CN108531642B

CN108531642B - 一组用于鉴别玉米品种的ssr分子标记及其应用

Info

Publication number: CN108531642B
Application number: CN201810690796.6A
Authority: CN
Inventors: 关海涛; 张瑞英; 张晓磊; 温洪涛; 李悦
Original assignee: SAFETY AND QUALITY INSTITUTE OF AGRICULTURAL PRODUCTS HEILONGJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: SAFETY AND QUALITY INSTITUTE OF AGRICULTURAL PRODUCTS HEILONGJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2038-06-28
Also published as: CN108531642A

Abstract

本发明提供了一组用于鉴别玉米品种的SSR分子标记及其应用，共2个SSR分子标记，并提供一套适于聚丙烯酰胺凝胶电泳平台的检测所述SSR分子标记的方法。利用这2个SSR分子标记可快速地将玉米和育187及登海18进行品种区分，并实现了SSR标记与高效、高灵敏度技术的结合，节约成本，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、操作方便、时间短、结果准确可靠等优势。本发明提供的该组引物可用于玉米指纹图谱构建、品种鉴定及遗传多样性分析等，应用前景十分广阔。

Description

一组用于鉴别玉米品种的SSR分子标记及其应用

技术领域

本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及一组用于鉴别玉米品种的SSR分子标记及其应用。

背景技术

玉米是我国重要的粮食作物和饲料作物，被誉为长寿食品，含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量元素等，具有开发高营养、高生物学功能食品的巨大潜力。但由于其遗传性较为复杂，变异种类丰富，因此，玉米的种子纯度及质量直接关系到农作物的产量和农民的利益。提高玉米种子纯度，规范种子市场，对提高粮食生产能力、增加农民收入等方面都有十分重要的意义。玉米的世界第三大粮食作物。玉米种子商品化程度高，市场上玉米种子品种混杂，品种繁多，易混淆。因此，研究玉米纯度、区分玉米品种的方法对商用玉米种子品种的鉴别尤为重要，有利于保障玉米育种业和种植业的健康发展。

传统的品种鉴定是根据种子、幼苗及植株的形态特征和农艺形状进行鉴定的，主要测试品种的特异性、一致性和稳定性。这些鉴定方法存在时间长、工作量大、准确度不高、占用土地等应用局限性问题，同时这种方法也只适用于品种间差异明显的样品的鉴定。利用分子技术进行品种鉴定具有不受环境影响、快速高效、可用标记多等优点。基于PCR技术的SSR技术具有多态丰富、共显性、稳定、技术简单易行、成本低等特性，目前是构建指纹图谱有效鉴别品种真实性的理想方法。

SSR简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)，由1-6个碱基为重复单位，形成长达数十个核苷酸的串联重复序列，如(AT)_n、(AC)_n、(GA)_n、(AAG)_n、(AAT)_n、(CATG)_n等。微卫星序列广泛分布于植物基因组中，且SSR序列在不同物种中长度、重复单位次数、突变情况有所不同，在染色体上的分布也存在差异，等位基因的多样性也由此形成。基于SSR标记技术的共显性、分布广、多态性高、低成本、高效率等优点，SSR标记已广泛应用于动植物群体分析、构建DNA指纹图谱、品种鉴定以及辅助育种等多个方面。

发明内容

本发明的目的是提供一组用于鉴别玉米品种的SSR分子标记。

为了实现本发明目的，本发明通过收集来源广泛、表型和基因型丰富、代表性强的玉米材料，对相应材料的玉米基因组进行测序并比较。本发明提供了一组用于鉴别玉米品种的玉米SSR分子标记，所述分子标记为以下2个SSR分子标记的一个或多个，分别为UMC2074，UMC1037。

所述2个SSR分子标记分别依次通过以下引物扩增得到：SEQ ID NO.1-2，SEQ IDNO.3-4。

进一步，本发明提供了用于扩增上述SSR分子标记的特异性引物对，其为以下任一对：SEQ ID NO.1-2，SEQ ID NO.3-4。

本发明提供了上述玉米SSR分子标记在构建玉米品种DNA指纹数据库中的应用。

本发明提供了上述玉米SSR分子标记在玉米种质资源遗传多样性分析中的应用。

本发明提供了上述玉米SSR分子标记在玉米鉴定中的应用。

本发明提供了上述玉米SSR分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供了上述玉米SSR分子标记在制备玉米基因组芯片中的应用。

本发明提供了含有上述玉米SSR分子标记的玉米基因组芯片。

本发明提供了上述玉米SSR分子标记在区分玉米和育187和登海18品种中的应用。

以上所述的应用，包括以下步骤：

1)提取待测玉米样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用上述SSR分子标记，进行PCR扩增；

3)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳系统检测PCR产物。

上述应用的步骤2)中，PCR扩增采用20μL的反应体积，含dNTP0.25mM，正向引物、反向引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液(不含Mg²⁺)，MgCl₂ 1.5mM，样品DNA10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

进一步地，本发明提供了用于区分玉米和育187和登海18品种的试剂盒，其含有针对本发明的2个玉米SSR分子标记的特异性引物组合。优选地，所述特异性引物组合的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。

本发明提供的上述2对SSR引物可以在聚丙烯酰胺凝胶电泳平台上实现基因分型数据的获得。具体方案为，配制PCR反应体系加入DNA、引物、dNTP、MgCl₂、Taq酶、Buffer；运行反应程序；扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统上检测；利用扫描仪进行图像采集，通过与DNA分子量标准比对获得基因型数据。

在本发明的实施例的一个较佳实施方案中，分别以和育187和登海18DNA为模板，用提供的两对引物分别进行PCR扩增并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到扩增的条带及分子量。从图1中可以看出，以UMC2074为引物进行PCR后，在约30bp的位置，和育187未出现条带，而登海18则有一条明显的条带；以UMC1037为引物进行PCR后，在约30-45bp的位置，和育187未出现条带，而登海18则有两条明显的条带。而分别以UMC1127、UMC2635及UMC2615为引物进行PCR后，和育187与登海18的条带并没有差异。因此，以UMC2074和UMC1037为引物进行PCR，在凝胶电泳图上可清晰区分玉米和育187和登海18的差异。

本发明提供的一组SSR分子标记，可方便快速地将玉米和育187和登海18品种区分开，其信号清晰，扩增片段大小差异明显，易于判断。具有灵敏度高、分辨力好，结果准确可靠、高效快速等优点。实现了节约成本、提高效率、操作方便、结果准确的优势。本发明提供的该组引物可用于玉米指纹图谱构建、品种鉴定及遗传多样性分析等，应用前景十分广阔。

附图说明

图1为玉米和育187和登海18聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图像。其中，M为DNA分子量Marker，1代表和育187，2代表登海18，1127为引物UMC1127，2074为引物UMC2074，1037为引物UMC1037，2635为引物UMC2635，2615为引物UMC2615。每个PCR产物进行两复孔重复电泳，分别为重复1和重复2。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

若未特别说明，本发明实施例所用生化试剂均为市售，所用玉米材料均为本领域公知公用的玉米。

实施例1玉米SSR分子标记及引物的确定

取36个玉米品种进行SSR引物筛选。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从987对SSR引物(https://ftp.maizegdb.org/MaizeGDB/FTP/SSRs/)选出位点可扩增，带型清晰，多态性较高的可选引物50对。分别以和育187和登海18DNA为模板，分别以50对可选引物进行PCR扩增。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，筛选出和育187和登海18扩增片段有显著差异的引物。

表1.一组用于鉴别玉米品种的引物组合

实施例2利用本发明提供的SSR分子标记区分玉米品种

(1)DNA快速提取

采用碱煮法对玉米种子进行DNA提取。此方法操作快速简便，无有毒有害试剂，适用于植物分子生物学领域的DNA制备，而且对大幅度缩短种子纯度检验、转基因检测时间，提高检测效率，降低检测成本具有重要意义。具体操作步骤为：取玉米种子若干粒，置于1.5mL离心管中；在离心管中加入400μL NaOH(1M)，确保将种子完全浸泡，沸水浴5min；在离心管中加入200μL Tris-HCl(1M，pH 8.0)，沸水浴1min；加入200μL TE缓冲液(pH 8.0)，充分溶解后备用。

(2)DNA样品的质量和数量

在紫外分光光度仪上检测DNA样品260nm和280nm的OD值，选择OD_260/280值为1.8-1.9的样品用于检测。

(3)核心引物选择

通过分析引物在染色体上的分布、多态性水平、PCR扩增稳定性和扩增产物带型，选择实施例1确定的引物。具体见表1。

(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒功率90W电泳1h。

(5)快速银染检测

固定液(10％乙醇，0.5％冰醋酸)固定5min；双蒸水快速漂洗1次；0.2％AgNO₃溶液染色5min；双蒸水快速漂洗1次；显影液(3％NaOH，0.5％甲醛)显影5min；固定液(10％无水乙醇，0.5％冰醋酸)固定5min。将凝胶通过扫描仪进行图像采集与数据读取。

(6)和育187和登海18品种的区分

分别以和育187和登海18DNA为模板，用提供的三对引物分别进行PCR扩增并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到扩增的条带及分子量。从图1中可以看出，以UMC2074为引物进行PCR后，在约30bp的位置，和育187未出现条带，而登海18则有一条明显的条带；以UMC1037为引物进行PCR后，在约30-45bp的位置，和育187未出现条带，而登海18则有两条明显的条带。而分别以UMC1127、UMC2635及UMC2615为引物进行PCR后，和育187与登海18的条带并没有差异。因此，以UMC2074和UMC1037为引物进行PCR，在凝胶电泳图上可清晰区分玉米和育187和登海18的差异，因此可分别利用UMC2074和UMC1037实现对两种玉米品种和育187和登海18的准确鉴别。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所

<120> 一组用于鉴别玉米品种的SSR分子标记及其应用

<130> KHP181112465.9

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acacggagat gacagacgcc 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttgccgaag atgttgtact ggat 24

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcgcgatt ccttagtttg c 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttcttcgta aaggcatttt gtgc 24

Claims

1.玉米SSR分子标记组合在玉米品种鉴定中的应用，其特征在于，所述玉米SSR分子标记组合由以下2个SSR分子标记组成：UMC2074，UMC1037；

所述玉米品种鉴定中的应用为区分玉米和育187和登海18；

所述2个SSR分子标记依次通过以下引物扩增得到：SEQ ID NO.1-2，SEQ ID NO.3-4。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于，将玉米SSR分子标记组合制备成仅含有所述玉米SSR分子标记组合的玉米基因组芯片，进而用于玉米品种鉴定。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测玉米样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据所述玉米SSR分子标记组合，进行PCR扩增；

3)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳系统检测PCR产物。