CN112725515A - 一种蝴蝶兰花底色snp分子标记引物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蝴蝶兰花底色SNP分子标记引物组合物及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明基于SLAF‑BSA技术，筛选得到2个与蝴蝶兰花黄白底色相关的SNP分子标记Marker35886和Marker70907，并在F1代群体及其他种质资源中进行验证，可准确、高效、稳定的鉴定蝴蝶兰花底色，且操作简便，为蝴蝶兰分子标记辅助育种及花色改良基因工程提供理论支持，也为采用SLAF‑BSA技术筛选兰科植物复杂性状相关标记提供了新的思路。

Description

一种蝴蝶兰花底色SNP分子标记引物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰花底色SNP分子标记引物组合物及其应用。
背景技术
蝴蝶兰(Phalaenopsis)为兰科(Orchidaceae)蝴蝶兰属(Phalaenopsis)常绿草本植物，热带气生兰，花型奇特优美，是盆栽、切花两用花卉，素有“洋兰皇后”的美称。蝴蝶兰属是兰科商品化程度最高的属，具极高的观赏价值和商业价值，是全球最重要的观赏花卉之一。而花色是观赏花卉最重要的性状评价指标之一，直接影响其观赏价值和商业价值。有别于绝大多数观赏花卉的单色花和少数复色花，蝴蝶兰的花瓣和萼片具丰富的颜色分布类型，除匀色花外，绝大多数种质资源花瓣和萼片为双色，可分为底色和斑色，一般底色为整朵花的主色，斑色的颜色分布类型包括阴影、镶边、条纹、线纹、网纹、斑点、斑块、阴影和镶边、线纹和斑点、镶边和线纹、镶边与线纹和斑点。植物花色属于复杂的数量性状，受多基因控制，遗传基础复杂。蝴蝶兰原生种众多，商品品种经过一百多年的杂交选育，血统复杂，与原生种参考基因组的比对效率极低，且花色调控机制极为精细，通过转录组和简化基因组测序挖掘性状相关基因和关联分子标记仍然是目前研究商品品种花色遗传机制的重要手段，但尚未开发出花色相关分子标记。
SLAF(specific-locus amplified fragment sequencing，特异位点扩增片段测序)是一种根据物种个性化设计方案的简化基因组测序技术，能够获取全基因组范围内的多态性标签并快速准确筛选性状关联SNP(single-nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)。BSA(bulked segregant analysis，群分法)与SLAF的结合，能够进一步加快对复杂性状定位的速度，目前已在水稻黄叶转绿基因定位、玉米果皮纤维素含量相关基因定位、大豆酸性磷酸酶活性候选基因挖掘及功能标记开发、大豆半矮秆基因定位、红麻第一花节位置相关SNP筛选、辣椒果实花青素积累相关基因定位、紫薇矮化性状相关SNP标记筛选等相关研究得到成功运用。SLAF-BSA技术目前在兰科植物上还没有应用，但Lu等单独利用SLAF技术成功构建了一张包含了8573个SLAF标签的石斛兰高密度遗传谱，并筛选出5个与石斛多糖含量相关的QTL；Wang等利用SLAF技术对文心兰长期继代培养中的体细胞无性系变异进行鉴定和筛选，证明SLAF技术在兰科植物上适用。
花色主要由花朵中花青素、类胡萝卜素及甜菜色素的含量及分布决定，并且还受到色素细胞的pH值、金属离子、辅助色素及花瓣表皮细胞形态等因素的影响。目前，蝴蝶兰花朵中主要花色素的合成途径已较为清楚，关键结构基因和调控转录因子陆续被克隆和研究，但对整体调控机制的解析仍然很浅。研究发现，绝大部分花青素合成途径相关结构基因和转录因子的表达量在红色蝴蝶兰花瓣中都显著高于白色蝴蝶兰，UFGT基因与红花的形成高度相关，PeMyb2、PeMyb11和PeMyb12的不同表达比例会造成红花蝴蝶兰花瓣的不同颜色分布类型，沉默PeMyb2、PeMyb11和PeMyb12会分别导致整体红色、红色斑纹和红色脉络的消失。黄色蝴蝶兰花瓣中F3’H、UF3GT、bHLH的表达量低于红色蝴蝶兰花瓣中的表达量，但PAL和PSY的表达量高于红色蝴蝶兰花瓣中的表达量。紫色蝴蝶兰(Phalaenopsisschilieriana)花瓣中DFR的表达水平高于白色蝴蝶兰。基于这些关键结构基因和调控转录因子的研究，Sudarsono等开发了一系列针对花色相关基因的SNP引物，并用于30份蝴蝶兰种质资源的聚类分析。但蝴蝶兰分子标记目前主要还是用于种质资源的亲缘关系鉴定和品种鉴别上，很少有能够与性状关联的标记被开发出来。专利CN110628781A公开了两种兰花中促进花色苷形成的R2R3MYB转录因子，所述转录因子从卡特兰中分离鉴定得到，与兰科植物花朵红色形状有关。但研究发现，上述基于花色相关结构基因开发的SNP未能根据花色将不同颜色的蝴蝶兰资源区分开，表明兰科植物花色形成和调控机制极其复杂且具有特异性，花色相关SNP的筛选不能局限于个别已知相关基因，需扩大到全基因组范围内进行。专利CN111979349A则公开了一种控制莲花色形状的主效QTL和SNP分子标记位点及其检测引物和应用，可用于高效选择目标花色的莲品种及子莲和藕莲的分子标记辅助育种。
蝴蝶兰花底色直接决定整株花的主色调，且在传统杂交育种过程中发现底色与斑色是互不干扰的2个独立遗传性状。因此，细化花色这一复杂性状，针对性地筛选与底色相关的分子标记，去除斑色的干扰，能够更精准获取与单个性状相关联的分子标记，为辅助育种提供更精确有效的筛选依据。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种蝴蝶兰花底色SNP分子标记引物组合物及其应用。本发明基于SLAF-BSA技术，对2个亲本和杂交F1代构建的2个极端性状混池(黄色底色混池和白色底色混池)DNA文库进行简化基因组测序，与花底色性状进行关联分析筛选相关标记位点，并在F1代群体及其他种质资源中进行验证，为蝴蝶兰分子标记辅助育种及花色改良基因工程提供理论支持。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种蝴蝶兰花底色SNP分子标记引物组合物，所述的SNP分子标记包括Marker35886和Marker70907。
具体地，所述的Marker35886的扩增序列为SEQ ID NO:7所示的序列，所述的Marker35886的碱基位置为所述扩增序列的第60位碱基；所述的Marker70907的扩增序列为SEQ ID NO:8所示的序列，所述的Marker70907的碱基位置为所述扩增序列的第147位碱基。
具体地，所述的引物组合物包括：
(1)SNP分子标记Marker35886的预扩增引物：
SEQ ID NO:1：Marker35886-F：5'-ACATGCGACGTCGAGATACC-3'；
SEQ ID NO:2：Marker35886-R：5'-GAATCCAAACTGGCGCTG-3'；
(2)SNP分子标记Marker70907的预扩增引物：
SEQ ID NO:3：Marker70907-F：
5'-GATAAAATTTTTAACATTATGGTTTAG-3'；
SEQ ID NO:4：Marker70907-R：5'-TAACCATGAAATTGCTCCATC-3'。
进一步具体地，所述的引物组合物还包括：
(1)SNP分子标记Marker35886的延伸引物：
SEQ ID NO:5：Marker35886-F2：
5'-tttttttttttttttttttttttttttttttttttttGGGTGCATTTGTAGAATGCC-3'；
(2)SNP分子标记Marker70907的延伸引物：
SEQ ID NO:6：Marker70907-F2：
5'-ttttttttttttttttttttttttttttttttAACGATTTGTCCTCACTCATTTT-3'。
另一方面，本发明提供了一种用于鉴定蝴蝶兰花底色的产品，所述的产品包括上述引物组合物。
具体地，所述的产品为独立试剂或试剂盒。
又一方面，本发明提供了上述引物组合物或产品在蝴蝶兰花底色鉴定或种质资源鉴定中的应用。
又一方面，本发明提供了一种上述SNP分子标记的筛选方法，所述的方法包括以下步骤：以蝴蝶兰黄色底色DNA混池和白色底色DNA混池为模板，以水稻基因组作为参考，利用酶切反应预测软件进行系统分析，根据其重复序列、GC含量和基因特点等采用双酶切对样本基因组DNA分别进行酶切。得到的酶切片段进行3’端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后进行测序。对测序得到的各样品的reads数据进行评估，通过reads间聚类的方法，在亲本和混池中开发SNP分子标记。
又一方面，本发明提供了一种蝴蝶兰花底色鉴定或种质资源鉴定的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)待测植株总DNA提取；
(2)以步骤(1)提取的总DNA作为模板进行SNP分子标记预扩增、酶切、延伸扩增；
(3)测序检测。
具体地，步骤(2)中所述的预扩增采用的反应体系为：2μL(20ng/μL)样本基因组DNA、1μL 10×Buffer I、0.8μL dNTP、2μL预扩增引物(F+R，5μmol/L)、0.1μLKAPATaqHotStart DNA聚合酶(5U/μL)、4.1μL ddH2O；预扩增采用的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min。
进一步具体地，所述的预扩增引物为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的引物。
具体地，步骤(2)中所述的酶切采用的反应体系为：4μL预扩增产物，1.33μL SAP酶，0.27μLExoI酶(20U/μL)；酶切采用的反应程序为：37℃酶切1h，75℃变性20min。
具体地，步骤(2)中所述的延伸扩增采用的反应体系为：1.2μL酶切产物、2μL延伸扩增引物混合物、0.5μLABI Mix、0.4μL 10×Buffer I和0.9μL ddH2O；延伸扩增采用的反应程序为：96℃10s、50℃5s、60℃30s，共30个循环。
进一步具体地，所述的延伸扩增引物为SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6所示的引物。
又一方面，本发明还提供了上述引物组合物或产品在分子标记辅助育种中的应用。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
1、本发明利用SLAF-BSA技术首次筛选得到2个与蝴蝶兰花黄白底色相关的SNP分子标记Marker35886和Marker70907，为采用SLAF-BSA技术筛选兰科植物复杂性状相关标记提供了新的思路。
2、本发明提供了一种蝴蝶兰花底色SNP分子标记及其引物组合物，可准确、高效、稳定的鉴定蝴蝶兰花底色，且操作简便。
3、本发明所述的蝴蝶兰花底色SNP分子标记可用于蝴蝶兰辅助选择育种，实现苗期提前选择，从而加快蝴蝶兰属的育种进程。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学用语均具有本领域技术人员通常理解的含义。
以下为本发明所用试剂及仪器：
主要试剂：SNaPshot相关
Figure BDA0002948927170000051
SNaPshotTM Multiplex Kit试剂盒(ABI)；TaqHotStart DNA Polymerase(Kapabiosystems公司)；SAP酶(Fermentas公司)；ExoI酶、RsaI酶、HaeIII酶和CIP酶(NEB)。
主要仪器：NanoDrop 2000(Thermo公司，美国)；HiSeqTM2500测序平台(Illumina公司，美国)；Beckman Allgre 21R高速冷冻离心机(Beckman公司，美国)；BC-subMIDI电泳仪(北京六一仪器厂)；JY300C电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)；BioSens SC 810B凝胶成像仪(上海山富科学仪器有限公司)；PTC-100PCR仪(MJ Research公司，美国)；3730XL测序仪(ABI公司，美国)。
实施例1蝴蝶兰属种质资源
以‘黄金豹’蝴蝶兰(PhalaenopsisFrigdaas Oxford)为母本，‘白天使’蝴蝶兰(Phalaenopsis Join Angel)为父本构建杂交群体，共获得505个杂交后代，黄色底色个体与白色底色个体的比例为273:232。后代可根据底色和斑色分为11个组(性状分离及分组具体详见《蝴蝶兰Phalaenopsis'Frigdaas Oxford'和Phal.316杂交F1代性状分离研究》一文)。从分组Group02、Group04、Group06、Group08、Group10这5个黄色底色群体中随机选取33个单株加上Group11中的2个单株组成黄色底色混池，从分组Group01、03、05、07、09这5个白色底色群体中对应数量随机选取35个单株组成白色底色混池，其中与黄色底色混池Group11中的2个单株对应的样品选自斑纹最少的Group03。所有实验材料均栽培保存于广东省农业科学院环境园艺研究所白云基地兰花资源圃中，于2018年采用打孔方式分别采集等量叶片组织，4℃保存备用。
实施例2SNP分子标记筛选
1.基因组DNA提取及混池构建
提取样品基因组DNA，1％琼脂糖电泳和NanoDrop 2000检测DNA的完整性和纯度。经纯度和完整性检验合格后将黄色底色单株和白色底色单株DNA分别等量混合成终浓度为40ng/μL的黄色底色DNA混池和白色底色DNA混池，用于后续SLAF测序。
按照天根生物科技(北京)有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒操作步骤进行蝴蝶兰植株总DNA的提取，具体步骤如下：
(1)取蝴蝶兰植株叶片组织加入液氮充分研磨，称取植物新鲜组织约100mg。
(2)向研磨好的粉末中迅速加入400μL缓冲液GPS和10μL RNase A(10mg/mL)，迅速涡旋混匀后，将离心管放在65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次。
(3)加入100μL缓冲液GPA，涡旋震荡1min，12000rpm离心5min，转移上清至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中)，然后12000rpm离心1min，转移滤液至新的离心管中。
(4)加入等体积的无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都转移到RNase-Free吸附柱CR2中(吸附柱CR2放在收集管中)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将RNase-Free吸附柱CR2放入收集管中。
(6)向RNase-Free吸附柱CR2中加入550μL去蛋白液RD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将RNase-Free吸附柱CR2放入收集管中。
(7)向RNase-Free吸附柱CR2中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将RNase-Free吸附柱CR2放入收集管中。
(8)重复步骤(7)。
(9)将RNase-Free吸附柱CR2放回收集管中，12000rpm离心2min，弃收集管，然后将RNase-Free吸附柱CR2转移到新的离心管中，室温晾干5-10min。
(10)在RNase-Free吸附柱CR2中加入50-100μL洗脱缓冲液TB，室温放置3-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
(11)取2μL DNA用于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μL DNA用于NanoDrop分光光度计测浓度。
2.文库构建、测序及SLAF标签开发
通过预实验发现已有的小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsisequestris)基因组对本发明采用的种质资源的参考性极低，因此以水稻基因组作为参考，利用酶切反应预测软件SLAF_Predict进行系统分析，根据其重复序列、GC含量和基因特点等确定采用RsaI+HaeIII双酶切对样本基因组DNA分别进行酶切。得到的酶切片段进行3’端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500测序平台进行测序。对测序得到的各样品的reads数据进行评估，通过reads间聚类的方法，在亲本和混池中开发SLAF标签。
经IlluminaHiSeq TM 2500测序平台进行测序，对父本、母本、白色底色混池和黄色底色混池测序数据的reads数量、Q30和GC含量等进行统计，共获得37.90M reads数据，测序平均Q30为92.57％，平均GC含量为38.47％，具体结果见下表1。测序质量值Q30是评估高通量测序单碱基错误率的重要指标，测序质量值越高对应的碱基测序错误率越低，本发明4个样本的测序质量值Q30均在90％以上，说明测序碱基错误率低，所获数据合格。
表1样品测序数据评估和SLAF标签统计
Figure BDA0002948927170000081
3.SNP_index关联分析
3.1.原理：SNP_index是通过寻找混池之间基因型频率的显著差异，用Δ(SNP_index)统计进行标记关联分析的一种方法。Marker与性状关联度越强，Δ(SNP_index)越接近于1。以0.99百分位点0.7455作为阈值，大于该阈值的标记则为与性状显著关联的标记。计算方法如下：
SNP_index(ab)＝Mab/(Pab+Mab)
SNP_index(aa)＝Maa/(Paa+Maa)
Δ(SNP_index)＝SNP_index(aa)-SNP_index(ab)
式中：Maa和Paa分别表示白色底色群体(aa)来源于母本和父本的深度，Mab和Pab分别表示黄色底色群体(ab)来源于母本和父本的深度。
测序深度计算方法：测序深度根据测序数据统计所得，例如Maa表示白色底色群体(aa)来源于母本的深度，即aa群体测序得到的reads中在某一个碱基位点上与母本在这个位点碱基相同的数量。
3.2.SLAF标签和SNP标记的开发：参照上表1，本发明共开发出164874个SLAF标签，SLAF标签亲本平均测序深度为42.05×，混池平均测序深度为46.00×。其中父本的测序深度为52.41×，母本的测序深度为31.68×，aa池的平均测序深度为54.17×，ab池的平均测序深度为37.82×。针对所有样本开发得到的SLAF标签，根据等位基因数和基因序列之间的差异进行多态性分析，共得到3种类型的SLAF标签：包含SNP和/或Indel多态性位点的多态型SLAF标签，没有多态性位点的非多态性SLAF标签，位于重复序列区的SLAF标签。其中多态性SLAF标签共有21031个，多态性比例为12.76％。
3.3.根据亲本基因型来源对得到的21031个多态性SLAF标签，进行标记筛选。过滤亲本测序深度5×以下的标记，根据亲本的测序信息确定每个标记等位基因的亲本来源，选取一种基因型来源于父本，另一种基因型来源于母本的多态性SLAF标签共1451个进行后续的关联分析。通过SNP_index的方法，以0.99百分位点0.7455作为阈值，筛选出15个与性状关联程度较显著的候选标记，含27个SNP位点，见下表2。
表2与性状关联的SNP位点
Figure BDA0002948927170000091
Figure BDA0002948927170000101
注：A，T，C，G表示测到的碱基，紧随其后的数字表示该碱基的测序深度。
4.SNaPshot技术筛选SNP分子标记
对于上表2获得的SNP位点设计引物，在父母本、后代11个组群中每组挑选1株未在实施例1中使用的子代和2个白色底色种质资源、2个黄色底色种质资源中筛选底色相关SNP标记。
预扩增采用10μL反应体系：2μL(20ng/μL)样本基因组DNA、1μL 10×BufferI、0.8μL dNTP、2μL预扩增引物(F+R，5μmol/L)、0.1μL KAPA TaqHotStart DNA聚合酶(5U/μL)、4.1μL ddH2O。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火(50-60℃)30s，72℃延伸30s，共10个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min。取2μL产物上2％琼脂糖凝胶电泳检测质量。每个样本的预扩增产物等比例混合后取4μL，加入SAP酶1.33μL，ExoI酶(20U/μL)0.27μL混合成5.6μL体系，37℃酶切1h，75℃变性20min。取酶切后产物1.2μL，加2μL延伸引物混合物、0.5μL ABI Mix、0.4μL 10×Buffer I和0.9μL ddH2O，96℃10s、50℃5s、60℃30s，共进行30个循环的延伸反应。取延伸反应产物6μL加入1μL CIP酶，37℃1h，75℃15min进行纯化。96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5:8.5)9μL，纯化后延伸产物1μL，95℃变性3min，上3730XL测序仪检测。
通过对父母本、11个子代代表株和4个不同底色种质资源的基因组DNA模板进行扩增和检测，筛选出2对SNP位点Marker35886和Marker70907的引物。详见下表3。所述的Marker35886的扩增序列如SEQ ID NO:7所示，所述Marker35886的碱基位置为SEQ ID NO:7所示扩增序列的第60位碱基；所述的Marker70907的扩增序列如SEQ ID NO:8所示，所述的Marker70907的碱基位置为SEQ ID NO:8所示扩增序列的第147位碱基。
表3 SNaPshot测序中Marker35886和Marker70907相关引物序列信息
Figure BDA0002948927170000102
Figure BDA0002948927170000111
注：延伸引物5'的多个t为保护碱基。
对比例1
因上表2筛选得到的与性状关联的SNP位点较多，以Marker146372和Marker98278为例作为对比例，其相关引物序列信息如下表4所示。
表4 SNaPshot测序中Marker146372和Marker98278相关引物序列信息
Figure BDA0002948927170000112
实验例1准确性验证
在父母本、后代11个组群中每组挑选1株未在实施例1中使用的子代和2个白色底色种质资源、2个黄色底色种质资源中验证实施例2和对比例1所述的底色相关SNP分子标记及其引物组合物。检测结果如下表5所示。
表5检测结果
Figure BDA0002948927170000113
Figure BDA0002948927170000121
检测效率计算：例如，结果显示母本(黄色底色)Marker35886这个位点为CT，父本(白色底色)Marker35886这个位点为C，那么其余样本如果底色为黄(或浅黄)，检测结果为CT认为检测准确，同理底色为白色，检测结果为C认为检测准确。单独位点的检测效率＝该位点检测准确的样本数/总样本数。2个位点的联合检测效率＝2个位点任意一个检测准确或2个都检测准确的样本数/总样本数。
由表5可知，本发明实施例2中所述的Marker35886和Marker70907的鉴定效果较好，在父母本中的SNP检测结果与SLAF测序结果一致，而在其他种质资源中的检测率分别达到70.6％和76.5％，2个引物联合使用的检测率达到94.1％。而Marker146372和Marker98278的检测效率仅47.1％和23.5％。
实验例2重复性验证
选取实验例1中的样本，选用同一批试剂盒，对每个样本重复检测3次，检测本发明所述SNP分子标记及其引物组合物的重复性。结果如下表6所示。
表6检测结果
Figure BDA0002948927170000122
Figure BDA0002948927170000131
由表6可知，本申请所述的SNP分子标记及其引物组合物的重复性较好。
实验例3精密度验证
选取实验例1中的样本，选取3批试剂盒进行检测，验证本发明所述SNP分子标记及其引物组合物的精密度。结果如下表7所示。
表7检测结果
Figure BDA0002948927170000132
由表7可知，本申请所述的SNP分子标记及其引物组合物的精密度较好。
本发明所述的SNP分子标记可用于辅助选择育种，实现苗期提前选择，从而加快蝴蝶兰属的育种进程。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省农业科学院环境园艺研究所
<120> 一种蝴蝶兰花底色SNP分子标记引物组合物及其应用
<130> 20210222
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
acatgcgacg tcgagatacc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gaatccaaac tggcgctg 18
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
gataaaattt ttaacattat ggtttag 27
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
taaccatgaa attgctccat c 21
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttggg tgcatttgta gaatgcc 57
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttaacgattt gtcctcactc atttt 55
<210> 7
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(90)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
aacatgcgac gtcgagatac cagcaaagac atcagtcacg ggtgcatttg tagaatgcct 60
ggactgcagc gttctacatc nnnnnnnnnn acagagtcca ggatcataca tcccactcga 120
gactgaatct catattttgg atcggtcagc gccagtttgg attcccatca 170
<210> 8
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(90)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
aagataaaat ttttaacatt atggtttaga atattcttaa atatcttcat agggttcaca 60
aaatttctat ttttgccatc nnnnnnnnnn ataaagttac tttatctatc attgaagatg 120
tggaacgatt tgtcctcact catttttgga tggagcaatt tcatggttag 170
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
aaaaaatctc tctgggtttt ctg 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
ttaagggtgt tcgatcatgg t 21
<210> 11
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttc tctgggtttt ctgatatagt 60
agtc 64
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
tagctttaat tttcaccgcc 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
tgaaagtgag tgctctgtga ga 22
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttgt tccccttctt gctatcaatg 60

Claims (10)

1.一种蝴蝶兰花底色SNP分子标记的引物组合物，其特征在于：所述的SNP分子标记包括Marker35886和Marker70907。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述的Marker35886的扩增序列为SEQ ID NO:7所示的序列，所述的Marker35886的碱基位置为所述扩增序列的第60位碱基；所述的Marker70907的扩增序列为SEQ ID NO:8所示的序列，所述的Marker70907的碱基位置为所述扩增序列的第147位碱基。
3.根据权利要求2所述的引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物包括：
(1)SNP分子标记Marker35886的预扩增引物：
SEQ ID NO:1：Marker35886-F：5'-ACATGCGACGTCGAGATACC-3'；
SEQ ID NO:2：Marker35886-R：5'-GAATCCAAACTGGCGCTG-3'；
(2)SNP分子标记Marker70907的预扩增引物：
SEQ ID NO:3：Marker70907-F：
5'-GATAAAATTTTTAACATTATGGTTTAG-3'；
SEQ ID NO:4：Marker70907-R：5'-TAACCATGAAATTGCTCCATC-3'。
4.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物还包括：
(1)SNP分子标记Marker35886的延伸引物：
SEQ ID NO:5：Marker35886-F2：
5'-tttttttttttttttttttttttttttttttttttttGGGTGCATTTGTAGAATGCC-3'；
(2)SNP分子标记Marker70907的延伸引物：
SEQ ID NO:6：Marker70907-F2：
5'-ttttttttttttttttttttttttttttttttAACGATTTGTCCTCACTCATTTT-3'。
5.一种用于鉴定蝴蝶兰花底色的产品，其特征在于：所述的产品包括权利要求1-4任一项所述的引物组合物。
6.权利要求1-4任一项所述的引物组合物或权利要求5所述的产品在蝴蝶兰花底色鉴定或种质资源鉴定中的应用。
7.一种权利要求1所述的SNP分子标记的筛选方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：以蝴蝶兰黄色底色DNA混池和白色底色DNA混池为模板，以水稻基因组作为参考，利用酶切反应预测软件进行系统分析，根据其重复序列、GC含量和基因特点等采用双酶切对样本基因组DNA分别进行酶切，得到的酶切片段进行3’端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后进行测序，对测序得到的各样品的reads数据进行评估，通过reads间聚类的方法，在亲本和混池中开发SNP分子标记。
8.一种蝴蝶兰花底色鉴定或种质资源鉴定的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
(1)待测植株总DNA提取；
(2)以步骤(1)提取的总DNA作为模板进行SNP分子标记预扩增、酶切、延伸扩增；
(3)测序检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的预扩增采用的反应体系为：2μL样本基因组DNA、1μL10×Buffer I、0.8μL dNTP、2μL预扩增引物、0.1μL KAPATaqHotStart DNA聚合酶5U/μL、4.1μL ddH2O；预扩增采用的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min；所述的预扩增引物为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的引物；
步骤(2)中所述的酶切采用的反应体系为：4μL预扩增产物，1.33μL SAP酶，0.27μLExoI酶；酶切采用的反应程序为：37℃酶切1h，75℃变性20min；
步骤(2)中所述的延伸扩增采用的反应体系为：1.2μL酶切产物、2μL延伸扩增引物混合物、0.5μLABI Mix、0.4μL 10×Buffer I和0.9μL ddH2O；延伸扩增采用的反应程序为：96℃10s、50℃5s、60℃30s，共30个循环；所述的延伸扩增引物为SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6所示的引物。
10.权利要求1-4任一项所述的引物组合物或权利要求5所述的产品在分子标记辅助育种中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003031937A2 (en) * 2001-10-12 2003-04-17 Morphotek, Inc. Genetic hypermutability of plants for gene discovery and diagnosis
CN107058487A (zh) * 2016-12-29 2017-08-18 广东省农业科学院环境园艺研究所 一种利用Genomic‑SSR和EST‑SSR两类标记鉴评蝴蝶兰遗传多样性的方法
CN108441576B (zh) * 2018-04-24 2019-05-07 中国农业科学院作物科学研究所 大豆抗炸荚主效QTLqPD05及其定位方法和应用
WO2019210696A1 (zh) * 2018-05-03 2019-11-07 北京林业大学 梅花垂枝性状snp分子标记及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003031937A2 (en) * 2001-10-12 2003-04-17 Morphotek, Inc. Genetic hypermutability of plants for gene discovery and diagnosis
CN107058487A (zh) * 2016-12-29 2017-08-18 广东省农业科学院环境园艺研究所 一种利用Genomic‑SSR和EST‑SSR两类标记鉴评蝴蝶兰遗传多样性的方法
CN108441576B (zh) * 2018-04-24 2019-05-07 中国农业科学院作物科学研究所 大豆抗炸荚主效QTLqPD05及其定位方法和应用
WO2019210696A1 (zh) * 2018-05-03 2019-11-07 北京林业大学 梅花垂枝性状snp分子标记及其应用

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