CN108660225B

CN108660225B - 用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物及筛选方法

Info

Publication number: CN108660225B
Application number: CN201810790474.9A
Authority: CN
Inventors: 常亚青; 丁君; 李磊; 张伟杰; 赵文飞; 江会杰
Original assignee: Dalian Ocean University
Current assignee: Dalian Ocean University
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2038-07-18
Also published as: CN108660225A

Abstract

本发明公开了一种用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物及筛选方法，涉及分子生物学领域。本发明主要采用SLAF‑seq技术和KASP技术对海胆生长性状进行相关的SNP标记，此SNP标记适用于中间球海胆早期辅助选种。本发明通过SLAF‑seq技术使高深度测序保证分型准确、简化的策略降低测序成本、前期简化方案预测保障标记数量最优，通过KASP技术使操作时间和步骤均有所简化，降低了成本。

Description

用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物及筛选方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物及筛选方法。

背景技术

目前，对于中间球海胆的育种大多采用杂交育种、选择育种等传统的育种方法，无论是杂交育种还是选择育种，均是以生长性状良好的海胆为标准选择亲本。这些方法均需要在海胆的生长过程中，定期对其生长性状(壳高、壳径、体重)进行测量，并以此作为逐级筛选的标准，这些选择方式不仅耗费大量的人力物力，同时还会因亲本的基因并不是优良基因而导致优良基因型的子代苗种产出量低下。而分子标记辅助育种可提高选种过程的效率，可减少不良基因对选种的影响。

常亚青在早期筛选中间球海胆良种的SNP引物及筛选方法中，采用HRM技术对海胆特定SNP位点基因型的筛选进行分子辅助育种，但该方法仅涉及到一个与生长性状相关的SNP位点检测，对于控制数量性状的优良基因而言检测的位点较少，在应用中有一定局限性。

发明内容

为解决现有技术的问题，本发明基于KASP技术提供一种与中间球海胆生长性状相关的SNP标记及其开发方法，此SNP标记适用于中间球海胆早期辅助选种。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种的引物，所述引物选自如下的KASP引物组：

(1)SNP名称Marker49152，标记名称A007402，其对应的引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

(2)SNP名称Marker112898，标记名称A007399，其对应的引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

(3)SNP名称Marker140758，标记名称A007397，其对应的引物序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；

(4)SNP名称Marker63934，标记名称A007389，其对应的引物序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；

(5)SNP名称Marker203513，标记名称A007388，其对应的引物序列如SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；

(6)SNP名称Marker24433，标记名称A007376，其对应的引物序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；

(7)SNP名称Marker72763，标记名称A007374，其对应的引物序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；

(8)SNP名称Marker23360，标记名称A007366，其对应的引物序列如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；

(9)SNP名称Marker13442，标记名称A007362，其对应的引物序列如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示；

(10)SNP名称Marker6879，标记名称A007358，其对应的引物序列如SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。

本发明还提供一种利用上述引物用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种筛选方法，包括以下步骤：

(1)利用中间球海胆已建立的遗传图谱，根据QTL定位结果，从中筛选出与生长性状相关的SLAF标签，再从与生长性状相关的SLAF标签中挑选出可用于设计KASP引物的SLAF标签。本发明利用SLAF-seq技术对中间球海胆进行基因测序，在测序中获得大量的SLAF标签，SLAF标签可用于构建遗传图谱，利用遗传图谱与中间球海胆表型性状(壳高、壳径、体重)进行关联分析，进行QTL定位，通过对目的性状(壳高、壳径、体重)的QTL筛选，可回推出与生长性状(壳高、壳径、体重)相关的SLAF标签。由于SLAF标签的序列是由基因组简化测序而来，并经聚类分析后得到了2-3条tag序列，SLAF标签的序列可直接显示出SNP位点的碱基类型。

(2)在可用于设计KASP引物的SLAF标签中能找到设计KASP引物的SNP位点，即多态性SNP标记，并利用AlleleSpecific(正向)引物和Reverse(反向)引物进行PCR扩增，对获得的PCR产物进行FAM和VIC荧光扫描分型，根据荧光分型结果可对设计的KASP引物进行验证。同时KASP标记在验证群体的检测结果会以文字形式给出每个标记在每个个体中的具体碱基类型，当SNP位点基因型能分为2-3种时，表明设计的KASP引物能进行SNP位点基因分型。

(3)用KASP引物组对验证群体的DNA在LCGSNPline分型平台上进行基因分型验证，最终获得可对候选SNP位点进行准确分型的KASP引物组，即得到与生长性状相关的KASP标记。

(4)根据验证群体生长性状的表型数据(壳高、壳径、体重)及与生长性状相关的KASP标记分型结果，对每个生长性状(壳高、壳径、体重)使用线性模型单独分析每个标记与表型数据的关联性，对每个生长性状使用P<0.05的显著关联标记和表型数据建立线性模型，然后使用stepwiseAIC对线性模型进行优化，获得与生长性状显著关联的分子标记(P<0.1)，最终得到每个生长性状的预测模型。在获得每个性状的预测模型后，将每个生长性状的预测值压缩到了0-1的区间以方便个体性状综合预测值计算，按照各性状所占权重，最终建立海胆的分子标记生长预测模型及海胆综合性状预测值公式。

根据上文技术方案，优选的情况下，所述生长性状包括壳高、壳径、体重。本发明所述的体重均为活体重。

根据上文技术方案，优选的情况下，步骤(1)中与生长性状相关的SLAF标签的筛选标准为：当显著性阈值超过临界值(LOD＝2-3)时，认为存在一个QTL位点。

根据上文技术方案，优选的情况下，步骤(1)中用于设计KASP引物的SLAF标签的选取标准为：①SLAF标签中不存在插入缺失的SNP位点，②引物序列只能包含1个SNP位点，③根据碱基含量使退火温度控制在PCR要求的温度范围内，所述退火温度为55℃～65℃。

根据上文技术方案，优选的情况下，步骤(2)中所述PCR扩增的温度为：55℃～65℃，PCR产物长度在200bp内。

根据上文技术方案，优选的情况下，步骤(3)中获得与生长性状相关的KASP标记的标准为：将SNP位点的基因型分为2-3种，则标记视为可用。

本发明的有益效果：

在本发明中，用KASP标记对海胆生长性状进行标记，用KASP技术得到10个与生长性状(壳高、壳径、体重)相关的SNP位点，多位点标记筛选相对单一位点筛选准确性更高，在HRM技术中采用小片段引物法在用于G/C突变(Ⅲ类突变)或A/T突变(Ⅳ类突变)的基因分型时，由于Tm值相差太小，往往不容易将野生纯合子和突变纯合子分开。而且小片段引物法会因DNA模板的未均一化导致PCR产物量的差异进而造成熔解曲线混乱，严重影响基因分型的准确性。而KASP标记对DNA模板要求较低，只需模板在要求范围内便可进行准确分型。此外相KASP标记的检测费用与HRM相比较而言更低。

本发明主要采用SLAF-seq技术和KASP技术，SLAF-seq技术是一套简化基因组测序技术，即通过设计适当的酶切方案，以双端2×100bp的有效基因组读长选择均匀分布在整个基因组、且避开重复序列区域的特异片段进行高通量测序，可获取全基因组范围内最完整的变异图像(SNPs、InDels)，SLAF-seq技术具有以下优点：高深度测序保证分型准确；简化的策略降低测序成本；前期简化方案预测保障标记数量最优。

KASP是一种最新的遗传学分析手段，它利用引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，进而对SNPs进行等位基因判断。KASP具有标记开发成本低、转化率高、DNA样本需求量低、分型准确、通量高、检测灵敏度高、特异性高、重复性好、操作简便、适用范围广等特点，和传统的SNP突变分析法和定量探针法相比，操作时间和步骤均有所简化，降低了成本。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下述实施例中SLAF-seq技术是委托北京百迈客生物科技有限公司提供，KASP技术是委托中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司提供。

实施例

1、生长性状的SLAF标签筛选

本发明利用SLAF-seq技术对中间球海胆进行基因测序，在测序中获得大量的SLAF标签，SLAF标签可用于构建高密度遗传图谱，利用遗传图谱与中间球海胆表型性状(壳高、壳径、体重)进行关联分析，进行QTL定位，通过对目的性状(壳高、壳径、体重)的QTL筛选，可回推出与生长性状(壳高、壳径、体重)相关的SLAF标签。其中利用SLAF-seq技术和HighMap软件开发、构建遗传图谱，利用MapQTL软件的区间作图(IM)算法和RQTL软件的复合区间作图(CIM)算法进行QTL定位。具体的，关于中间球海胆遗传图谱的构建以及QTL定位的方法可参照中国专利CN 105925698A所公开的内容。利用中间球海胆已建立的高密度遗传图谱，根据QTL定位结果，从中筛选出与生长性状相关的SLAF标签61条(当显著性阈值超过临界值(LOD)时，认为存在一个QTL位点，在实际筛选时设当LOD>2.5时存在一个QTL位点)，从中挑选出可用于设计KASP引物的SLAF标签51条(筛选标准1：SLAF标签中不存在插入缺失的SNP位点，2：引物序列只能包含1个SNP位点。3.根据碱基含量使退火温度控制在PCR要求的温度范围内，退火温度为55℃～65℃)。由于SLAF标签的序列是由基因组简化测序而来，并经聚类分析后得到了2-3条tag序列，SLAF标签的序列可直接显示出SNP位点的碱基类型。

2、生长性状的表型值测量及DNA提取

数显电子游标卡尺(精度为0.01mm)测量验证群体的201个个体的壳高、壳径；电子天平(精度为0.01g)测量体重。使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取海胆的管足DNA。验证群体的中间球海胆选自大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室选育的F6代中间球海胆。

3、多态性SNP标记的筛选、KASP引物设计

在最终筛选出的51条SLAF标签中能找到设计KASP引物的SNP位点有51个。KASP反应体系由3部分组成：(1)KASP引物组，(2)荧光序列，(3)DNA模板。利用Premier5.0软件在SNP位点附近设计AlleleSpecific(正向)引物和Reverse(反向)引物(使Tm值控制在55℃～65℃之间，PCR产物长度在200bp范围内),Reverse引物为反向通用引物，AlleleSpecific引物包含的2条正向引物序列。在LGCSNPline平台上，进行65～55℃梯度PCR扩增时，正向引物序列的末端碱基可与SNP位点的等位基因特异性配对，并在PCR过程中将荧光序列添加到PCR扩增产物中，并且2条不同的荧光序列添可加到不同的正向引物扩增的PCR产物中，SNP位点的不同类型的碱基最终因荧光序列的不同产生不同的荧光。然后在酶标仪上对PCR产物进行FAM和VIC荧光扫描分型，对根据分型结果对设计的KASP引物进行验证。在每个个体的标记检测输出结果中，会给出每个标记的碱基类型，能准确检测碱基类型便能进行分型。同时KASP标记在验证群体的检测结果会以文字形式给出每个标记在每个个体中的具体碱基类型，当SNP位点基因型能分为2-3种时，表明设计的KASP引物能进行SNP位点基因分型。

4、SNP位点分型及获取KASP标记

用KASP引物组对验证群体(201个海胆个体)的DNA中的LCGSNPline分型平台上经过2次基因分型验证，最终获得23个可对候选SNP位点进行准确分型的KASP引物组(KASP标记可将SNP位点的基因型分为2-3种，则标记视为可用)，即得到了23个与生长性状相关的KASP标记。

5、中间球海胆分子标记生长性状预测模型

结合201个验证群体的表型数据(壳高、壳径、体重)及KASP标记分型结果，对每个性状(壳高、壳径、体重)使用线性模型单独分析每个标记与表型数据的关联性，对每个性状使用P<0.05的显著关联标记和表型数据建立线性模型，然后使用stepwiseAIC对线性模型进行优化，获得与生长性状显著关联的分子标记(P<0.1)，最终得到每个性状的预测模型。在获得每个性状的预测模型后，将每个性状的预测值压缩到了0-1的区间以方便个体性状综合预测值计算，按照各性状所占权重(壳高*0.3、壳经*0.3、体重*0.4)，最终建立海胆的分子标记生长预测模型及海胆综合性状预测值公式。(注：方法5中所用到的分析软件来自中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司的R语言)

每个性状预测模型所包含的标记见表1(共包含10个标记)，每个标记与性状关联性见表2。最终选取与中间球海胆壳高、壳径和体重有关的10组KASP引物序列，结果见表3。

计算公式：个体综合性状预测值＝(壳高得分*0.3)+(壳经得分*0.3)+(体重得分*0.4)。

表1SNP位点与生长性状的关联分析结果

注：设P<0.1为关联显著。

表2分子标记生长性状预测模型

表3基于10个SNP开发的KASP标记的引物信息

表3基于10个SNP开发的KASP标记的引物信息

6、中间球海胆父母本个体综合性状预测值

根据方法4中对育种个体的基因分型结果，利用方法5中建立的分子生长性状预测模型，对海胆个体综合性状预测值进行计算。具体过程如下：利用方法2中提取海胆管足DNA，通过方法4对获得201海胆个体的基因分型，利用方法5中获得的生长性状预测模型获得各生长性状预测结果，将各性状预测结果乘以各自性状的权重(壳高*0.3、壳经*0.3、体重*0.4)得到父母本个体综合性状预测值。

7、选种方案

利用方法6中获得的父母本个体综合性状预测值，将个体综合性状预测值按照从高到低的方式排列，将海胆分为上选组、中选组、下选组，选择方法如下：综合性状预测值评分在前30％的个体组成上选组，综合性状预测值评分在中间区域40％的个体组成中选组，综合性状预测值评分在后30％的海胆组成下选组。利用方法2中获得的表型数据，结合分组结果对海胆生长性状进行显著性分析见表4。

表4育种群体生长性状统计分析

注:同一行中相同字母代表组间无显著差异，同一行中不同字母表组间存在显著差异。

分析结果表明：3组海胆在生长性状(壳高、壳径、体重)及亲本综合性状预测值上存在显著差异(P＜0.05)，且在表型性状上：上选组>中选组>下选组。

8、子代生长性状验证

2017年10月根据方法7中的分组结果，对海胆进行催产，并根据催产结果建立子代家系，待子代海胆发育至4月龄、5月龄时对子代海胆生长性状进行统计分析。具体过程如下：在海胆发育至4月龄时，从上选海胆、中选组、下选组海胆家系中分别随机挑选出100个海胆，每个家系的海胆置于单独的吊笼中，并在1.4m³中的养殖池中饲养，同时从，从上选海胆、中选组、下选组海胆家系中挑选出同一规格(壳径在7mm左右)的海胆100个，每个家系的海胆分别置于单独的吊笼中，并在1.4m³中的养殖池中饲养。经过2个月的饲养，对子代海胆的生长性状及特定生长率进行比较分析，见表5、6和7。

表5 4月龄海胆3个群体的生长性状统计分析(时间：2018.3.14)

注:同一行中相同字母代表组间无显著差异，同一行中不同字母表组存在显著差异。

表6 5月龄海胆3个群体的生长性状统计分析(时间：2018.4.14)

表7 4月龄-5月龄海胆3个群体的特定生长率统计分析(时间：2018.3.14-2018.4.14)

结果：

在随机挑选出的3组海胆，经过2次生长性状比较分析，在生长性状(壳高、壳径、体重)表型测量结果上均表明：上选组显著高于中选组(P＜0.05)，中选组显著高于下选组((P＜0.05))。在初始规格(壳径)相同的3组海胆在体重及壳径特定生长率的分析结果表明：上选组>中选组>下选组(P＜0.05)。经过亲本的表型数据分析及子代生长性状分析，结果表明筛选出的10个KASP标记在中间球海胆的早期选种中有很好的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连海洋大学

<120> 用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物及筛选方法

<130> 2018

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttggaaaaa catgttcaaa ttgagttatg tc 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttggaaaaa catgttcaaa ttgagttatg tt 32

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgcgttgaa atgtgctaaa gctatacaaa 30

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agttgattca gagccatatc cacata 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agttgattca gagccatatc cacatt 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccctgttcct tcgcctatga ttacat 26

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcagactgt gaaatttgaa gccttg 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtcagactgt gaaatttgaa gcctta 26

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gttggggtag gctcaccagc aa 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggttcctca ctggactgtc taa 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gttcctcact ggactgtcta g 21

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acaaactctt ctattgtgtt attccttagt 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gagaagttgy ataagatatt gttctcaatc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gagaagttgy ataagatatt gttctcaatt 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

actttaaggg aaatatcgga gcaaattcat 30

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cccattaatg gtatttccac caaatttag 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cccattaatg gtatttccac caaatttaa 29

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cattcgatct tcacggtttc atagtaagtt 30

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gttgaatgta tctgaccaaa agcgaa 26

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gttgaatgta tctgaccaaa agcgat 26

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgtatattct cgcaatatca agtttctcaa 30

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

caaatacagc atcaacatag aataagg 27

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gcaaatacag catcaacata gaataagt 28

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tttgagcctt aatattaatt tccaggtgca 30

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

atctataata ttttgatgaa aattacattt tc 32

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

atctataata ttttgatgaa aattacattt tt 32

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aataagcaaa aattctgata tttcattaca gt 32

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tgtgttattt ctaaaataca atataccttc 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tgtgttattt ctaaaataca atataccttt 30

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cataacattg agcatgagag gataatcta 29

Claims

1.一种用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物，其特征在于，所述引物选自如下的KASP引物组：

(1)SNP名称Marker49152，标记名称A007402，其对应的引物序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

(2)SNP名称Marker112898，标记名称A007399，其对应的引物序列如SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

(3)SNP名称Marker140758，标记名称A007397，其对应的引物序列如SEQ ID NO.7、SEQID NO.8和SEQ ID NO.9所示；

(4)SNP名称Marker63934，标记名称A007389，其对应的引物序列如SEQ ID NO.10、SEQID NO.11和SEQ ID NO.12所示；

(5)SNP名称Marker203513，标记名称A007388，其对应的引物序列如SEQ ID NO.13、SEQID NO.14和SEQ ID NO.15所示；

(6)SNP名称Marker24433，标记名称A007376，其对应的引物序列如SEQ ID NO.16、SEQID NO.17和SEQ ID NO.18所示；

(7)SNP名称Marker72763，标记名称A007374，其对应的引物序列如SEQ ID NO.19、SEQID NO.20和SEQ ID NO.21所示；

(8)SNP名称Marker23360，标记名称A007366，其对应的引物序列如SEQ ID NO.22、SEQID NO.23和SEQ ID NO.24所示；

(9)SNP名称Marker13442，标记名称A007362，其对应的引物序列如SEQ ID NO.25、SEQID NO.26和SEQ ID NO.27所示；

(10)SNP名称Marker6879，标记名称A007358，其对应的引物序列如SEQ ID NO.28、SEQID NO.29和SEQ ID NO.30所示。

2.一种中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用中间球海胆已建立的遗传图谱，根据QTL定位结果，从中筛选出与生长性状相关的SLAF标签，再从与生长性状相关的SLAF标签中挑选出可用于设计KASP引物的SLAF标签；

(2)在可用于设计KASP引物的SLAF标签中能找到如权利要求1所述的SNP位点，并利用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增，对获得的PCR产物进行荧光扫描分型，根据分型结果对设计的KASP引物进行验证；

(3)用KASP引物组对验证群体的DNA进行基因分型验证，最终获得可对候选SNP位点进行准确分型的KASP引物组，即得到与生长性状相关的KASP标记；

(4)根据验证群体的生长性状的表型数据及与生长性状相关的KASP标记分型结果，进行关联分析后获得与生长性状显著关联的分子标记，最终得到每个生长性状的预测模型，通过每个生长性状的预测值进行个体生长性状综合预测值计算，最终建立海胆的分子标记生长预测模型。

3.根据权利要求2所述的用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种筛选方法，其特征在于，所述生长性状包括壳高、壳径、体重。

4.根据权利要求2所述的用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种筛选方法，其特征在于，步骤(1)中与生长性状相关的SLAF标签的筛选标准为：当显著性阈值超过LOD临界值时，认为存在一个QTL位点，其中LOD＝2-3。

5.根据权利要求2所述的用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种筛选方法，其特征在于，步骤(1)中用于设计KASP引物的SLAF标签的选取标准为：①SLAF标签中不存在插入缺失的SNP位点，②引物序列只能包含1个SNP位点，③根据碱基含量使退火温度控制在PCR要求的温度范围内，其中退火温度为55℃～65℃。

6.根据权利要求2所述的用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的温度为：55℃～65℃，PCR产物长度在200bp内。

7.根据权利要求2所述的用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种筛选方法，其特征在于，步骤(3)中获得与生长性状相关的KASP标记的标准为：将SNP位点的基因型分为2-3种，则标记视为可用。