CN111607652B - 一种与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记、检测引物组及开发方法 - Google Patents

一种与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记、检测引物组及开发方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记、检测引物组及开发方法。所述的InDel标记位于如SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第103与104位碱基间插入或缺失序列TNNN，其中，NNN表示为未知碱基和碱基数量。利用本发明的开发方法创造性地从差异表达基因中来筛选InDel，并与性状进行关联，开发了一个与性状关联的分子标记SNP441。利用该分子标记SNP441设计的检测引物组，能够对待测马氏珠母贝的分子标记SNP441进行基因型分型，筛选出生长优势个体用作后备亲本进行育种，实现分子标记辅助育种。

Description

一种与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记、检测引物组及 开发方法
技术领域：
本发明属于水产动物遗传及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记、检测引物组及开发方法。
背景技术：
马氏珠母贝是我国及世界上海水珍珠养殖的主要物种。我国自1965年成功地开展了马氏珠母贝人工育苗以来，海水珍珠产业发展迅速，已成为广东、广西及海南部分沿海地区海水养殖支柱产业之一。近10多年，我国海水珍珠的质量和产量明显下降，国际竞争力减弱，养殖经济效益下滑。究其原因，除了养殖环境恶化、养殖技术落后外，还有一个重要原因是：多年来不注重种贝的选育和保留，缺乏优良品种；种苗质量参差不齐，育珠母贝性状退化，如生长慢、个体小型、育珠能力减弱等。为了我国海水珍珠养殖业的健康稳定发展，通过育种技术培育适合我国海区养殖的马氏珠母贝优良品种已迫在眉睫。
育种技术有杂交、选择育种，生物技术育种及分子育种等多种方法。分子育种是目前国内外研究的热点，是育种技术发展的主要方向，它具有高效、快捷的特点。分子育种离不开分子标记的开发，用在海洋贝类遗传育种研究的分子标记主要有限制片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、锚定简单重复序列(ISSR)、简单重复序列(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)、表达序列标签(EST)、线粒体DNA(mtDNA)、核糖体DNA内转录间隔区标记(ITS)分子标记等。SNP标记由于其多态高，便于高通量检测的特点，已成为目前最主要的标记。在分子育种中，科学家最希望的是找到与某性状显著关联的标记，然后利用该标记挑选理想的亲本构建遗传群体，从而培育出目标品种。对于关联分子标记的开发，主要包括通过构建高密度遗传图谱和QTL定位，筛选出与性状关联的DNA标记或基因；另一种研究的较多的方式是候选基因法，即对某一基因进行SNP发掘，然后进行关联分析，其缺陷是无法对大量的基因进行SNP开发，而且这些研究基本上是开发基因组DNA中的标记。其他还有极端混池法、全基因组关联分析等多种方法。总体上，不管应用哪种方法，目前在水产动物中开发的单一关联标记都比较少。因此，为了发展分子育种实践，需开发更多的可用的性状关联分子标记。
另外，还有大量的研究通过转录组测序，筛选差异表达基因，根据基因表达量来解析性状形成的分子遗传基础，但还没有发现充分利用差异基因中存在的SNP或InDel并与性状进行关联分析的报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记、检测引物组及开发方法。
本发明的第一个目的是提供一种与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记，所述的InDel标记位于如SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第103位与104位碱基间插入或缺失序列TNNN，其中，NNN表示为未知碱基和碱基数量。
InDel标记缺失序列时如下所示：
AGTTCTAATGTTTGTATAAACAAACCAATTAACGTACCAAACAATAGTGAAAGCGCATGGTAAACAAACAATTATAGGTAACGGTAACGCAGGTTGACTGATTAACGTTGTTTGATCGACCGTGACATCGAGATTAATTAAGGGGGATGACAGTTAATTAGATAATATCATTACGGAAACAATGATATGTGCATGTTTCAT(如SEQ ID NO.1所示)。
InDel标记插入序列时如下所示：
AGTTCTAATGTTTGTATAAACAAACCAATTAACGTACCAAACAATAGTGAAAGCGCATGGTAAACAAACAATTATAGGTAACGGTAACGCAGGTTGACTGATT[TNNN]AACGTTGTTTGATCGACCGTGACATCGAGATTAATTAAGGGGGATGACAGTTAATTAGATAATATCATTACGGAAACAATGATATGTGCATGTTTCAT(如SEQ IDNO.2)。其中，[TNNN]为插入序列，NNN表示为未知碱基和碱基数量。
本发明的第二个目的是提供一种与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记的检测引物组，包括以下引物：
SNP441F1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTAACGCAGGTTGACTGATTT-3’(如SEQ IDNO.3所示)；
SNP441F2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTAACGCAGGTTGACTGATTA-3’(如SEQ IDNO.4所示)；
SNP441R：5’-TAACTGTCATCCCCCTTAATTAATC-3’(如SEQ ID NO.5所示)。
本发明的第三个目的是提供所述的InDel标记或检测引物组在马氏珠母贝分子标记辅助育种中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种检测马氏珠母贝具有生长优势的个体的方法，包括以下步骤：通过对待测马氏珠母贝中的所述的与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记进行基因型分型，若待测马氏珠母贝的基因型为缺失型，则待测马氏珠母贝为可能具有生长优势的个体，确定其作为后备亲本进行育种。
具体步骤如下：提取待测马氏珠母贝的基因组DNA作为模板，采用所述的检测引物组进行等位基因特异的定量PCR，对PCR扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析，若荧光信号在所得分型聚类图中呈现蓝色，则待测马氏珠母贝在所述的InDel标记的基因型为缺失型，则待测马氏珠母贝为可能具有生长优势的个体，确定其作为后备亲本进行育种。
优选，所述的等位基因特异的定量PCR，其PCR反应体系包括：马氏珠母贝基因组DNA 40ng，KASP V4.0 2×Master Mix 2μL，引物预混液0.056μL，用ddH2O补至4μL；所述的引物预混液是将所述的引物SNP441F1、SNP441F2和SNP441R稀释至100μM，分别得到SNP441F1稀释液、SNP441F2稀释液和SNP441R稀释液，然后将SNP441F1稀释液、SNP441F2稀释液、SNP441R稀释液与ddH2O按体积比12:12:30:46混合而成。
优选，所述的等位基因特异的定量PCR，其PCR反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃复性45s，共10个循环，每个循环降0.6℃；94℃变性20s，55℃复性45s，共37个循环。
本发明的第五个目的是提供一种用于检测所述的与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记的试剂盒，包括所述的与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记的检测引物组。
本发明的第六个目的是提供一种与马氏珠母贝生长性状关联的分子标记的开发方法，包括以下步骤：
(1)从马氏珠母贝任一群体中随机取若干个个体，测量每个个体的生长性状，以某一性状的测量值进行排序，以一定的比例挑选极大值和极小值个体，构成极大值组L和极小值组S；
(2)从极大值组L和极小值组S选取个体进行转录组测序，组内设生物学重复；
(3)根据常规方法对测序数据进行组装，构建极端值个体间的差异表达基因库；
(4)在差异表达基因库中，筛选SNP、InDel标记，标记筛选标准为：针对同一个基因，极端值组内的标记在生物学重复间都为同一类型，且两个极端值组间的标记为不同的类型；
(5)根据所筛选的标记所在的基因序列和位置设计引物；
(6)从不同于步骤(1)的马氏珠母贝群体中随机取若干个个体，测量每个个体的生长性状，以与步骤(1)相同的性状的测量值进行排序，以一定的比例挑选极大值和极小值个体，构成极大值组L’和极小值组S’；
(7)从极大值组L’和极小值组S’中随机挑选极端值个体作为鉴定样本，采用步骤(5)设计的引物对鉴定样本进行标记分型，进行基因型与鉴定样本的生长性状进行关联分析，筛选出显著关联的位点。
本发明的开发方法的优点：1、筛选的标记在生物学重复间为同一类型，易于发现与性状关联的标记；2、所鉴定的标记位于转录组差异表达基因库，其所在的基因为表型性状的功能基因，易于后续的性状解析。3、在发掘过程中结合应用了性状极端值个体，易于发掘与性状关联的标记，减少了工作量。
利用本发明的开发方法创造性地从差异表达基因中来筛选InDel，并与性状进行关联，开发了一个与性状关联的分子标记SNP441。利用该分子标记SNP441设计的检测引物组，能够对待测马氏珠母贝的分子标记SNP441进行基因型分型，筛选出生长优势个体用作后备亲本进行育种，实现分子标记辅助育种。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例：
从马氏珠母贝深圳群体中随机取100个个体，将贝体上的附着物清理干净。逐一对每个个体的壳长、高、宽和体重进行测量并记录。然后根据铰合线性状对这100个个体进行大小排序，取排位在前后各20％的个体作为样品，前20％的个体作为极大值组(L)，后20％的个体作为极小值组(S)。剖取外套膜组织，用液氮保存，用于RNA提取。
从L、S组分别取3个个体的固定组织，提取总RNA，进行转录组测序和组装。将CleanReads与参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息。
用皮尔逊相关系数r(Pearson Correlation Coefficient)作为生物学重复相关性的评估指标。
在差异表达基因检测过程中，以Fold Change≥2且FDR<0.01作为筛选标准。构建差异表达基因库。
采用软件SnpEff注释差异基因的变异(SNP、InDel)，根据变异位点在参考基因组上的位置以及参考基因组上的基因位置信息，得到变异位点在基因组发生的区域(基因间区、基因区或CDS区等)，以及变异产生的影响。
筛选SNP、indel标记。标记筛选标准为：针对同一个基因，极端值组内的标记在生物学重复间都为同一类型，且两个极端值组间的标记为不同的类型。根据该标准，筛选到1个差异表达基因的变异位点在L组的3个重复都为缺失，在S组的3个重复都为插入TC，该变异为预筛选出的标记，命名为SNP441(该InDel标记位于如SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第103位与104位碱基之间插入或缺失序列TNNN，其中，NNN表示为未知碱基和碱基数量)。
检测分型样品的准备。从马氏珠母贝深圳群体中随机取100个个体(不同于上述的马氏珠母贝深圳群体)，将贝体上的附着物清理干净。逐一对每个个体的壳长、高、宽和体重进行测量并记录。然后根据铰合线性状对这100个个体进行大小排序，取排位在前后各20％的个体作为样品，前20％的个体作为极大值组(L’)，后20％的个体作为极小值组(S’)(表1和表2)。取肌肉用95％乙醇固定，用于DNA提取。
表1 L’组样品信息
序号 壳高(mm) 壳长(mm) 铰合线(mm)
4 59.06 59.48 51.30
20 59.73 54.34 51.65
66 55.80 56.48 51.72
2 61.86 59.43 51.96
17 54.52 59.75 52.05
39 54.68 58.95 52.29
12 61.02 63.68 52.43
69 59.49 59.41 53.68
13 58.75 56.20 53.73
41 53.02 54.36 53.98
14 54.34 59.89 54.05
18 57.26 55.48 54.38
22 59.61 58.94 54.50
1 62.69 57.24 54.56
82 57.59 58.49 54.75
9 59.59 59.53 56.27
6 59.75 60.32 56.69
15 56.76 59.99 57.65
5 64.69 64.36 60.00
3 59.02 61.31 60.90
表2 S’组样品信息
Figure BDA0002515451060000071
Figure BDA0002515451060000081
根据SNP441标记所在的基因序列和位置设计引物。根据分型方法的不同来设计所需引物。本案例采用的分型方法为KASP方法，根据标记设计引物，引物序列如下：
Figure BDA0002515451060000082
从L’组随机取8个个体，S’组中随机取15个个体，提取DNA，进行等位基因特异的定量PCR，检测SNP441标记基因型。
竞争性等位基因特异性PCR的反应体系(4μL)：马氏珠母贝基因组DNA 40ng(1μL)，KASP V4.0 2×Master Mix 2μL，引物预混液0.056μL，用ddH2O补至4μL；反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃复性45s，共10个循环，每个循环降0.6℃；94℃变性20s，55℃复性45s，共37个循环。
其中，引物预混液是将上述的引物SNP441F1、SNP441F2和SNP441R稀释至100μM，分别得到SNP441F1稀释液、SNP441F2稀释液和SNP441R稀释液，然后将SNP441F1稀释液、SNP441F2稀释液、SNP441R稀释液与ddH2O按体积比12:12:30:46混合而成。
所述KASP V4.0 2×Master Mix(购自LGC公司)由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B、高保真的Taq酶和dNTP等组成。荧光探针A的序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，5’末端连接荧光基团FAM，发蓝色荧光；荧光探针B的序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接荧光基团HEX，发红色荧光；淬灭探针A的序列为5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。
对PCR扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析，若荧光信号在所得分型聚类图中呈现蓝色，则马氏珠母贝的SNP441标记基因型为AA型(代表为缺失型)，若荧光信号在所得分型聚类图中呈现红色，则马氏珠母贝的SNP441标记基因型为TT型(代表为插入型)，若荧光信号在所得分型聚类图中呈现绿色，则马氏珠母贝的SNP441标记基因型为TA型(代表杂合型)。
样品的基因型如下(表3)：L’组中AA型个体5个，TT型个体3个，AA型个体的比例为62.5％；S’组中，TT型个体有11个，AA型个体2个，TA型个体2个，TT型个体占比为73.3％。表明小型个体的基因型主要为TT型，而大型个体主要为AA型，该标记可用于后续筛选目标亲本。
表3检测样品的基因型
Figure BDA0002515451060000101
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记、检测引物组及开发方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 201
<212> DNA
<213> 马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)
<400> 1
agttctaatg tttgtataaa caaaccaatt aacgtaccaa acaatagtga aagcgcatgg 60
taaacaaaca attataggta acggtaacgc aggttgactg attaacgttg tttgatcgac 120
cgtgacatcg agattaatta agggggatga cagttaatta gataatatca ttacggaaac 180
aatgatatgt gcatgtttca t 201
<210> 2
<211> 205
<212> DNA
<213> 马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)
<400> 2
agttctaatg tttgtataaa caaaccaatt aacgtaccaa acaatagtga aagcgcatgg 60
taaacaaaca attataggta acggtaacgc aggttgactg atttnnnaac gttgtttgat 120
cgaccgtgac atcgagatta attaaggggg atgacagtta attagataat atcattacgg 180
aaacaatgat atgtgcatgt ttcat 205
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat tggtaacgca ggttgactga ttt 43
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tggtaacgca ggttgactga tta 43
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taactgtcat cccccttaat taatc 25

Claims (8)

1.一种与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记，其特征在于，所述的InDel标记位于如SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第103位与104位碱基间插入或缺失序列TC。
2.一种权利要求1所述的与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记的检测引物组，其特征在于，包括以下引物：
SNP441F1：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTAACGCAGGTTGACTGATTT-3’；
SNP441F2：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTAACGCAGGTTGACTGATTA-3’；
SNP441R：5’-TAACTGTCATCCCCCTTAATTAATC-3’。
3.权利要求1所述的InDel标记或权利要求2所述的检测引物组在马氏珠母贝分子标记辅助育种中的应用。
4.一种检测马氏珠母贝具有生长优势的个体的方法，其特征在于，包括以下步骤：通过对待测马氏珠母贝中的权利要求1所述的与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记进行基因型分型，若待测马氏珠母贝的基因型为缺失型，则待测马氏珠母贝为可能具有生长优势的个体，确定其作为后备亲本进行育种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：提取待测马氏珠母贝的基因组DNA作为模板，采用权利要求2所述的检测引物组进行等位基因特异的定量PCR，对PCR扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析，若荧光信号在所得分型聚类图中呈现蓝色，则待测马氏珠母贝在权利要求1所述的InDel标记的基因型为缺失型，则待测马氏珠母贝为可能具有生长优势的个体，确定其作为后备亲本进行育种；所述的定量PCR的体系中含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B，所述的荧光探针A的序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，5’ 末端连接荧光基团FAM，发蓝色荧光；所述的荧光探针B的序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’ 末端连接荧光基团HEX，发红色荧光；所述的淬灭探针A的序列为5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ；所述的淬灭探针B的序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的等位基因特异的定量PCR，其PCR反应体系包括：马氏珠母贝基因组DNA 40 ng，KASP V4.0 2×Master Mix 2 μL，引物预混液0.056 μL，用ddH2O补至4 μL；所述的引物预混液是将权利要求2所述的引物SNP441F1、SNP441F2和SNP441R稀释至100 μM，分别得到SNP441F1稀释液、SNP441F2稀释液和SNP441R稀释液，然后将SNP441F1稀释液、SNP441F2稀释液、SNP441R稀释液与ddH2O按体积比12:12:30:46混合而成。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的等位基因特异的定量PCR，其PCR反应程序为：94℃预变性15 min；94℃变性20 s，61℃-55℃复性45 s，共10个循环，每个循环降0.6℃；94℃变性20 s，55℃复性45 s，共37个循环。
8.一种用于检测权利要求1所述的与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的与马氏珠母贝生长性状关联的InDel标记的检测引物组。
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