CN106967803A - 一种检测萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因的高通量分子标记及应用 - Google Patents

一种检测萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因的高通量分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo的高通量分子标记及其应用。本发明所提供的高通量分子标记是用于检测萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo的KASP引物，引物序列是SEQ ID1～3所述的核苷酸序列。本发明基于萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo的序列设计高通量KASP专用引物，采用PCR SNPLine平台检测Rfo基因的基因型，具有操作流程全自动，通量高，适合大量样品同时检测。本发明用于萝卜Ogura类型细胞质雄性不育系的转育，可以大大节约时间和人力，提高育种效率。

Description

一种检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因的高通量分子标记及 应用
技术领域
本发明涉及一套检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的KASP标记引物及其应用，属于分子遗传育种技术领域。
背景技术
雄性不育系和自交不亲和系是萝卜利用杂种优势的两个主要途径。与自交不亲和系相比，雄性不育系具有两个明显的优势，一是可以提高杂交种的纯度，二是可以避免亲本的流失，从而保证育种家的利益。目前，在萝卜中发现了不同类型的雄性不育细胞质，如Ogura、金花薹48A、Kosena、NWB和DCGMS，其中应用最广泛且研究最深入的是Ogura雄性不育细胞质。
细胞质雄性不育系的转育是萝卜杂种优势利用和配制杂交种的关键，传统的回交转育方法费时费力，主要过程包括，获得萝卜Ogura-CMS不育源后，选择多个综合性状优良、配合力好的自交系做父本分别与不育源杂交；淘汰杂交后代全部为可育的自交系；对于杂交后代出现育性分离或全不育的自交系，可作为轮回亲本，以杂交后代或回交后代中的不育株做母本，进行6-7代连续回交，最终获得遗传背景相似的不育系和相应的保持系。
从分子水平上来说，萝卜Ogura-CMS属质核互作雄性不育类型，植株育性是由线粒体不育基因orf138和细胞核育性恢复基因orf687(Rfo)相互作用控制的。在不育系中ORF138蛋白在线粒体内膜上积累，干扰其他线粒体基因(atp6、atp8、cox I等)的功能，导致雄性不育的发生。Ogura-CMS的育性可由细胞核内育性恢复基因(Rfo)恢复，该基因编码一种PPR蛋白，包含687个氨基酸，能够阻止花药绒毡层中ORF138蛋白的合成，从而使雄性不育系恢复育性(Desloire et al，2003)。
分子标记的开发将极大地提高不育系转育的效率，萝卜Ogura-CMS细胞核育性恢复基因orf687(Rfo)及相应的等位基因(rfo，没有恢复功能)的高效鉴定其中的关键技术。Yasumoto等(2008)根据不育系和恢复系中orf687(Rfo)基因序列差异开发了PCR-RFLP标记，并用于研究恢复基因在日本野萝卜中的分布频率。在此基础上，Sun等(2012)利用该标记应用于萝卜雄性不育系的辅助选择。但PCR-RFLP标记需要结合PCR扩增、限制性内切酶消化和凝胶电泳过程，不但对DNA质量要求较高、经常由于反应条件不稳定造成精确度降低，而且不能实现高通量、大样品的检测。KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)分型技术，能够对基因组中SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断，具有灵敏度高、高通量、低成本、快速等优点，是目前国际上SNP分析的主流方法之一。因此，本发明开发了一种基于KASP分型技术的萝卜Rfo基因SNP分子标记并应用于萝卜雄性不育系的转育。
发明内容
本发明的目的之一是提供一套用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的KASP专用引物。
本发明所述的KASP专用引物包括以下3条引物：
(1)引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATG-3’；其由GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为标签序列A；
(2)引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATA-3’；其中GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为标签序列B；
(3)引物3：5’-GAAAGGAAACAGATTCGATGTGATATATACA-3’。
更加具体的，引物1为核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA；引物2为核苷酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA；引物3为核苷酸序列如序列表中序列3所示的单链DNA。
本发明的目的之二是提供一种用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的试剂盒含有所述KASP引物，还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。
在本发明中所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和淬灭探针B是存在于KASP V4.02×Master Mix，其中所述KASP V4.0 2×Master Mix是英国LGC公司产品，产品目录号为KBS-1016-002，适用于96/384的孔板。
本发明的目的之三是提供利用KASP标记引物检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型的方法。
检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型的方法包括如下步骤：以萝卜基因组DNA为模板，采用所述试剂盒中的KASP引物进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下所述判定待测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型：若待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为RfRf(SNP分型为A：A基因型)；若所述待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为rfrf(SNP分型为G：G基因型)；若所述待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为Rfrf(SNP分型为A：G基因型)。
本发明的目的之四是提供利用KASP标记引物辅助选择培育萝卜Ogura类型雄性不育系的方法。
本发明提供的培育萝卜Ogura类型雄性不育系的方法包括如下步骤：利用已公开的萝卜Ogura-CMS线粒体不育基因orf138筛选获得不含有orf138基因的萝卜单株；利用所述试剂盒中的KASP引物对筛选获得的单株进行育性恢复基因Rfo的基因型鉴定，获得Rfo基因的基因型为rfrf的单株，以萝卜Ogura-CMS不育株为母本，以筛选获得的Rfo基因的基因型为rfrf的单株为父本和轮回亲本，进行连续6-7代回交和轮回亲本自交，即可获得遗传背景一致、稳定遗传的萝卜不育系和相应的保持系。
本发明的有益效果：
本发明公开了一种用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的高通量分子标记及其应用。本发明基于萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的序列设计高通量KASP专用引物，采用PCRSNPLine平台检测Rfo基因的基因型，具有操作流程全自动，通量高，适合大量样品同时检测。本发明用于萝卜Ogura类型细胞质雄性不育系的转育，可以大大节约时间和人力，提高育种效率，加速萝卜不育系的转育。
附图说明
图1、萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo及其等位基因rfo序列比对示意图。
图2、利用高通量KASP分子标记分析11份自交系育性恢复基因Rfo的SNP分型结果示意图。其中，NTC表示空白对照(黑色)，？表示由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型(粉色)，A：A为红色，A：G为绿色，G：G为蓝色。
图3、利用PCR-RFLP标记检测待测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型。
图4、利用高通量KASP分子标记分析部分单株恢复基因Rfo的SNP分型结果示意图。其中，NTC表示空白对照(黑色)，？表示由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型(粉色)，A：A为红色，A：G为绿色，G：G为蓝色。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解。
下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的高通量KASP标记及其专用引物序列的开发
利用NCBI网上公布的萝卜Ogura-CMS育性恢复基因的一对等位基因的序列信息，即Rfo(AJ535623)和rfo(AJ535624)，经DNAMAN软件比对发现上述Rfo/rfo基因CDS在354bp处存在的A-G碱基突变位点如图1所示。
根据此SNP位点设计高通量KASP分子标记：
Rfo-F：5’-CAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATG-3’；
rfo-F：5’-CAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATA-3’；
Rfo/rfo-R：5’-GAAAGGAAACAGATTCGATGTGATATATACA-3’。
针对SNP位点，将Rfo-F和rfo-F在5’端加上相应的荧光标签序列，如下：
Rfo-F adaptor：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(FAM荧光标签序列)；
rfo-F adaptor：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(HEX荧光标签序列)。
得到相应的萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的高通量分子标记专用引物序列：
引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATG-3’(其中下划线部分为FAM荧光标签序列)；
引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATA-3’(其中下划线部分为HEX荧光标签序列)；
引物3：5’-GAAAGGAAACAGATTCGATGTGATATATACA-3’。
上述引物由上海生工公司北京合成部合成。
实施例2、利用高通量KASP标记检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因的方法及验证分析
(1)供试材料
供试体材料包括11份萝卜高代自交系材料。根据传统基因型检测方法，每份材料与Ogura-CMS不育系进行杂交，通过调查后代植株的育性分离比例确定它们的恢复基因(Rfo)的基因型。具体为，保持系材料育性恢复基因的基因型为rf/rf，材料包括FWB16-1、FWB16-2和FWB16-3；恢复系材料育性恢复基因的基因型为Rf/Rf，材料包括P12、P14、P19、FW16-9、P23、P25、FW16-2、FW16-11。
(2)基因组DNA提取
取萝卜幼嫩叶片采用CTAB法提取基因组DNA。
(3)PCR扩增
以步骤(2)提取的基因组DNA为模板，用实施例1开发的用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的KASP专用引物进行PCR扩增。
KASP基因分型PCR反应体系：
96孔板：10ng基因组DNA，5μl KASP V4.0 2×Master Mix，0.14μl KASP 72×assay mix，加ddH2O至10μl。
384孔板：5ng DNA，2.5μl KASP V4.0 2×Master Mix，0.07μl KASP 72×assaymix，加ddH2O至5μl。
其中，KASP V4.0 2×Master Mix为LGC公司产品，产品目录号为KBS-1016-002。KASP V4.0 2×Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等组成。荧光探针A的序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，5’末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5，-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。
KASP 72×assay mix由浓度为100μM的引物1、引物2、引物3与ddH2O按12∶12∶30∶46的体积比混合得到。
梯度PCR反应程序包括：95℃变性15min；10个循环，94℃变性20s，61℃(-0.6℃/循环)退火60s；26个循环，94℃变性20s，55℃退火60s。其中PCR水浴热循环为Hydrocycler16-32高通量热循环系统，适用于96和384孔板。
实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照，每个PCR板设置1个空白对照。
(4)PCR扩增产物的荧光扫描
采用双向单激发读板仪PHERAstar对PCR扩增产物进行扫描，FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm，HEX激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。每个PCR扩增产物样本设置3个重复。
(5)等位基因分型
采用KrakenTM软件对双向单激发读板仪PHERAstar扫描数据分析(公众可以直接从LGC公司购买分析软件)，根据分析结果按照如下所述判定待测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型：聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，显示粉色的样本可能由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型，左下角显示黑色的样本为空白对照。
具体而言，如图2所示：若待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为RfRf(SNP分型为A：A基因型)；若所述待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为rfrf(SNP分型为G：G基因型)；若所述待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为Rfrf(SNP分型为A：G基因型)。
(6)PCR-RFLP标记检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型
本发明的发明人采用现有报道的PCR-RFLP标记检测供试萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型，具体参见“Yasumoto K，Matsumoto Y，Terachi T，YamagishiH.Restricted distribution of orf687 as the pollen fertility restorer gene forOgura male sterility in Japanese wild radish.Breeding Science，2008，58：177-182”和“Sun XJ，Liu Y，Wang LJ，et al.Molecular characterization of the Rs-Rf1gene and molecular marker-assisted development of elite radish(Raphanussativus L.)CMS lines with a functional marker for fertilityrestoration.Molecular Breeding，2012，30：727-1736”文中根据Rfo/rfo基因序列关键位点开发的PCR-RFLP标记及其操作过程。
具体分型结果如图3所示，orf687(Rfo)在所有供试材料中均有扩增，利用Ssp I酶切后，供试材料FWB16-1、FWB16-2和FWB16-3获得1888bp和414bp两条带，表明其基因型为rf/rf；供试材料P12、P14、P19、FW16-9、P23、P25、FW16-2、FW16-11获得1544bp、414bp和344bp三条带，表明其基因型为Rf/Rf。
以上所述，本发明分别利用传统常规杂交方法、PCR-RFLP标记和KASP标记三种方法对供试材料育性恢复基因的基因型进行鉴定，如表1所示，三种方法的鉴定结果吻合率为100％。
表1供试材料育性恢复基因Rfo的基因型分析结果与表型比较分析
材料编号 传统常规方法 PCR-RFLP标记 KASP标记 是否吻合
FWB16-1 可育，保持系，rf/rf 两条带 G：G 是
FWB16-2 可育，保持系，rf/rf 两条带 G：G 是
FWB16-3 可育，保持系，rf/rf 两条带 G：G 是
P12 可育，恢复系，Rf/Rf 三条带 A：A 是
P14 可育，恢复系，Rf/Rf 三条带 A：A 是
P19 可育，恢复系，Rf/Rf 三条带 A：A 是
FW16-9 可育，恢复系，Rf/Rf 三条带 A：A 是
P23 可育，恢复系，Rf/Rf 三条带 A：A 是
P25 可育，恢复系，Rf/Rf 三条带 A：A 是
FW16-2 可育，恢复系，Rf/Rf 三条带 A：A 是
FW16-11 可育，恢复系，Rf/Rf 三条带 A：A 是
实施例3、高通量KASP标记在培育萝卜Ogura-CMS不育系中的应用。
(1)供试材料包括23个萝卜品种的297个单株，每个材料包含8-15株(详见表2)。
(2)采用现有报道的萝卜Ogura-CMS细胞质不育基因orf138对供试材料的细胞质不育基因进行鉴定，具体参见“Yasumoto K，Matsumoto Y，Terachi T，YamagishiH.Restricted distribution of orf687 as the pollen fertility restorer gene forOgura male sterility in Japanese wild radish.Breeding Science，2008，58：177-182”文中关于orf138基因的鉴定方法。
根据orf138基因的鉴定结果，选择不含有orf138基因的单株，利用高通量KASP分子标记对育性恢复基因Rfo的基因型进行鉴定。
(3)参照实施例2中的方法，利用高通量KASP标记对不含orf138基因的单株进行育性恢复基因Rfo的基因型进行鉴定(结果见表2和图4)。
(4)根据步骤(3)的分型结果获得Rfo基因的基因型为rfrf的单株，以萝卜Ogura-CMS不育系为母本，以筛选获得的Rfo基因的基因型为rfrf的单株为父本和轮回亲本，进行连续6-7代回交，同时进行轮回亲本的自交，即可获得遗传背景一致、稳定遗传的萝卜不育系和相应的保持系。
表2供试材料育性恢复基因Rfo的基因型检测结果

Claims (5)

1.用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的KASP标记专用引物，其特征在于包括：
(1)引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATG-3’；其中GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为标签序列A。所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA。
(2)引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATA-3’；其中GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为标签序列B；所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA。
(3)引物3：5’-GAAAGGAAACAGATTCGATGTGATATATACA-3’。所述引物3为序列表中序列3所示的单链DNA。
2.用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的试剂盒，其特征在于包括：
(1)所述试剂盒中含有权利要求1中所述的KASP引物；
(2)所述试剂盒中含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述荧光探针A的核苷酸序列与权利要求1所述标签序列A的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团FAM；所述淬灭探针A的核苷酸序列与权利要求1所述标签序列A的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团BHQ；所述荧光探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团HEX；所述淬灭探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团BHQ。
3.权利要求1中所述的KASP引物或权利要求2所述的试剂盒用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型和培育萝卜不育系。
4.权利要求3中所述的检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型的方法，其特征在于包括如下步骤：以萝卜基因组DNA为模板，采用权利要求2所述试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下所述判定待测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的基因型：若待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为RfRf；若所述待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为rfrf；若所述待测萝卜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测萝卜的Rfo基因的基因型为Rfrf。
5.权利要求3中所述的培育萝卜不育系的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)利用已公开的萝卜Ogura-CMS线粒体不育基因orf138筛选获得不含有orf138基因的萝卜单株。
(2)利用权利要求4所述的检测方法对(1)中筛选获得的单株进行育性恢复基因Rfo的基因型鉴定，获得Rfo基因的基因型为rfrf的单株。
(3)以萝卜Ogura-CMS不育株为母本，上述(2)筛选获得的单株为父本和轮回亲本，进行连续6-7代回交和轮回亲本单株自交，即可获得遗传背景一致、稳定遗传的萝卜不育系和相应的保持系。
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