KR101735244B1 - 무의 추대시기 판별용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 무의 추대시기 판별용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 무의 추대시기 판별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 무의 추대시기를 판별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 무의 추대시기 판별방법을 제공한다.

Description

무의 추대시기 판별용 마커 및 이의 용도{Marker for discriminating bolting time in radish and uses thereof}

본 발명은 무의 추대시기 판별용 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

국내 채소종자 시장 규모는 2013년 약 2,613억원이며, 이 중 무는 458억원 규모로 고추에 이어 함께 단일종자로 매출규모 2위 종자이다. 무의 종자 시장규모는 2008년 약 240억, 2010년 270억 규모로 2013년까지 지속적인 상승세를 보이고 있다. 무를 포함한 십자화과 채소 작물에서 자가불화합과 웅성불임성을 이용한 F1 일대잡종 육성기술은 국내 종자회사가 세계적인 수준이나 무의 분자유전학적 연구 유전체 연구는 매우 미진한 실정이다. 특히 무 육종의 세대단축 기술 및 주요형질에 관여하는 분자마커 연구는 매우 미진한 수준이고, 무 육종 기술수준의 우위를 지키면서 국제 경쟁력을 확보하기 위해서는 분자육종 기술과 유전체정보를 이용한 육종 시스템 도입이 반드시 발전되고 실용화가 되어야 한다.

개화(flowering)는 식물이 영양생장단계에서 생식생장단계로 전환되는 것을 의미하며 무와 같은 식물의 경우는 추대형성으로 대변되기도 한다. 개화는 광주기, 온도(춘화처리), 호르몬 및 자율적 경로(autonomous pathway) 등에 의해 조절되는데 주로 광주기와 온도가 주 환경요인이 된다. 개화관련 경로에 관여하는 많은 유전자들과 miRNA들이 애기장대 등에서 잘 밝혀져 왔다. 개화시기(flowering time)는 곡류작물의 생산성과 직결되고, 배추, 무와 같은 채소작물 생산성 및 수확시기에 영향을 준다. 무의 경우 조기 추대는 생산성 감소 및 상품의 질을 떨어뜨리기 때문에 재배시즌에 따른 개화 및 추대형성 문제가 발생하므로 조기추대와 만기추대를 구별하는 마커의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 한국공개특허 제2013-0106550호에서는 '배추과 작물의 추대시기 판별용 마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1361296호에서는 '무의 위황병 저항성 연관 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 무 품종 선발 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 무의 추대시기 판별용 마커 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 추대시기가 다른 조추대와 만추대 두 계통의 무를 이용하여 만든 분리집단을 육성 및 표현형을 검정하여 추대시기 형질에 관여하는 R2 염색체에 위치한 QTL을 찾아내고, 이를 근거로 개발한 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과, PCR 산물의 크기 차이로 인해 무의 추대시기 구별이 가능한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 무의 추대시기 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 무의 추대시기를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 무의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는, 무의 추대시기 판별방법을 제공한다.

본 발명에서 개발한 프라이머 세트를 이용하여 효과적으로 조추대 또는 만추대 계통 무를 간편하게 판별할 수 있으며, 무의 추대시기를 간편하게 분석할 수 있어 무의 개화시기 조절 및 재배시기 선택에 용이하게 적용할 수 있고, 육종시 유묘시기에 개화성질을 파악할 수 있어 육종의 시간을 크게 단축하여 종자산업의 활성에 크게 기여할 수 있다.

도 1은 조추대 계통과 만추대 계통으로부터의 F2 집단의 개화시기 분포를 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 조추대 계통과 만추대 계통으로부터의 F2 집단의 유전체 분석 결과 얻은 1146개의 SNP의 염색체 내 위치를 나타낸다. 각각의 색깔은 애기장대의 5개의 염색체와 상동성을 나타낸다.
도 3은 QTL 맵핑 결과 R2 및 R6 염색체에서의 QTL을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 F2 집단의 PCR 분석 결과를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 무의 추대시기 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 또는 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상 또는 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 무의 추대시기를 판별하기 위한 마커로 이용된다. 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR를 수행하면 조추대와 만추대 DNA가 서로 다른 크기로 증폭된 산물을 얻을 수 있고 이를 이용하여 추대를 판별할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 PCR를 수행하면, 조추대 계통 NH-JS2와 만추대 계통 NH-JS1은 각각 59bp, 68bp 크기로 증폭되므로 무의 추대시기는 PCR 산물의 크기 차이로 구별이 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 무의 추대시기를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은

a) 무에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 무의 추대시기 판별방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 무에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, DNA 추출 키트(바이오니아사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 증폭 산물의 검출 단계에서, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트는 F2 개체에서 R2 염색체의 QTL 근처의 SSR을 탐지하여 59bp 및/또는 68bp 크기의 PCR 산물을 생성한다. 증폭 산물을 전기영동함으로써 조추대 및 만추대 무를 판별할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 조추대 및 만추대 계통을 이용한 F2 집단 육성 및 개화시기 조사

무의 추대시기 판별용 마커를 개발하는데 사용한 재료는 농협종묘가 보유한, 추대가 일찍 형성되어 조기 개화하는 형질을 가진 조추대 계통 NH-JS2와 추대가 늦게 형성되어 개화가 늦어지는 만추대 계통 NH-JS1을 사용하였다. 마커 맵핑에 사용하기 위하여 위의 두 계통을 교배하여 F1을 얻고 다시 F1을 자가수정하여 F2 집단을 구축하였다.

조추대, 만추대 또는 F2 종자를 멸균된 상토에 파종한 뒤 저온(4℃)에 암 상태로 3일간 방치 후 배양실(12시간 광/12시간 암)로 옮겨 4일간 발아시켰다. 춘화처리는 4℃ 저온 배양실(12시간 광/12시간 암)에서 30~40일간 처리하였다. 춘화처리 후 정상조건의 배양실(25℃)로 옮겨서 생육하였다. 추대가 확인되면 그때의 생육일수와 잎수를 측정하여 개화시기를 결정하였다.

F2 집단 중 135개 개체를 선택하여 맵핑에 사용하였고 이들의 개화시기를 조사하였다. F2 집단의 대부분은 개화시기가 21에서 59일사이의 범위에 있었다(도 1). 그러나 실험을 완료한 시기까지 개화를 하지 않은 개체도 있었다.

실시예 2. GBS(Genotyping-by-sequencing)를 통한 유전자지도 작성

F2 135개 개체의 유전형을 조사하기 위하여 GBS(Genotyping-by-sequencing)를 수행하였다. 이를 위해 각 개체로부터 게놈 DNA를 추출하였다. GBS는 씨더스사(한국)에 의뢰하여 진행하였으며 간단하게 그 과정을 요약하면 다음과 같다. 먼저 무 잎을 비드 비터(bead beater)로 파쇄한 뒤 DNA 추출 키트(바이오니아, 한국)를 사용하여 안내서에 따라 추출하였다. 추출한 게놈 DNA를 제한효소로 절단한 뒤 크기별로 분리하였다. 각 샘플별로 다른 어답터(adapter)를 붙인 후 라이브러리를 만들고 NGS(Next generation sequencing)를 수행하였다. 이렇게 얻은 서열정보에서 SNP(Single nucleotide polymorphism)를 추출하였다. 얻어진 SNP 중 missing rate 10% 이하, MAF(minor allele frequency) 20% 이상 등의 조건을 만족시키는 마커만을 선별하여 최종 8379개의 SNP를 얻었다. 이 중 1331개의 SNP를 이용하여 맵을 작성하였다(도 2).

실시예 3. QTL(quantitative trait locus) 맵핑

GBS에서 얻은 1331개의 SNP 마커 중 중복되는 것 제거 등의 필터링을 다시 거쳐서 최종 1146개의 마커를 선별하였다. 이 마커 정보와 각 개체에 대한 개화시기에 대한 결과를 가지고 R/qtl을 이용하여 QTL 맵핑을 하였다. 그 결과 크게 두 개의 피크(peak)를 확인할 수 있었다. 하나는 R2 염색체에, 두 번째는 R6 염색체에 위치하였다(도 3). 그 중 R2에 위치한 QTL이 가장 높은 로드(lod) 값을 가지고 있었다. R/qtl scanone에서 1000회 순열(permutation)을 수행하여 신뢰도 99%를 만족하는 lod 값을 조사하였다. 그 결과 4.3을 얻을 수 있었으며 R2의 QTL만 그 조건을 만족하였다.

무와 같은 십자화과에 속하는 애기장대에서는 개화관련 유전자들이 많이 알려져 있다. 따라서 R2 염색체의 QTL이 기존에 알려진 유전자일 가능성이 있다. 이를 확인해 보기 위해 그 주변에 위치한 유전자들을 찾아서 애기장대 개화유전자와의 유사성을 조사하였으나 유사한 유전자는 찾을 수 없었다. 즉 R2에 위치한 QTL은 기존에 알려진 것과는 다른 유전자일 것으로 추정되었다.

실시예 4. 마커 개발 및 F2 집단 마커 분석

만추대 개체를 선별하기 위한 마커를 디자인하기 위해 R2 염색체의 QTL 근처에서 SSR(single sequence repeat)을 찾아보았다. 그 중 가장 가까운 SSR을 선택하고 이를 검출할 수 있는 PCR 프라이머 세트(서열번호 1 및 2)를 디자인하였다. 이 SSR 마커를 이용하여 먼저 F2 집단을 만들 때 사용한 조추대, 만추대 계통에 대해 PCR을 수행하여 보았다. 두 계통에서 서로 다른 밴드패턴을 보여주어 마커로 사용가능함을 확인하였다. 이어 F2 집단에서 마커 개발에 사용하지 않은 개체 중 개화시기가 늦은 그룹(만추대) 및 아주 빠른 그룹(조추대)에서 총 23개체를 선발하여 게놈 DNA 를 추출한 뒤 PCR을 수행하였다. 조추대 그룹은 개화시기가 저온처리 후 약 27일 이하인 개체에서 선발하였고 만추대 그룹은 개화시기가 59일 이상인 개체를 대상으로 하였다. PCR을 하기 위한 총 부피 20㎕의 반응액은 DNA 5㎕, dNTP 2㎕, 10X buffer 2㎕, 프라이머 0.1㎕, Taq 중합효소 0.1㎕을 함유하였다. 반응조건은 94℃에서 4분간 처리하고 95℃에서 10초, 57℃에서 20초, 72℃에서 30초로 37회 반복하였다. 싸이클이 완료된 후 72℃에서 5분간 반응 후 PCR 산물을 아가로스겔에서 전기영동하여 DNA를 분리한 뒤 그 결과를 분석하였다.

그 결과 PCR 산물은 59 bp, 68 bp 두 개의 밴드를 볼 수 있었다(도 4). 일부 개체는 두 개의 밴드를 모두 보이는 헤테로였으나 한가지 밴드만 보이는 개체는 개화 특성에 따라 잘 나뉘어지는 것을 알 수 있었다.

<110> NH Seed Co., Ltd. <120> Marker for discriminating bolting time in radish and uses thereof <130> PN16196 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aatattttgt ttagggtttt gtat 24 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aactttggta tggagaatga g 21

Claims (4)

1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 무의 추대시기 판별용 프라이머 세트.
2. 제1항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 무의 추대시기를 판별하기 위한 키트.
3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
4. (a) 무에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 무의 추대시기 판별방법.

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