学院获得。
表2. 47份已知青果颜色辣椒自交系品种
编号 自交系/品种名称 已知青果颜色 分子标记的鉴定结果
1 2458 紫色 紫色
2 2459 绿色 绿色
3 2460 绿色 紫色
4 2461 紫色 紫色
5 2463 绿色 绿色
6 2464 紫色 紫色
7 2465 绿色 绿色
8 2466 绿色 绿色
9 2467 绿色 绿色
10 2468 绿色 绿色
11 2469 绿色 绿色
12 2471 绿色 绿色
13 2472 绿色 绿色
14 2473 绿色 绿色
15 2474 绿色 绿色
16 2475 绿色 绿色
17 2477 绿色 紫色
18 2479 绿色 绿色
19 2480 紫色 紫色
20 2481 绿色 绿色
21 2483 绿色 绿色
22 2488 绿色 绿色
23 2490 绿色 绿色
24 2491 绿色 绿色
25 2492 绿色 绿色
26 2493 绿色 绿色
27 2494 绿色 绿色
28 2495 绿色 绿色
29 2501 绿色 绿色
30 2503 绿色 绿色
31 2504 绿色 绿色
32 2505 绿色 绿色
33 2506 紫色 紫色
34 2507 绿色 绿色
35 2508 紫色 紫色
36 2111 绿色 绿色
37 2113 绿色 绿色
38 2115 绿色 绿色
39 2116 绿色 绿色
40 2117 绿色 绿色
41 2220 绿色 绿色
42 2221 绿色 绿色
43 2223 绿色 绿色
44 2225 绿色 绿色
45 2226 绿色 绿色
46 2228 绿色 绿色
47 2229 绿色 绿色
试验方法：利用分子标记IndelP146对上述供试材料进行基因型检测，模板为上述供试材料的基因组DNA。
PCR反应体系（10 μL）为：DNA工作液1 μL、10×Buffer缓冲液5 μL、dNTPs 0.4 μL、DNA聚合酶0.2 μL、正向引物和反向引物各0.5 μL（10uM/L），用2.4 μL ddH2O将总体积补齐至10 μL。
PCR扩增反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5 min。PCR产物用7%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。
结果如图2所示（A为青果紫色亲本；B为青果绿色亲本；C为F1代；1-47为47份自交系材料），分子标记IndelP146在鉴定47份辣椒自交系和品种的青果紫色性状中，特异性条带统计结果有2份材料青果颜色与表型不同，其余基因型与表型完全一致，正确率为95.74%，表明，该分子标记适用性较强，在育种实际应用中可以利用该标记对辣椒青果紫色性状进行快速鉴定筛选。
综上所述，鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记IndelP146是与紫色青果基因紧密连锁的标记，该分子标记IndelP146适用性较强，在育种实际应用中可以利用该分子标记对辣椒青果紫色性状进行快速鉴定筛选。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 绿亨科技集团股份有限公司
<120> 鉴定辣椒青果紫色基因的分子标记及其开发方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaatccatt acttttgcat ccacc 25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgaccttt ttatagtttg ttgtggg 27

Claims (2)

1.引物对在鉴定辣椒青果紫色或绿色性状中的应用，以辣椒为物种，其特征在于，所述引物对的正向引物为：AGAATCCATTACTTTTGCATCCACC，所述引物对的反向引物为：GTTGACCTTTTTATAGTTTGTTGTGGG，扩增产物仅出现178bp条带或同时出现208bp和178bp两条带的为辣椒青果紫色，扩增产物仅出现208bp条带的为辣椒青果绿色。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物对的开发方法包括以下步骤：
1）以青果紫色辣椒、青果绿色辣椒作为亲本，青果紫色辣椒为母本，青果绿色辣椒为父本，通过杂交获得F1，然后自交获得F2；
2）采用改良的 CTAB 法提取亲本植株及后代植株的DNA，冷冻备用；
3）采用SSR标记对调控辣椒青果基因初定位，采用SSR、CAPS及Indel 分子标记对调控辣椒青果基因精细定位，确定候选基因,具体步骤为：通过对F2群体多态性引物的统计，将候选基因定位到辣椒10号染色体SSR99、SSR103之间，候选区间内存在5个ORFs，通过5个ORFs基因功能注释及表达分析，确定候选基因；
4）将克隆青果紫色辣椒亲本候选基因与克隆青果绿色辣椒亲本候选基因对比，开发出所述引物对。
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