CN109609676B - 与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1共分离的SNP标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供与玉米抗灰斑病主效QTL‑qRgls1共分离的SNP标记及应用。所述SNP标记选自标记SNP1‑SNP3中的至少一个，所述标记SNP1‑SNP3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5‑7所示。本发明还提供用于检测所述SNP标记的KASP引物。利用本发明提供的SNP标记及其KASP引物能够高效且低成本地鉴定出玉米灰斑病抗性材料，可实现对玉米灰斑病抗病基因的高通量检测。

Description

与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1共分离的SNP标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1共分离的SNP标记及应用。

背景技术

玉米是当今世界最重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物。灰斑病是由玉蜀黍尾孢菌(Cecrospora zeae-maydis Tehon&Daniels)引起的真菌病害，又被称为玉米尾孢菌叶斑病。于20世纪20年代在美国首次发现灰斑病，如今已成为危害玉米生产的主要病害之一，在我国西南地区尤为严重。长期生产实践证明，选育和推广抗病品种是防治玉米灰斑病的最有效的途径之一。

对于玉米抗病育种而言，育种材料的抗病性鉴定是至关重要的，由于玉米灰斑病的发生对气温和空气湿度有较高要求，自然接种鉴定和人工接种鉴定的方式均受到季节、地域及年度病害流行情况等因素限制，只能够在符合玉米生长的特定季节(如春、夏季)及适宜该病害发生的地域内进行田间鉴定，因此抗病性鉴定受到一定的限制。分子标记的应用为抗病行鉴定提供了一种快速有效地方法，利用与抗病QTL紧密连锁的分子标记可以在苗期筛选出含有抗病QTL的育种材料，相对于自然接种鉴定和人工接种鉴定，利用分子标记对抗病材料进行筛选不受限于玉米的生长时期、种植地域及年份的影响，其效果要优于接种鉴定。

利用分子标记对玉米灰斑病抗病QTL进行筛选，其准确性由所用分子标记与抗病QTL的紧密连锁程度决定，分子标记与抗病QTL连锁程度越高，利用分子标记进行筛选的准确性越高，反之准确性越低。如果分子标记位于抗病QTL的基因内部，那么分子标记将与抗病QTL共分离。

目前利用SSR等分子标记进行抗病QTL筛选，存在通量低、成本高、对环境不友好等缺点，难以在商业化育种中得到大范围应用。SNP标记作为第三代分子标记，具有通量高、单个标记数据成本低等优势，同时基因分型数据准确可靠，遗传稳定性和重复性好，容易实现自动化检测，减少了人力成本，可以满足多次基因分型数据结果的整合。

利用玉米抗灰斑病分子标记高通量检测技术进行抗病辅助育种将会在商业化育种中发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1共分离的SNP标记及应用。

本发明的技术路线如下：玉米灰斑病相关基因内部的SNP标记引物组合的获得：1.已知与玉米灰斑病抗性有关的主效QTL位点qRgls1位于玉米第8号染色体，位于QTL位点qRgls1的抗病基因序列来源于抗病材料Y32，序列如SEQ ID NO:1所示，位于QTL位点qRgls1的感病基因序列来源于感病材料B73，序列如SEQ ID NO:2所示。2.采用序列比对软件DNAMAN比对抗病基因序列和感病基因序列。3.根据比对结果选取两序列之间的单核苷酸多态性位点(SNP，single nucleotide polymorphism)，提取SNP位点两侧至少50bp的序列，提交艾吉析(上海)科技有限公司(LGC公司)，设计KASP引物，用于检测所选取SNP位点的基因型。4.对设计的KASP引物进行验证。提取92份玉米材料新鲜叶片的DNA，利用LGC公司生产的SNP高通量检测平台对92份玉米材料的灰斑病抗性相关SNP位点进行检测，验证所设计的KASP引物组合对相应SNP位点的基因型分型效果。有关玉米抗病材料Y32可参见Zhang，Y.，Xu，L.，Fan，X.，Tan，J.，Chen，W.，&Xu，M.(2012).QTL mapping of resistance to grayleaf spot in maize.Theoretical and applied genetics，125(8)，1797-1808。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1共分离的SNP标记，所述SNP标记选自标记SNP1-SNP3中的至少一个，所述标记SNP1-SNP3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5-7所示；其中，标记SNP1的第81位碱基为多态性位点，标记SNP2的第98位碱基为多态性位点，标记SNP3的第118位碱基为多态性位点，所述标记SNP1-SNP3的多态性位点分别为G或T、A或C、C或T。

本发明还提供与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1共分离的SNP标记组合，由所述标记SNP1-SNP3组成。

第二方面，本发明提供用于检测所述SNP标记的KASP引物，所述引物如表1所示：

表1

第三方面，本发明提供含有所述KASP引物或其引物组合的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供所述SNP标记、所述SNP标记组合、所述KASP引物或含有所述KASP引物或其引物组合的检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)在玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1基因分型中的应用；

(2)在鉴定或筛选抗灰斑病玉米材料中的应用；

(3)在玉米分子标记辅助育种中的应用。

第五方面，本发明提供鉴定含有主效QTL-qRgls1的玉米种质资源的方法，包括以下步骤：

1)提取待测玉米基因组DNA作为模板；

2)向步骤1)的模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。

其中，所述KASP Primer mix中含有三种特异性引物：正向引物1、正向引物2和反向引物(表1)，并且，所述正向引物1和正向引物2的5’端分别添加不同的标签序列。优选地，正向引物1的5’端添加的标签序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，正向引物2的5’端添加的标签序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′。

所述KASP Master mix包含如下各组分：通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂。

优选地，步骤(2)中采用的PCR反应体系如下：DNA模板0.8μl，KASP Master mix和KASP Primer mix混合液0.8μl。

其中，所述混合液是由100μM KASP Master mix和2×KASP Primer mix按体积比35:1混合而成。

所述KASP Primer mix中正向引物1、正向引物2和反向引物的浓度分别为12μM、12μM和30μM。

PCR反应条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃～55℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。

第六方面，本发明提供一种玉米灰斑病抗病基因的高通量检测方法及其在育种中的应用。所述方法是利用表1所述KASP引物或其组合实现对玉米灰斑病抗病基因的高通量检测。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

利用开发的抗灰斑病KASP引物组合，结合高通量的DNA提取方法，LGC高通量SNP分子标记基因型分型平台，实现了玉米抗灰斑病的高通量分子育种。主要流程如下：1.样品准备。对玉米籽粒单粒进行取样，剪取玉米籽粒的部分胚乳，在不伤害胚的情况下，该籽粒可以继续种植。2.DNA快速提取。采用Hotshot法对玉米籽粒单粒进行快速DNA提取。Hotshot提取DNA的方法不仅在试剂耗材成本上低廉，而且整个流程的耗时非常短，在大规模提取DNA时可以节省大量的人力物力和时间。3.高通量分子标记检测。利用LGC生产的高通量实时荧光检测系统和水浴PCR仪，对DNA样品进行高通量的分子标记检测。4.优良样品追踪。根据对DNA的分子标记检测的结果，追踪到相应的玉米籽粒，在育种时只对优良的玉米籽粒进行播种，可以节省50％-75％的播种面积。

进一步地，在玉米灰斑病回交育种中的应用：1.利用含有抗病基因的玉米材料Y32作为供体亲本，易感灰斑病但其它农艺性状优良的材料作为轮回亲本，通过回交将抗灰斑病基因导入轮回亲本，改良轮回亲本的抗病性。2.利用开发的KASP引物组合和LGC生产的SNP高通量检测平台对回交群体单株进行抗病基因检测，筛选出含有抗病基因的单株，继续和轮回亲本进行回交。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的SNP标记位于与玉米灰斑病抗性相关的基因内部，在玉米回交、自交的过程中始终与抗性相关基因共分离，利用本发明提供的SNP标记及其KASP引物能够高效且低成本地鉴定出玉米灰斑病抗性材料。本方法只需合成相应的引物并在5'端加上荧光探针序列，与探针法荧光定量PCR相比，极大地降低了检测成本；并且荧光扫描是在反应终点进行，因此可以先进行大批量样品的PCR扩增，反应结束后再集中进行荧光扫描检测，实现了高通量检测，其检测效率是荧光定量PCR的12～24倍；反应结束后无需进行凝胶电泳，扫描荧光信号即可，同时反应体系构建可实现自动化，这样不仅能省时省力，而且能有效降低出错的概率。

附图说明

图1为本发明实施例3中利用KASP引物组合HB1-3对回交世代BC2F1的单株进行检测的结果。其中，1-含有抗灰斑病基因的材料，2-不含抗灰斑病基因的材料，其余点代表缺失。

图2和图3分别为本发明实施例4中利用KASP引物组合HB1-4、HB1-5对F2代单株进行检测的结果。其中，3-含有抗灰斑病基因的材料，4-含有抗灰斑病杂合基因型的材料，5-不含抗灰斑病基因的材料，其余点代表缺失。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1与灰斑病相关SNP标记的获取

已知与玉米灰斑病抗性有关的QTL位点qRgls1位于玉米第8号染色体，抗病材料Y32的抗灰斑病基因序列如SEQ ID NO:1所示，感病材料B73的感灰斑病基因序列如SEQ IDNO:2所示；利用序列比对软件DNAMAN比对SEQ ID NO:1和2的核苷酸序列，选取两序列之间的7个单核苷酸多态性(SNP，Single Nucleotide Polymorphism)位点：HB1-1，HB1-2，HB1-3，HB1-4，HB1-5，HB1-6，HB1-7，并提取SNP位点HB1-1，HB1-2，HB1-3，HB1-4，HB1-5，HB1-6，HB1-7两侧至少50bp的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9所示。筛选SNP位点的原则如下：①该SNP位点左右临近位点无其他SNP位点；②所选SNP位点左右50bp范围内无InDel位点；③所选SNP位点左右序列保守程度高。

实施例2 KASP引物设计及验证

将获取的SNP位点HB1-1，HB1-2，HB1-3，HB1-4，HB1-5，HB1-6，HB1-7及两侧序列如SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQID NO:9(每条序列中碱基n为SNP位点，SEQ ID NO:3-9对应的碱基n分别为c/t、c/t、g/t、a/c、c/t、g/a、a/g(各碱基对应的抗病性均为抗病/感病)。提交艾吉析(上海)科技有限公司进行KASP引物设计，具体引物序列如下：

其中，Primer_FAM、Primer_HEX的5’端分别添加有标签序列，FAM的标签序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，HEX的标签序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′。

利用上述KASP引物对相应的SNP位点进行检测，验证KASP引物的应用效果。选取92份玉米材料，采用改良CTAB法提取玉米新鲜叶片的DNA，对设计的KASP引物进行验证。利用LGC OKTOPURE DNA自动提取工作站将提取的DNA从96孔板转移至384孔板，利用LGCIntelliqube SNP高通量检测平台将PCR反应体系进行分装和混合到array tape中，并封膜进行密封，PCR反应体系为：0.8ul DNA，0.8ul的KASP Master mix和KASP Primer mix的混合液(100μM KASP Master mix和2×KASP Primer mix的体积比为35:1，其中所述KASPPrimer mix中引物Primer_FAM、Primer_HEX和Primer_common的浓度分别为12μM、12μM和30μM)。在LGC Hydrocycler16高通量水浴PCR仪中进行PCR反应，PCR反应程序为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃～55℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。PCR反应结束后利用LGC Intelliqube SNP高通量检测平台对arraytape进行荧光扫描。经验证，KASP引物组合HB1-3，HB1-4，HB1-5对相应SNP位点的基因型分型效果良好。

实施例3在灰斑病回交改良过程中利用SNP标记进行辅助选择

利用含有灰斑病抗病基因的抗病材料Y32作为供体亲本，易感灰斑病的材料LA2061作为轮回亲本，通过回交将抗病基因导入到轮回亲本LA2061中，利用KASP引物组合HB1-3以及LGC生产的SNP高通量检测平台对回交世代BC₂F₁的单株进行检测。具体为：在田间取每个单株的新鲜叶片，共182个样品，采用hotshot法快速提取叶片DNA。利用LGCOKTOPURE DNA自动提取工作站将所提取的DNA从96孔板转移至384孔板，利用LGCIntelliqube SNP高通量检测平台将PCR反应体系进行分装和混合到array tape中，并封膜进行密封，PCR反应体系及反应程序同实施例2。

PCR反应结束后利用LGC Intelliqube SNP高通量检测平台对array tape进行荧光扫描，结果如图1所示，紫色的点代表含有抗灰斑病基因的材料，蓝色的点表示不含抗灰斑病基因的材料，其余点代表缺失(即样品的基因型无法区分)。挑选出含有抗病基因的DNA，并追溯到田间的单株，对含有抗病基因的单株继续进行回交。同时利用琼脂糖凝胶电泳对182个单株进行抗灰斑病基因检测，检测结果与KASP引物组合检测的结果一致。

实施例4在F2群体中利用HB1-4、HB1-5 KASP引物进行纯合抗病基因筛选

利用含有灰斑病抗病基因的抗病材料Y32作为父本，易感灰斑病的材料LA181H和LAB2作为母本，通过一次杂交和一次自交产生F2群体，利用KASP引物组合HB1-4、HB1-5以及LGC生产的SNP高通量检测平台对F2代的单株进行检测。具体为：在田间取每个单株的新鲜叶片，Y32×LA181H的F2群体共188个样品，Y32×LAB2的F2群体共180个样品，采用hotshot法快速提取叶片DNA。利用LGC OKTOPURE DNA自动提取工作站将所提取的DNA从96孔板转移至384孔板，利用LGC Intelliqube SNP高通量检测平台将PCR反应体系进行分装和混合到array tape中，并封膜进行密封，PCR反应体系及反应程序同实施例2。

PCR反应结束后利用LGC Intelliqube SNP高通量检测平台对array tape进行荧光扫描，结果如图2和图3所示，左上方蓝色的点表示含有抗灰斑病纯合基因型的材料，中间紫色的点代表含有抗灰斑病杂合基因型的材料，右下方红色的点表示不含抗灰斑病基因的材料，其余点代表缺失(即样品的基因型无法区分)。挑选出含有纯合抗病基因型的DNA，并追溯到田间的单株，对含有纯合抗病基因型的单株继续进行自交。同时利用琼脂糖凝胶电泳对368个单株进行抗灰斑病基因检测，检测结果与KASP引物组合检测的结果一致。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司

<120> 与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1共分离的SNP标记及应用

<130> KHP181117601.6

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5528

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

aagagcttgg agagctacta ggattgtaga tcagttacac atttcagcag ctacaagact 60

caaccaatca attcagagat aaccttgagg aagagggatc caggtctatt tttgaagggc 120

aatatggata agaaagaatc atggtgaaat gattgaatgg aaccggtcag ggaaataaag 180

aattttcagc ggaggttcac acaatcggca acactcatca tatcaagcat tgtccttgct 240

gtctcaataa gagtttggtt ctttctttcc atgacaccat tttttgtgga gtgtaaggaa 300

caaaaactca tgcttgatgc cttctttagt caggtactga tcaacaccta tgttcttaaa 360

ttctgtctca ttgtcatttc tgatcttctt gatctttagc tcaaattcat tttgtgctcg 420

cctcatgacc ttctttagaa tctattgggt ttcacctttg tcacccaaaa agaaaaaaac 480

acaagtgaag caagaaaaat catgaacaat aaccaagcca tatttgttac caccaatact 540

gaggtaggcc accggtccga aaaggaccat gtgtagaagc tccaaaggcc tttttggtgg 600

tgaccgcatt ctttggatgg tggagagctc catgttgttt tcttgcttgg caagctccac 660

aaaccctgtc gttctcaaat ataacatttg ttagtccaat aatgtgatca ttctttagaa 720

gtttgcccaa gtttctcatg ccaacatgag ctagccagca atgctagagc caacccttgt 780

tggactttgc cactaaataa gtatcagatg acactctact tgtttgaaaa tcaacaaggt 840

agagcttgcc tgtcagctat cctataaagg caacatagga atgctccctt ctaagaattt 900

tcacactgac atttgtaaaa agacaatcaa aacccattgc acaaagttgt aaaacagaca 960

aaaggttata acttaaggaa tcaactaata gaacattgga tagtgactgc tttgttgaga 1020

taggaatgtt accaatacca accaccttac tcttgccact atccccaaat acaatctcct 1080

gtgtttcttg gactagctgt aaagaatata ttcttttgat tatcatagtg ttagcacgag 1140

taatatgcta gtttacctaa tttattatgc ataactaaga aagttgtgta atagccttcg 1200

gattgacgtg cataaaacta gtgcattcct tttcaagaat acaatgtctg ggaccgtggt 1260

cctctgtttg taggcaaaca aaatgttctt gatgagtttt tgataaaaaa ggttcatgga 1320

ggtattttag atgacatcac attatcacac tctcaataaa agtatacaac tagtacctta 1380

gcttatgaca accttgcaat cttaatacta tgatacatta agagcgcata aacacaagtg 1440

cagtttatta ctactactct tatattgtat acagttcaga gattgtagag taagaactgt 1500

caccctcgtc atcacaaaag aatggccttg gaggcatttg gatgccatca acactagctt 1560

caagcatctc tatgacctcg ctcatcgtcg gtctatcttg cggcttcatc tagatgcacc 1620

aaagcccgat gatacataac ttcttctcta actcatgcat atcaacacct tcactgatcc 1680

catcaacatc tccttggctc agctggctgt acacgaagga tgggtagtat gcttggctgg 1740

agcttcctgc ttgaggatct gcgttccttt gatcgcccgc catctccaat agtagcatcc 1800

caaagctata cacatcgaat ttgctagaga tgacaccaaa gcttggagat accatctatg 1860

tagttatata gcctatcgtt ccctgcacag cgcttagtgg cacgaaactg tcatctcttg 1920

ggaacagttt ggtgagccca aaatcagcaa cttttggaac aaagttgttg tcaagaagga 1980

tgttgtgtgg cttgatgtcg aagtgtacaa tctgcatgtc acacccgtga cgcaggtagt 2040

tgagacctct agcaatgccc agagcgatct cattgagttt gtcccatcag aaactcttct 2100

tcgacgagaa gatgtaccta tcgagggatc cacggggcat gaactcatat atgagtgccc 2160

tcctattttc atcggagcaa aacccgatga ggcgcacaac attcacatca tggagatagt 2220

tatgttagtt cgatttattt tattccagtt attttgtaag tcattttcgt tatataataa 2280

agcttgtgac attggctact atacattgag tatttatatg tgtgaaactt gatcatggcg 2340

cacatatgag gtgcatctga atttatcctt aaatcttggt gtgacagtat ccctaagtgc 2400

tagctagatg tatcttctta tttcctttct aaatgctagt tcatgattca acttctcctc 2460

tattttacga tgatctatct tagcatgatt ccaatgaaaa acatataaaa caaaaaaggg 2520

tttaatatta agctcatgaa aaatggatgt tcttgttaaa ataatcctaa atccaactac 2580

tttgagttac gatcctgaac cttaaatcat ataggtagtg tgtgtaggaa atgcaaattc 2640

tatagtgaag acaaataaga ataatgacat cagttgaata cacaagaata atgatacaag 2700

agaattttta accgtagcct aaaatttgct ttcataggag ctcaaactta gaatttagaa 2760

tttgagtgtc actcagacca cctaactaac tcagatagag tccttttgca ttgatttgag 2820

acaccaatct atactattgc catccatgag gacgtggtca ttaaaatcgg tactgacgcc 2880

tgaatcaata tcgattctac aacaactggt actaatgcct tcaaatgaat gtcgcgttct 2940

acatgagcgg tctttagcat gggcattata ttatatgaga tgaataacct tttggttatt 3000

taatttgtat tgtcaaatat tatcttggtg ctagcgcggg taatatgcta gttcacttaa 3060

tttgttatgc ataacttaaa aacttgtgca atagctgaat acaacggctg ggaccgtgat 3120

cctatgtttg ttggcaaaca aaatgttctt gaggagtttt tgataaaaaa ggttcattga 3180

ggtattttaa atgaaaacac attaccacac tctcaataaa agtatacaac cagtacctta 3240

gcttatgaca accttgcatt cttagtagtc taaaatacat taagatcaaa tatacacaag 3300

tgtattttac tactactact cttctattgt atccgattca gagattgcag agtaagaact 3360

atcaccctcg tcatcacaaa agaatggcct tggaggcatt tggatgccat cgacaccaac 3420

ttcaagcatc tctatgacgt cgctcatcgt cggtcgatct tgcggcttca tctggatgca 3480

ccaaagtcca atgatacata gcttcttctc taactcgtgc atatcaacac cgtcactgat 3540

ctcgcccaaa tctccttggc ttagctggct gtacaccaag gatgggtagt atgcttgact 3600

ggagcttcct gcataaggat ctgcgttcct tcgcccgccc gtcatctcca acagtagcat 3660

tccaaagcta tacacatcag atttgctaga gatgacacca aagcttcgag ataccatctc 3720

tggagctata tagcctatcg ttccccgcgt agcgctcagt ggcacgaaac tgtcgtctct 3780

tgggaacagt ttggcaagcc caaaatcagc aacttttgga acaaagttgc tgtcaagaag 3840

gatgttgtgt ggcttgatgt cgaagtgtac aatttgcata tcgcacccgt gatgtaggta 3900

gttgagacct ctagcaatgc ccagagcgat ctcattgagt ttgtcccatg agaaactctt 3960

ctccgacgag aagatgtact tatcgagaga tccatggggc atgaactcgt agataagtgc 4020

ccttctattt tcctcggagc aaaacccaat gaggcgcaca acattgaaat ggtggatctt 4080

gccaatggtg gcgacctcac tgatgaactc ttctccatta cagttggagt tgcctaacat 4140

cttgacagca acatgtactt cacctggctg tagcaccccc ttgtatacag aaccgtagcc 4200

tccttgtccg agcttttctc taaaatgacc ggtgatagca atgatgtttg tgtatgcata 4260

tctcatcgga acgagcatct gctgcatccg caggaacttc tcgactgcat ctattgtaat 4320

ccttgctttc cagtatttat gggctaggaa gacaaatact gctagcggca tcaatacaag 4380

cctgcaaaaa actgccgaaa aaaatccaag gttgtaaaca tgaagaatta aaaaaaaaca 4440

gaagccacaa aacatacgat gtttattcaa caaatgatga tagccggaga gagtaccatg 4500

tgtagatttc agaagccaca tacatattgg tattgttttg ataatgtcga tgataacaga 4560

agtgacaaca ttattagttg atccatgttg atcgagaaaa caagaccata attcctcgac 4620

cattagaatg tccacaatct gatactttct tggctcttta aggaaattac tgcaagacca 4680

tgccatagca tataaaagaa ttacgaaggg aatgcaacgg acggttttca gatgacaaag 4740

tcatgcatag gaggaaaata ggataggatg atcagatacc gcacagactc tgcgaaacat 4800

tctctgatgc cgcggtcacc aatcgaagaa ggaaatctaa ggccaaatcc attcctcatt 4860

aacttaacaa catctggata gcttgtattc ttgggcaccg gtatgcctgg accacccaaa 4920

taaatcatgg ctaggtaacc gcatgagggc tccagaatct cagcaagagc atagccatac 4980

gagtagtgag ttagcaagta gatgaaagaa gaattgctca agcaaggcac cggctcatat 5040

atatcattgt tctctattgg cttcgagcaa ttcacaaaga taatcgacat cgaattcgga 5100

taaaggaaat aaggcctgaa ctcagtcctc ctacgatatg agttggcagt actggtctca 5160

ccatggtgat cccaccaggg aagggggcaa ctgctctgga tgtccaggtc ggcatcaacg 5220

acccagaagt aagaataggt ggagttgatg ctaagcacgg tatacgttcc actgccgatg 5280

cgaatggtag cgtctgtatc cgtgcaaacc agctcatacg attggacacc gcaccccgat 5340

ggatcacctt gccgacggaa tggatacgat atattgctaa aaccaccgca ggagaaataa 5400

ggaggacaaa catgatgatg atgtcgcccg ccaacatctg aaacaagagc tgccaacaca 5460

aataacaccg ttaaagctct caaggaagaa gcacagcagc gatgagacgc tgcagacatc 5520

gtcgccat 5528

<210> 2

<211> 5517

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

ttcaagaata caacgtctag gaccgtgatc ctctgtttgt aggcaaacaa attgttcttg 60

aggagttttt gataaaaaag gggttcatgg aggtatttta gatgacatca aattatcaca 120

ctctcaataa aagtatacaa ccggtacctt agcttatgac aaccttgcaa tcttaatact 180

ctgatacatt aagagcgcat aaacacaagt gcagtttact actagtactc ttctattgta 240

tacagttcag atattgtaga gtaagaactg tcaccctcgt catcacaaaa gaatggcctt 300

ggaggcattt ggatgtcatc acaaacatct ttatgacctc gctcatcgtc ggtcgatcct 360

gcgggttcat ctagattcac caaagcccaa tgatacataa cttcttctct aactcatgca 420

tatcaacacc ttcactgatc ccatcaacgt ctccttggct cagctgaagg atgggtagta 480

tgcttggatg gagcttcctg cttgaggatc tacgtttctt cgatctccta ccatctccaa 540

tagtagcatc ccaaatctat acacattgga tttgctagag atgacaccga agctccgata 600

taccatctct agagctatat agcctatcgt tccccgcata gcgcttaatg gcacaaaact 660

gtcatatctt tggaatagtt tggttggcga gcccaaaatc agcaactttt ggaacaaagt 720

tgttgtcaag aaggatgttg tgtggcttga tgtcgaagtg tacaatctgc atgtcacacc 780

cgtgacgcaa gtagttgaga cctctagcaa tgcccagagc gatttcattg agtttgtccc 840

atgagaaact cttctccgac gagaagatgt acctatcgag ggatccacgg ggcatgaact 900

catatatgag tgctctccta ttttcctcgg agcaaaaccc gatgaggcgc acaccattga 960

catcatggag cttgccaatg gtggcgacct cactgatgaa ctcttcactg ttatagttgg 1020

agttgcccaa catcttgata gaaacttgaa cttcacctga ctgtaacacc cccttgtata 1080

tagtatcgta gcctccttgt ccgagcttgt ctttgaaatg ggcagtgata gcgatgttgt 1140

tcgtgtatgc atatctcatt ggaacgagca tctgctgcat tcgcaggaac ttctcgattg 1200

catctattgt tatccttgtt ttccagtatt tataggctag gaagataaat actatcagcg 1260

gcatcaatac gaacctgcaa ataactgcaa aagaaaaatc caaggttttg tatatgaaga 1320

ataaaaaata attctagaag ccacatatga tgtttataca aaaaataatg ctatctggtg 1380

tgagtatcat atgtagattt cagaccccac agaacaagaa caaccttttg gttattttgg 1440

tttgtattat taaatattgt tgcatcatta gcacagacaa tatattagtt agtttattat 1500

gcataacata gaaaattata cactaaacct tcgcacgaat gcgtatacaa gaagtgtagc 1560

catttggaag aataaaacaa ctaggacgaa tgtcgcgttc tctagtagcg gtcattaaca 1620

tggccattat attatatatg ggatgaataa ccttttggtc atttaattgg tattgtcgaa 1680

tattatcgta gtattcgtgg gtaatatgtt gattgacttc tctactatat aaaacaccag 1740

ttttatggtt ccacaatagt tgtgcttaac aatatttaaa tgataaaaaa actaaaatta 1800

caaacaacca gagattaaaa ccatgattgt tgtctctaaa cctatattaa cacccaccta 1860

accaacacaa cacatatatc tttgttactt aagtataaat gtaaatcata gcaacgtaca 1920

aatacttttc tagtatatta ttatgcataa cttagaaaat tttgcaatag cctttggatt 1980

gatgtgcata taagaagtgc aacccttttt aagaatagaa tggccagaac catgatcctc 2040

tgcttgtagg caaacaaaat gttcttgaag agtttttggt aaaaaaggtt cattgaggtg 2100

ttttatatga tatcatatta tcacactctc aagaacaggt atcgccgaag gaagactact 2160

acgatgagtt cgatgagatc tagatcgtcg tctcccagtc aatcacgcct ttggagatag 2220

ttatgttagt tcgatttatt ttattctggt tattttataa gtcattttcg ttatgtaata 2280

aagcttgtga cattggctac tatacagtga gtctttatat atgtgaaact tgatcatgac 2340

gcacatacga ggtgtatctg gatttatcct taaatcttgg tgtgacagta tccctaagtt 2400

ctagttagat gtatcttctt atttcctttc taagtgctag ttcatgattc aacttctcct 2460

ctattttacg acgatccatc ttagcatgat tccaaagaaa aacatataaa acaaaaaagg 2520

gtttaatatt gagctcatga aaaatggatg ttcttgttaa aataacccta aatccaacta 2580

ctttgagtaa cgatcatgaa ccttcaatga taaaggcagt gtgtgtagga aatgcaaatt 2640

ttatagtgaa gataaacaag aataatgaca tcagttgaat acacaagaat aatgatacaa 2700

gagaattttt aaccgtagcc taaaatttgc ttccatagga ggttaactta agatttgagt 2760

gtcactcaga ccacctaact aacttagata gagttctttt gcaccgattt gagacaccaa 2820

tatatactat tgctctccat gaggacgtgg tcattaaaat cggtactaac gcctgaatcg 2880

atatcgattc tacaacaacc gatactaatg ccttcaaatg aatgtcgcgt tctacatgag 2940

cggtctttag catggccatt atattatatg agatgaataa ccttttggtt atttaatctg 3000

tattgtcaaa tattatcttg gtgctagcgc gaataatatg ctagttcact taatttgtta 3060

tgcataactt agaaaattgt gcaatagctg aatacaacgg ctgggaccgt ggtcctatgt 3120

ttgtaggcaa acaaaatgtt cttgaggagt ttttgataaa aaaaggttca tggaggtatt 3180

ttatatgaaa acacattacc acactctcaa taaaagtata caaccagtat cttagcttat 3240

gacaaccttg cattcttagt agtctaatac attaagatca aatatacaca agtgtatttt 3300

actattacta ctactactct tctattgtat ccagttcaga gattgcagag taagaactat 3360

caccctcgtc atcacaaaag aatggtcttg aaggcatttg gatgccatcg acaccagctt 3420

caagcatctc tatgacctcg ctcatcgttg gtcgatcttg cggcttcatc tggatgcacc 3480

aaagtccaat gatacatagt ttcttcttta actcgtgcat atcaacacct tcactgatct 3540

cgcccacatc tccttggctt agctggttgt acaccaagga tgggtagtat gcttgactag 3600

agcttcctgc atgaggatct gcgttccttc gcccgcccgt catctccaac agtagcattc 3660

caaagctata cacatcagat ttgctagaga tgacaccaaa gcttcgagat accatctctg 3720

gagctatata gcctatcgtt ccccgcatag cgctcagtgg cacgaaactg tcgtctcttg 3780

ggaacagttt ggcaagccca aaatcagcaa cttttggaac aaagttgctg tcaagaagga 3840

tgttgtgtgg cttgatgtcg aagtgtacaa tttgcatatc gcacccgtga tgtaggtagt 3900

tgagacctct agcaatgccc agagcgatct cattgagttt gtcccatgag aaactcttct 3960

ccgacgagaa gatgtactta tcgagagatc catggggcat gaactcgtag ataagtgccc 4020

tgctattttc ctcggagcaa aacccaatga ggcgcacaac attgaaatgg tggatcttgc 4080

caatggtggc aacctcactg atgaactctt ctccattaca gttggagttg cctaacatct 4140

tgacagcaac atgtacttca cctggctgta gcaccccctt gtatacagaa ccgtagcctc 4200

cttgtccgag cttttctctg aaatgaccgg tgatagcaat gatgtttgtg tatgcatatc 4260

tcatcggaac gagcatctgc tgcatccgca ggaacttctc gactgcatct attgtaatcc 4320

ttgctttcca gtatttatgg gctaggaaga caaatactgc tagcggcatc aatacaagcc 4380

tgcaaaaaac tgccgaaaaa aatccaaggt tgtaaacatg aagaattaaa aaaaaacaga 4440

agccacaaaa catacgatgt ttattcaaca aatgatgata gccggagaga gtaccatgtg 4500

tagatttcag aagccacata catattggta ttgttttgat aatgtcgatg ataacagaag 4560

tgacaacatt attagttgat ccatgttgat cgagaaaaca agaccataat tcctcgacca 4620

ttagaatgtc cacaatctga tactttcttg gctctttaag gaaattactg caagaccatg 4680

ccatagcata taaaagaatt acgaagggaa tgcaacggac ggttttcaga tgacaaagtc 4740

atgcatagga ggaaaatagg ataggatgat cagataccgc acagactctg cgaaacattc 4800

tctgatgccg cggtcaccaa tcgaagaagg aaatctaagg ccaaatccat tcctcattaa 4860

cttaacaaca tctggatagc ttgtattctt gggcaccggt atgcctggac cacccaaata 4920

aatcatggct aggtaaccgc atgagggctc cagaatctca gcaagagcat agccatacga 4980

gtagtgagtt agcaagtaga tgaaagaaga attgctcaag caaggcaccg gctcatatat 5040

atcattgttc tctattggct tcgagcaatt cacaaagata atcgacatcg aattcggata 5100

aaggaaataa ggcctgaact cagtcctcct acgatatgag ttggcagtac tggtctcacc 5160

atggtaatcc caccagggaa gggggcaact gctctggatg tccaggttgg catcgacaac 5220

ccagaagtaa gaatacgtgg agttgatgct aagcacggtg tatgttccac tgccgatgcg 5280

aattgtggcg tctgtatccg tgcaaaccag ctcatacgat tggacaccac acccagatgg 5340

atcaccttgc cgacggaatg gatacgatat attgctaaaa ccaccgcagg agaaataagg 5400

acgacaaaca tgatgatgat gtcggccgcc tacatctgaa acaagagctg ccaacacaaa 5460

caacacggtt aaagctctca aggaagaagc acagcagcga tgagacgctg cagacat 5517

<210> 3

<211> 297

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 3

ggtcgatctt gcggcttcat ctggatgcac caaagtccaa tgatacatag nttcttctyt 60

aactcgtgca tatcaacacc ktcactgatc tcgcccamat ctccttggct tagctggytg 120

tacaccaagg atgggtagta tgcttgactr gagcttcctg catraggatc tgcgttcctt 180

cgcccgcccg tcatctccaa cagtagcatt ccaaagctat acacatcaga tttgctagag 240

atgacaccaa agcttcgaga taccatctct ggagctatat agcctatcgt tccccgc 297

<210> 4

<211> 297

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 4

ggtcgatctt gcggcttcat ctggatgcac caaagtccaa tgatacatag yttcttctnt 60

aactcgtgca tatcaacacc ktcactgatc tcgcccamat ctccttggct tagctggytg 120

tacaccaagg atgggtagta tgcttgactr gagcttcctg catraggatc tgcgttcctt 180

cgcccgcccg tcatctccaa cagtagcatt ccaaagctat acacatcaga tttgctagag 240

atgacaccaa agcttcgaga taccatctct ggagctatat agcctatcgt tccccgc 297

<210> 5

<211> 297

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 5

ggtcgatctt gcggcttcat ctggatgcac caaagtccaa tgatacatag yttcttctyt 60

aactcgtgca tatcaacacc ntcactgatc tcgcccamat ctccttggct tagctggytg 120

tacaccaagg atgggtagta tgcttgactr gagcttcctg catraggatc tgcgttcctt 180

cgcccgcccg tcatctccaa cagtagcatt ccaaagctat acacatcaga tttgctagag 240

atgacaccaa agcttcgaga taccatctct ggagctatat agcctatcgt tccccgc 297

<210> 6

<211> 297

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 6

ggtcgatctt gcggcttcat ctggatgcac caaagtccaa tgatacatag yttcttctyt 60

aactcgtgca tatcaacacc ktcactgatc tcgcccanat ctccttggct tagctggytg 120

tacaccaagg atgggtagta tgcttgactr gagcttcctg catraggatc tgcgttcctt 180

cgcccgcccg tcatctccaa cagtagcatt ccaaagctat acacatcaga tttgctagag 240

atgacaccaa agcttcgaga taccatctct ggagctatat agcctatcgt tccccgc 297

<210> 7

<211> 297

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 7

ggtcgatctt gcggcttcat ctggatgcac caaagtccaa tgatacatag yttcttctyt 60

aactcgtgca tatcaacacc ktcactgatc tcgcccamat ctccttggct tagctggntg 120

tacaccaagg atgggtagta tgcttgactr gagcttcctg catraggatc tgcgttcctt 180

cgcccgcccg tcatctccaa cagtagcatt ccaaagctat acacatcaga tttgctagag 240

atgacaccaa agcttcgaga taccatctct ggagctatat agcctatcgt tccccgc 297

<210> 8

<211> 297

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 8

ggtcgatctt gcggcttcat ctggatgcac caaagtccaa tgatacatag yttcttctyt 60

aactcgtgca tatcaacacc ktcactgatc tcgcccamat ctccttggct tagctggytg 120

tacaccaagg atgggtagta tgcttgactn gagcttcctg catraggatc tgcgttcctt 180

cgcccgcccg tcatctccaa cagtagcatt ccaaagctat acacatcaga tttgctagag 240

atgacaccaa agcttcgaga taccatctct ggagctatat agcctatcgt tccccgc 297

<210> 9

<211> 297

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 9

ggtcgatctt gcggcttcat ctggatgcac caaagtccaa tgatacatag yttcttctyt 60

aactcgtgca tatcaacacc ktcactgatc tcgcccamat ctccttggct tagctggytg 120

tacaccaagg atgggtagta tgcttgactr gagcttcctg catnaggatc tgcgttcctt 180

cgcccgcccg tcatctccaa cagtagcatt ccaaagctat acacatcaga tttgctagag 240

atgacaccaa agcttcgaga taccatctct ggagctatat agcctatcgt tccccgc 297

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggtgacc aagttcatgc taactcgtgc atatcaacac cg 42

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaggtcgga gtcaacggat tctytaactc gtgcatatca acacct 46

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagccaagga gatktgggcg agat 24

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaggtgacc aagttcatgc tcarccagct aagccaagga gatt 44

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaaggtcgga gtcaacggat tccagctaag ccaaggagat g 41

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcgtgcatat caacaccktc actgat 26

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaaggtgacc aagttcatgc tatactaccc atccttggtg tacag 45

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaaggtcgga gtcaacggat tcatactacc catccttggt gtacaa 46

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tctcgcccam atctccttgg ctta 24

Claims (10)

1.与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1共分离的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记选自标记SNP1-SNP3中的至少一个，所述标记SNP1-SNP3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5-7所示；其中，标记SNP1的第81位碱基为多态性位点，标记SNP2的第98位碱基为多态性位点，标记SNP3的第118位碱基为多态性位点，所述标记SNP1-SNP3的多态性位点分别为G或T、A或C、C或T。

2.与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1共分离的SNP标记组合，其特征在于，由标记SNP1-SNP3组成，其中，所述标记SNP1-SNP3的定义同权利要求1中所述。

3.用于检测权利要求1所述SNP标记的KASP引物，其特征在于，所述引物如下：

。

4.含有权利要求3所述引物的检测试剂或试剂盒。

5.权利要求1所述SNP标记、权利要求2所述SNP标记组合、权利要求3所述KASP引物或权利要求4所述检测试剂或试剂盒在玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls1基因分型中的应用。

6.权利要求1所述SNP标记、权利要求2所述SNP标记组合、权利要求3所述KASP引物或权利要求4所述检测试剂或试剂盒在鉴定或筛选抗灰斑病玉米材料中的应用。

7.权利要求1所述SNP标记、权利要求2所述SNP标记组合、权利要求3所述KASP引物或权利要求4所述检测试剂或试剂盒在玉米分子标记辅助育种中的应用。

8.鉴定含有主效QTL-qRgls1的玉米种质资源的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测玉米基因组DNA作为模板；

2)向步骤1)的模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物；

其中，所述KASP Primer mix中含有三种特异性引物：正向引物1、正向引物2和反向引物，它们的定义同权利要求3中所述；并且，所述正向引物1和正向引物2的5’端分别添加不同的标签序列；

所述KASP Master mix包含如下各组分：通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中采用的PCR反应体系如下：DNA模板0.8μl，KASP Master mix和KASP Primer mix混合液0.8μl；

其中，所述混合液是由100μM KASP Master mix和2×KASP Primer mix按体积比35:1混合而成；

所述KASP Primer mix中正向引物1、正向引物2和反向引物的浓度分别为12μM、12μM和30μM。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中采用的PCR反应条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61℃～55℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，26个循环。

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