CN107338293B

CN107338293B - 与玉米粗缩病抗性相关的kasp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN107338293B
Application number: CN201710566574.9A
Authority: CN
Inventors: 邹继军; 卢东林; 阮详经; 谈存梅; 马传禹; 徐明良
Original assignee: Yuan Longping High Tech Agriculture Co ltd
Current assignee: Longping Biotechnology (Hainan) Co.,Ltd.; YUAN LONGPING HIGH-TECH AGRICULTURE Co.,Ltd.
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2037-07-12
Also published as: CN107338293A

Abstract

本发明涉及分子生物学，具体公开了与玉米粗缩病抗性相关的KASP分子标记及其应用。所述分子标记定位于玉米第8号染色体上，命名为CSB‑2、CSB‑5、CSB‑6和CSB‑7。CSB‑2如SEQ ID NO.1所示，在第201bp处发生G→A的突变，碱基A为抗粗缩病玉米材料所特有；CSB‑5如SEQ ID NO.2所示，在第204bp处发生TTAAATAT的插入，插入片段为抗粗缩病玉米材料所特有；CSB‑6如SEQ ID NO.3所示，在第201bp处发生C→G突变，碱基G为抗粗缩病玉米材料所特有；CSB‑7如SEQ ID NO.4所示，在第101bp处发生SEQ ID NO.5所示序列的插入突变后，表现出玉米粗缩病抗性。本发明提供的与玉米粗缩病抗性相关的KASP分子标记可用于粗缩病抗病分子育种和玉米种质资源分析，同时具有成本相对较低和应用灵活性高的特点，可实现高通量检测。

Description

与玉米粗缩病抗性相关的KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及与玉米粗缩病抗性相关的KASP分子标记。

背景技术

玉米粗缩病(Maize Rough Dwarf Disease,MRDD)是全球玉米种植区广泛发生的病毒性病害。玉米幼苗期感染粗缩病病毒后，植株严重矮化，节间变短、变粗；叶背出现白色蜡泪状脉突、叶面粗糙、叶色浓绿、叶片缩短；植株根数少、不发次生根、且有根纵裂；常不能抽穗或雌穗极小、变形、雄花少或无花粉，大幅度减产或者绝产。

近几年，随着农业气候的变化和黄淮海区农作物种植结构的改变，玉米粗缩病病情又呈上升趋势，尤其在河北、山东、江苏等地区发生更为严重。目前，粗缩病已经成为我国主要玉米病害之一，对玉米生产构成严重威胁。

玉米粗缩病抗性鉴定主要有田间自然传毒鉴定和人工接种鉴定两种。田间自然发病鉴定主要是在粗缩病高发病区进行田间自然传毒鉴定，玉米粗缩病人工接种鉴定目前成熟的方法是通过带毒灰飞虱在玉米幼苗上传毒接种，1头带毒灰飞虱传毒可使整个玉米植株发病，在网箱内释放灰飞虱接种2叶1心期玉米幼苗，4叶期移栽至田间，发病率可达92.3％～100％。

然而，田间自然传毒鉴定方法虽然方便快捷，但往往受环境条件、灰飞虱发生及迁飞数量等因素的制约，影响鉴定的准确性和抗病品种的筛选。同时不同年份和不同地区病害的发生情况有所不同，在不同环境条件下自然发病鉴定玉米种质资源抗病性时，相同材料通常得到不一致的鉴定结果。因此该方法进行病情预测和植株抗病性鉴定难度较大，常致使玉米粗缩病的研究工作不能顺利进行。相对于田间传毒鉴定，人工接种鉴定的稳定性和重复性较好，但是常受到鉴定规模小和带毒灰飞虱数量少等因素控制。

玉米抗粗缩病性状为数量性状，在性状表达中起主导作用的是微效基因的加性效应。因此，若将多个微效基因集中于单个自交系中就能显著提高其抗病性。但是利用传统的定向轮回选择法对粗缩病抗性进行改良选择效率低，同时受鉴定条件的制约，选择结果不易掌控。通过分子标记辅助选择的方法能有效地提高抗粗缩病选择的效率。分子标记辅助选择利用与抗病QTL紧密连锁的分子标记对群体中含有抗病QTL的单株进行追踪，用标记的基因型来确定单株的抗病性。

传统的分子标记辅助选择存在一定的局限性，以SSR标记为例：1.与抗病QTL紧密连锁的SSR分子标记在后代群体中有可能发成重组，造成分子标记辅助选择的偏差；2.与抗病QTL紧密连锁的SSR标记并不是功能标记，只能对在该标记位点具有多态性的亲本的后代群体进行选择；3.SSR分子标记基因型检测往往采用聚丙烯酰胺凝胶技术进行检测，但是这种检测方法操作流程比较繁琐，而且检测过程中涉及有毒试剂的使用，会对人体健康造成有一定的威胁；4.由于SSR分子标记的特点和其检测流程的复杂性，难以实现高通量检测。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供与玉米粗缩病抗性相关的KASP分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了与玉米粗缩病抗性相关的KASP分子标记，所述分子标记定位于玉米第8号染色体上，命名为CSB-2、CSB-5、CSB-6和CSB-7。

所述CSB-2如SEQ ID NO.1所示，其中，在第201bp处发生G→A的突变，碱基A为抗粗缩病玉米材料所特有；所述CSB-5如SEQ ID NO.2所示，其中，在第204bp处发生TTAAATAT的插入，插入片段为抗粗缩病玉米材料所特有；所述CSB-6如SEQ ID NO.3所示，其中，在第201bp处发生C→G突变，碱基G为抗粗缩病玉米材料所特有；所述CSB-7如SEQ ID NO.4所示，其中，在第101bp处发生SEQ ID NO.5所示的转座子序列插入突变后，表现出玉米粗缩病抗性。

具体如下所示：

注：CSB-7转座子序列长度为2.5Kb，由于表格篇幅有限，将部分碱

基序列省去以“……”代替，详细碱基序列参照表1。

本发明进一步提供了用于扩增前述分子标记的特异性引物(表2)，扩增CSB-2分子标记的引物如SEQ ID NO.6～8所示，扩增CSB-5分子标记的引物如SEQ ID NO.9～11所示，扩增CSB-6分子标记的引物如SEQ ID NO.12～14所示，扩增CSB-7分子标记的引物如SEQ IDNO.15～18所示。

第二方面，基于前述研究成果，本发明提供了所述分子标记在玉米粗缩病种质材料抗性鉴定或抗性基因检测中的应用。

以及所述分子标记在玉米粗缩病抗性标记辅助育种中的应用。

具体表现为，一种玉米粗缩病抗性标记辅助育种方法，包括检测前述分子标记的步骤。

所述方法的具体步骤如下：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物进行竞争性等位基因特异性PCR(KASP,Kompetitive Allele Specific PCR)反应扩增；

(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而确定样品对粗缩病的抗性。

本发明涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了与玉米粗缩病抗性相关的KASP分子标记，可用于粗缩病抗病分子育种和玉米种质资源分析，同时具有成本相对较低和应用灵活性高的特点，可实现高通量检测。

附图说明

图1为本发明采用的KASP引物设计的方法和原理。

图2为本发明利用KASP引物CSB-5对165份玉米材料的检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

根据前人研究已知，粗缩病抗病基因和感病基因相比有一片段大小为2.5kb的转座子插入，该转座子插入使玉米对粗缩病产生抗性，是抗病基因的功能位点。本发明通过比对已经克隆的粗缩病抗病基因和感病基因的序列，找出两条基因序列之间的5个SNP位点、1个小片段插入/缺失位点和1个转座子的插入/缺失位点，共计7个序列差异位点，见表1。

表1 抗病基因与感病基因序列比对

注：差异位点如下划线标记所示。

根据上述7个序列差异位点的特点和类型进行KASP引物设计，用于检测这7个序列差异位点的基因型。

提取上述7个差异位点及两侧各100bp的碱基序列，将7条序列分别与玉米B73_AGPv3参考基因组进行比对，比对结果显示，这7条序列都只能比对到基因组上唯一的物理位置，是非重复序列，因此可以对这7条序列进行引物设计。引物设计采用KASP引物设计原理，方法如图1，设计完成后合成KASP引物，编号分别为CSB-1引物，CSB-2引物，CSB-3引物，CSB-4引物，CSB-5引物，CSB-6引物，CSB-7引物。引物列表见表2。

表2

引物扩增的结果以荧光信号的形式展现，根据荧光信号的颜色判断突变位点的基因型，如图2。

实施例2

选取165份玉米材料(其中有两份为已知具有粗缩病抗性的自交系，有两份为粗缩病感病自交系)。分别采用已有的粗缩病抗病基因特异引物和设计的KASP引物CSB-1，CSB-2，CSB-3，CSB-4，CSB-5，CSB-6，CSB-7对这165份材料进行基因型检测，检测结果显示KASP引物CSB-2，CSB-5，CSB-6，CSB-7的检测结果与粗缩病抗病基因特异引物的检测结果一致，其中已知的两份抗病材料检测为抗病的基因型，两份感病材料检测为感病的基因型，说明KASP引物CSB-2，CSB-5，CSB-6，CSB-7可以特异地区分粗缩病抗病材料和感病材料。

实施例3

对1500份玉米材料进行检测，检测结果显示这四个标记在这1500份玉米材料中检测出的基因型一致，阳性对照，阴性对照和空白对照的基因型与预期一致。从中筛选出492份抗粗缩病的玉米材料，见表3。

表3

实施例4 高通量的分子育种方法

利用开发的抗粗缩病KASP分子标记，结合高通量的DNA提取方法，LGC高通量分子标记基因型分型平台，实现了玉米抗粗缩病的高通量分子育种。主要流程如下：

样品准备。对玉米籽粒单粒进行取样，剪取玉米籽粒的部分胚乳，在不伤害胚的情况下，该籽粒可以继续种植。

DNA快速提取。采用Hotshot法对玉米籽粒单粒进行快速DNA提取。Hotshot提取DNA的方法不仅在试剂耗材成本上低廉，而且整个流程的耗时非常短，在大规模提取DNA时可以节省大量的人力物力和时间。

高通量分子标记检测。利用LGC生产的高通量实时荧光检测系统和水浴PCR仪，对DNA样品进行高通量的分子标记检测

优良样品追踪。根据对DNA的分子标记检测的结果，追踪到相应的玉米籽粒，在育种时只对优良的玉米籽粒进行播种，可以节省50％-75％的播种面积。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司

<120> 与玉米粗缩病抗性相关的KASP分子标记及其应用

<130> KHP171114083.6

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 401

<212> DNA

<213> CSB-2

<400> 1

tcgagctcgg cgtcaagatc tatgccgccg agctcagtta tgtaactaca aaacttgtct 60

aactcaattg gtagagtcta aggcttttaa ccttatggtt atgggttcaa gcctcatgat 120

gggcattcaa tatttttttt tgtctttgtc actaatttat tttttttatt gtccagattt 180

ttcgtttatg tcgctgattt gttacactaa aggaaaatgc atttattaya ctactgtctg 240

cattgcacgg agccaaacag acaggaacaa caccgtttta aatatgattt tgatggctcg 300

ttcctaatcc tgctaacccg tgcacatatg attctgatcc agttaggctt tgaatcagat 360

aactatacta cagttacctt tagtttaagg cagtgttagg t 401

<210> 2

<211> 401

<212> DNA

<213> CSB-5

<400> 2

caataatgtg gtggttcagg gttgattttc acagaaaatc tgtaaaaaag aaggaaatca 60

ctgcttagct ctcttctttt accagctgtg caatacaggc aatggtgaaa agttgtacaa 120

attaaaattc gtttttaaaa aattagtgaa tttataaaca tttaatgcat tatatatata 180

ttcgtcgtct tctatttaaa tatagacata aaaacacatg ctaaaacgaa ttgtattggg 240

aaatagatgg ggtatttttt tcattgttca tgtttaactt atgaccacat aaacgaaaaa 300

tctggaaaaa aaacaaatca gtaacaaaga caaaaaatat taaaaacact caccgtgggg 360

ctcaaactca tgaccacaag gttaaaagcc ttgcactcta c 401

<210> 3

<211> 401

<212> DNA

<213> CSB-6

<400> 3

agccaccagg cagggcctgt gttaacaccg ttcttcttta gagtatggta tctctaatag 60

gaaaatctct agtattcttc agctgcgctg gcagcgctca ggtccacact gagatcaacg 120

gtctgcgaca cagacatgga gagatttaaa gatgtgcgat ccatctttgg gtcagtaaac 180

ataaaatagt aatgtcatca cagtatcaat aataaagaga gatgtctagt aagggactaa 240

ttttgtttga ggcaaatcat ctattgctga cagaaggtta acaaacaatt gaccatgccc 300

tgtaaagcta gcaaatttca ctagtagagt agtaggtttt gatctctcag gcccaataca 360

gtattgaaat ccacctatgt tttctcaaca taacaagtcc c 401

<210> 4

<211> 200

<212> DNA

<213> CSB-7

<400> 4

aacataccta agaaacattt taagaataca tgttacaaac acacaaccaa gcagtacaaa 60

ctgaattaag gcactcatca aatgaaaact atttgaaata tgagtaagag acccacatgt 120

ctgacttgcg cccaagttgc ttctgcggca aaataatctg aatcgagtgg gactcatttg 180

tgtttggaat tgggtggctc 200

<210> 5

<211> 2548

<212> DNA

<213> 转座子

<400> 5

actagtatgg tgcccgtgcg ttgcaacgga acacaaacta ttcgttaaaa gtttattacc 60

cgtgcatatc tatgttcttg aagcggcgtg gtagactggt tacctcattt aaactactga 120

attcccacgg cataagaatc tgcaaaatat cagtcattaa gtttgcaaag aagtgccatt 180

tataaatatc agtcataaga acttgcgtct cccacccgag ggaggtcacg aacgagccgt 240

gactgcatct cccgcccaag gttggcctcg ggcgagcgtg agtgcgtctc ccgcccgagg 300

gtggcctcaa acgtgtcgcg actgcgtttc ccgcgcgagg atggcctcgg gcgagtgtga 360

ctacgtctct cgcccaagtg tggcctcgga caaggcgtga ttgcgtctcc cgcccgaggt 420

tggcctctgg cgaggcgtga ttgcgtctcc cgtccgaggg ttgcctcggg cgagctatga 480

ctatgtctcc cgccaaaggt cggccacgag cgagacgtga cagcgtctcc tgcccgagga 540

tggtctcagg caagccatgg ctgcgtctcc tgcctgggga tggcctcaag tgagtcgtga 600

ctatgtctcc cgcccgaggg tggcctcgag cgagccatga atgcgttctc ccgcttgagg 660

gcggcctcgg gcgaggcgtg aatgcattct ctcacccaag gatggctttg gccaaagcgt 720

gattgcgtct cccgcccgag gttggcatcg agagagtcgt gactatgagg tttccttggg 780

cgagtcatga ctatgaggtt tccttgggcg agaccgtgca tgcattagga gtgttttcta 840

taagaaagat gaagtttcaa tttgtaaacc atgcgacgtg tgaaaaaaac atgcaagcag 900

tctgagttgc gatgatctga gtaacatcat tcgaggtcct gagttcgtat ttttattttt 960

tagaaggcag attttaaacg aggctatttt tatggcgcta attttccaat tacaaatatt 1020

tgattcacaa ccgaaatttg gatctttgtc tcgtgccaaa tattttaccg agtgcgtctg 1080

gtccgcacgt tatttacgtg atgtttcgtg cggacgtcgt tcgttcgtgt aaaccgttat 1140

ttgcacgctc taataaaatc acttcgccat atcgtggaaa attattgaac gctcatgtag 1200

ttacagagtc tcgagtagaa gcatcacgaa acagacatag caggtaaaat tcagctagta 1260

agctcatttg gaacaaatgt gcctattgac aattggacga ttacagcaat tttaccgatc 1320

tgccgatcta gtttgcctta gaggagtgcc gtccgaatcc cccgatagtc tcggcaccag 1380

aattgctgct agtatagtat ctactgctaa caaatggaag atcaagatcg gtgaacgctg 1440

atttgctgcc agtgccagaa aggaaaaaac gcttccttgg acgtgcggca ccacgcattg 1500

actctggcac acattgactc tggccttaac aatccttaga atccgggaaa tgcttccatt 1560

ttaccgcggc ttcggtgggt cgcggactcg tacgtcccca ccaaaaaccg ggtttgatag 1620

cggccgatac gtccgccgcg gcggctgacg ggctgagaat aggagagaga aaccgctcct 1680

ctctcttcct ctccttctcg acgaactcgt cccacaagca cgtgcgagcc aaggcagaca 1740

agagcgaggt ggagagagag agagtgagag aggaaaacac cgcccccgtc caggcaacct 1800

tcgtcgacgc atacggcgga ggccacagag gcgccacgcg agggagcccc gccgcagcag 1860

cacccacgcg cggccgctga tgccccaaat tcggcacccc cggatctcct tgccggcgcc 1920

tagggccccg atcgcctcct ccccatggtc gtgctcctcc ggggttctcc tcgcgcgggc 1980

gtcgtccctg tcgatttaga cctcacttcc accagcaagg tatacgcccg cccgagccca 2040

gatcgccacc tgatccctgt cgatttcccc ctcgaattcc ccgggctgag ctggctgaga 2100

gatgtgtaga gccattggcg tacctggaca tcgtcgaagg tccagcggtt gaagtgcttc 2160

accgcgtccg gtggctgctc cacctccgcc atggctgagg tcgagagagg gatgtgctgt 2220

tttggcggcg gcagcggcga cgcgactaaa ccctagggaa gtcaccgctc gcggggtgcg 2280

aggtggattc taataatagg cgagagcctc ccgggctagg gtttctgatc cgacagctgt 2340

ccgcgcatct gttggacggt cactgattgc agggccacga tatcccataa gcggatcggg 2400

cttcgttcct taggattcga catggagtac gatgcggagg acaccgaggc aggcgagtgg 2460

cagacaggcg agtgaggatg tgacgtgagc ggagggggag gcgggggcat gtatatggtc 2520

tacactatcc tcttaataga tagtatag 2548

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cagatttttc gtttatgtcg ctgatttg 28

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccagattttt cgtttatgtc gctgattta 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcaatgcaga cagtagtrta ataaatgcat 30

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atatatatat tcgtcgtctt ctatttaaat att 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atatatatat tcgtcgtctt ctatttaaat ata 33

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccaatacaa ttcgttttag catgtgtttt 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

actagacatc tctctttatt attgatactg 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

actagacatc tctctttatt attgatactc 30

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgatccatct ttgggtcagt aaacataaa 29

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agacatgtgg gtctcttact catc 24

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cagacatgtg ggtctcttac tcata 25

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agcagtacaa actgaattaa ggcactcat 29

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggtctacact atcctcttaa tagatagtat 30

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gggtccaaaa ataacattaa cattttttag g 31

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aagggtccaa aaataacatt aacatttttt aga 33

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctaatatcat ttcggattca tgaagcggaa 30

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccgtgcaatg cagacagtag ta 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ccgtgcaatg cagacagtag tg 22

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gctgatttrt tacactaaag gaaaatgcat 30

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggtcatccct caaaaaataa tggatga 27

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gtcatccctc aaaaaataat ggatgg 26

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggctttgaat cagataacta tactacagtt 30

Claims

1.与玉米粗缩病抗性相关的KASP分子标记，其特征在于，所述分子标记定位于玉米第8号染色体上，为CSB-2、CSB-5、CSB-6和CSB-7；

所述CSB-2的序列如SEQ ID NO.1所示，其中，在第201bp处发生G→A的突变，第201bp处的碱基A为抗粗缩病玉米材料所特有；

所述CSB-5的序列如SEQ ID NO.2所示，其中，在第204bp处发生TTAAATAT的插入，第204bp处的插入片段为抗粗缩病玉米材料所特有；

所述CSB-6的序列如SEQ ID NO.3所示，其中，在第201bp处发生C→G突变，第201bp处的碱基G为抗粗缩病玉米材料所特有；

所述CSB-7的序列如SEQ ID NO.4所示，其中，在第101bp处发生SEQ ID NO.5所示序列的插入突变后，表现出玉米粗缩病抗性。

2.用于扩增权利要求1所述分子标记的特异性引物，其特征在于，扩增CSB-2分子标记的引物如SEQ ID NO.6～8所示，扩增CSB-5分子标记的引物如SEQ ID NO.9～11所示，扩增CSB-6分子标记的引物如SEQ ID NO.12～14所示，扩增CSB-7分子标记的引物如SEQ IDNO.15～18所示。

3.如权利要求1所述的分子标记在玉米粗缩病种质材料抗性鉴定中的应用。

4.如权利要求1所述的分子标记在玉米粗缩病抗病分子育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物进行竞争性等位基因特异性PCR反应扩增；

(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而确定玉米材料对粗缩病的抗性。