CN109628634A - 分子标记MtD4在鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育中的应用 - Google Patents

分子标记MtD4在鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了分子标记MtD4在鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育中的应用。以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段；该DNA片段即为与胡萝卜瓣化型雄性不育相关的分子标记MtD4。引物F和引物R的核苷酸序列依次如序列表中的序列8和序列9所示。分子标记MtD4具体可为DNA片段1或DNA片段2。DNA片段1和DNA片段2的核苷酸序列依次如序列表中的序列14和序列15所示。携带DNA片段1且不携带DNA片段2的胡萝卜品种为瓣化型雄性不育。应用本发明提供的分子标记MtD4，能快速筛选出瓣化型雄性不育的胡萝卜品种。本发明具有重要的应用价值。

Description

分子标记MtD4在鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育中的应用
技术领域
本发明属于育种领域，具体涉及分子标记MtD4在鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育中的应用。
背景技术
由于胡萝卜属异花授粉作物，花器小，人工授粉困难，目前关于胡萝卜自交不亲和性尚不清楚，因而利用胡萝卜雄性不育系成为杂种培育的关键，没有人工授粉和去雄等繁杂程序，生产成本较低，并能确保杂种一代的种子纯度。
现有的胡萝卜栽培品种雄性不育源主要来自于野生种，均为细胞质雄性不育(Cytoplamic male sterility，CMS)(方智远等.2017.中国蔬菜育种学，北京：中国农业出版社.268-269.)。胡萝卜的雄性不育分为褐色花药型和雄蕊瓣化型两种类型。褐色花药型基本表现为花药褐色、变形，主要由于绒毡层细胞和小孢子发生异常，提早衰败，减数分裂过程不能正常进行，这种不育类型难以获得稳定不育株系，并没有在实际生产中加以利用。雄蕊瓣化型是胡萝卜所特有的，基本表征为雄蕊特化成花瓣或叶片状结构，呈“勺状”、“舌形”、“心皮形”等，无小孢子发生组织，而蜜腺、雌蕊等其它花器官基本正常，这是目前培育胡萝卜杂交种的主要不育源。
Nakajima等(Nakajima Y.，Yamamoto T，Muranaka T and Oeda K，1999.Geneticvariation of petaloid male-sterile cytoplasm of carrot revealed by sequencetagged sites(STSs).Theor Appl Genet 99:837–843.)采用RAPD和STS标记对13份不育系和可育系材料的线粒体DNA进行了定性研究，获得了可以区分不育系和可育系的两个特异标记STS1和STS4，STS1标记含有一段与orfB基因同源序列，STS4标记结构较为复杂，含有一段类反转录转座子序列和小片段叶绿体DNA序列，但这两个标记不能用于多种基因型瓣花型不育系和保持系的鉴定。于春霞等(于春霞，梁毅，李龙年.2007.瓣化型胡萝卜雄性不育基因atp6的CAPS标记建立.中国农学通报，23(12)：68-72.)基于线粒体基因atp6开发CAPS标记鉴定瓣化型雄性不育系H05A及其保持系H05B，不育系中可产生60bp特异片段，但此标记并未在其它材料中验证。
发明内容
本发明的目的是提供用于鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育的分子标记MtD4。
本发明首先保护特异引物对，可由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成；所述特异DNA片段中具有胡萝卜基因组中引物F和引物R组成的引物对的靶序列；
所述引物F可为如下a1)或a2)：
a1)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
a2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物R可为如下a3)或a4)：
a3)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
a4)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子。
所述特异引物对具体可由所述引物F和所述引物R组成。
所述特异引物对的功能可为如下b1)-b5)中的任一种：
b1)鉴定待测胡萝卜携带DNA片段1还是DNA片段2；
b2)筛选携带所述DNA片段1且不携带所述DNA片段2的胡萝卜品种；
b3)筛选携带所述DNA片段2且不携带所述DNA片段1的胡萝卜品种；
b4)鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育；
b5)筛选瓣化型雄性不育的胡萝卜品种；
所述DNA片段1的核苷酸序列如序列表中序列14所示；
所述DNA片段2的核苷酸序列如序列表中序列15所示。
所述特异引物对用于扩增下述与胡萝卜瓣化型雄性不育相关的分子标记MtD4。
本发明还保护一种试剂盒，包括上述任一所述特异引物对。
所述试剂盒中还可包括用于PCR扩增的常规试剂和/或用于基因组提取的常规试剂和/或用于琼脂糖凝胶电泳的常规试剂。
所述试剂盒的功能可为如下b1)-b5)中的任一种：
b1)鉴定待测胡萝卜携带DNA片段1还是DNA片段2；
b2)筛选携带所述DNA片段1且不携带所述DNA片段2的胡萝卜品种；
b3)筛选携带所述DNA片段2且不携带所述DNA片段1的胡萝卜品种；
b4)鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育；
b5)筛选瓣化型雄性不育的胡萝卜品种；
所述DNA片段1的核苷酸序列如序列表中序列14所示；
所述DNA片段2的核苷酸序列如序列表中序列15所示。
本发明还保护上述任一所述特异引物对或上述任一所述试剂盒的应用，可为如下b1)-b5)中的任一种：
b1)鉴定待测胡萝卜携带DNA片段1还是DNA片段2；
b2)筛选携带所述DNA片段1且不携带所述DNA片段2的胡萝卜品种；
b3)筛选携带所述DNA片段2且不携带所述DNA片段1的胡萝卜品种；
b4)鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育；
b5)筛选瓣化型雄性不育的胡萝卜品种；
所述DNA片段1的核苷酸序列如序列表中序列14所示；
所述DNA片段2的核苷酸序列如序列表中序列15所示。
应用所述特异引物对或所述试剂盒鉴定待测胡萝卜携带DNA片段1还是DNA片段2的方法如下：以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中具有266bp的DNA片段且不具有525bp的DNA片段、则待测胡萝卜携带所述DNA片段1且不携带所述DNA片段2，如果PCR扩增产物中具有525bp的DNA片段且不具有266bp的DNA片段、则待测胡萝卜携带所述DNA片段2且不携带所述DNA片段1。
应用所述特异引物对或所述试剂盒筛选携带所述DNA片段1且不携带所述DNA片段2的胡萝卜品种的方法如下：以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中具有266bp的DNA片段且不具有525bp的DNA片段、待测胡萝卜为候选的携带所述DNA片段1且不携带所述DNA片段2的胡萝卜品种，否则待测胡萝卜不为候选的携带所述DNA片段1且不携带所述DNA片段2的胡萝卜品种。
应用所述特异引物对或所述试剂盒筛选携带所述DNA片段2且不携带所述DNA片段1的胡萝卜品种的方法如下：以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中具有525bp的DNA片段且不具有266bp的DNA片段、待测胡萝卜为候选的携带所述DNA片段2且不携带所述DNA片段1的胡萝卜品种，否则待测胡萝卜不为候选的携带所述DNA片段2且不携带所述DNA片段1的胡萝卜品种。
应用所述特异引物对或所述试剂盒鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育的方法如下：以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中具有266bp的DNA片段且不具有525bp的DNA片段、待测胡萝卜为瓣化型雄性不育，如果PCR扩增产物中具有525bp的DNA片段且不具有266bp的DNA片段、待测胡萝卜不为瓣化型雄性不育。
应用所述特异引物对或所述试剂盒筛选瓣化型雄性不育的胡萝卜品种的方法如下：以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中具有266bp的DNA片段且不具有525bp的DNA片段、待测胡萝卜为候选的瓣化型雄性不育的胡萝卜品种，否则待测胡萝卜不为候选的瓣化型雄性不育的胡萝卜品种。
本发明还保护以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对扩增得到的DNA片段。所述DNA片段即为本发明要保护的与胡萝卜瓣化型雄性不育相关的分子标记MtD4。所述分子标记MtD4具体可为所述DNA片段1和/或所述DNA片段2。
本发明还保护所述DNA片段(即所述分子标记MtD4)的应用，可为b4)或b5)：
b4)鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育；
b5)筛选瓣化型雄性不育的胡萝卜品种。
应用所述分子标记MtD4鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育的方法如下：如果所述待测胡萝卜基因组中具有所述DNA片段1且不具有所述DNA片段2、待测胡萝卜为瓣化型雄性不育，如果所述待测胡萝卜基因组中具有所述DNA片段2且不具有所述DNA片段1、待测胡萝卜不为瓣化型雄性不育。
应用所述分子标记MtD4筛选瓣化型雄性不育的胡萝卜品种的方法如下：如果所述待测胡萝卜基因组中具有所述DNA片段1且不具有所述DNA片段2、待测胡萝卜为候选的瓣化型雄性不育的胡萝卜品种，否则待测胡萝卜不为候选的瓣化型雄性不育的胡萝卜品种。
所述DNA片段1和/或所述DNA片段2也属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述DNA片段1和/或所述DNA片段2的应用，可为b4)或b5)：
b4)鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育；
b5)筛选瓣化型雄性不育的胡萝卜品种。
本发明还保护一种鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育的方法，可包括如下步骤：检测待测胡萝卜的基因型为基因型III还是基因型III’，基因型III的胡萝卜为瓣化型雄性不育，基因型III’的胡萝卜不为瓣化型雄性不育；所述基因型III为待测胡萝卜的基因组DNA中含有所述DNA片段1且不含有所述DNA片段2；所述基因型III’为待测胡萝卜的基因组DNA中含有所述DNA片段2且不含有所述DNA片段1。
上述方法中，所述检测待测胡萝卜的基因型为基因型III还是基因型III’的方法可为G1)或G2)：
G1)以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中具有266bp的DNA片段且不具有525bp的DNA片段、则待测胡萝卜的基因型为基因型III，如果PCR扩增产物中具有525bp的DNA片段且不具有266bp的DNA片段、则待测胡萝卜的基因型为基因型III’；
G2)以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行测序；如果PCR扩增产物含有序列表中的序列14所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列15所示的核苷酸序列、待测胡萝卜的基因型为基因型III，如果PCR扩增产物含有序列表中的序列15所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列14所示的核苷酸序列、则待测胡萝卜的基因型为基因型III’。
实验证明，携带所述DNA片段1且不携带所述DNA片段2的胡萝卜品种为瓣化型雄性不育。应用本发明提供的分子标记MtD4，能快速筛选出瓣化型雄性不育的胡萝卜品种，从而加速胡萝卜品种的育成步伐。本发明具有重要的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中基因组DNA的提取方法参考如下文献：Briard M，et al.Modifiedprotocols for rapid carrot genomic DNA extraction and AFLPTM analysis usingsilver stain or radioisotopes.Plant Molecular Biology Reporter，2000，18:235-241.
下述实施例中线粒体DNA的提取方法参考如下文献：张智等.2010.胡萝卜叶片线粒体DNA的提取方法.中国农学通报，26(13)：58-62.
胡萝卜瓣化型CMS系“50119”及其保持系“澳K”记载于如下文献中：欧承刚,庄飞云,赵志伟,胡鸿,裴红霞.2009.胡萝卜根粗和根长的遗传及其杂种优势分析.园艺学报,36(1):115-120。在下文中，胡萝卜瓣化型CMS系“50119”简称为胡萝卜50119；胡萝卜瓣化型CMS系“50119”的保持系“澳K”简称为胡萝卜澳K。
实施例1、线粒体单倍型特异(Mitotype-specific sequence，MSS)分子标记的开发和多态性检测
一、MSS分子标记的开发
1、分别提取胡萝卜50119和胡萝卜澳K的线粒体DNA，然后进行线粒体基因组测序。
2、完成步骤1后，将胡萝卜50119的线粒体基因组测序结果和胡萝卜澳K的线粒体基因组测序结果进行比对分析，获得3个MSS序列(依次命名为MSS序列2-MSS序列4)。MSS序列2的核苷酸序列如序列表中序列1所示。MSS序列3的核苷酸序列如序列表中序列2所示。MSS序列4的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
3、基于MSS序列2在胡萝卜线粒体基因组的两种变异形式，开发分子标记MtD2。
扩增分子标记MtD2的核苷酸序列如下：
MtD2F：5’-GCGCTAAGCAAGAAGGAAAGC-3’(序列表中的序列4)；
MtD2R：5’-TGCAAGTTGAAGCAAAAGGGTAG-3’(序列表中的序列5)。
4、基于MSS序列3在胡萝卜线粒体基因组的两种变异形式，开发分子标记MtD3。
扩增分子标记MtD3的核苷酸序列如下：
MtD3F：5’-AAGTAGTCTTGGTGCCAGAGC-3’(序列表中的序列6)；
MtD3R：5’-CTCCTAATGCAGCTACGAAGGG-3’(序列表中的序列7)。
5、基于MSS序列4在胡萝卜线粒体基因组的两种变异形式，开发分子标记MtD4。
扩增分子标记MtD4的核苷酸序列如下：
MtD4F：5’-AGCATTGTCCGAGTTAGTAGGC-3’(序列表中的序列8)；
MtD4R：5’-ACATGGCTGGCTACATACAAGT-3’(序列表中的序列9)。
二、多态性检测一
待测胡萝卜为胡萝卜50119或胡萝卜澳K。
A、分子标记MtD2的多态性检测
1、提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用MtD2F和MtD2R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型A(显示一条带，为210bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型I；如果PCR扩增产物为带型A’(显示一条带，为281bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型I’。
结果表明，胡萝卜50119的基因型为基因型I，胡萝卜澳K的基因型为基因型I’。
B、分子标记MtD3的多态性检测
1、提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用MtD3F和MtD3R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型B(显示一条带，为304bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型II；如果PCR扩增产物为带型B’(显示一条带，为586bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型II’。
结果表明，胡萝卜50119的基因型为基因型II，胡萝卜澳K的基因型为基因型II’。
C、分子标记MtD4的多态性检测
1、提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用MtD4F和MtD_4R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型C(显示一条带，为266bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型III；如果PCR扩增产物为带型C’(显示一条带，为525bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型III’。
结果表明，胡萝卜50119的基因型为基因型III，胡萝卜澳K的基因型为基因型III’。
三、多态性检测二
待测胡萝卜为胡萝卜50119或胡萝卜澳K。
A、分子标记MtD2的多态性检测
1、提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用MtD2F和MtD2R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行如下判断：如果PCR扩增产物含有序列表中的序列10所示的核苷酸序列(即210bp的核苷酸序列)且不含有序列表中的序列11所示的核苷酸序列(即281bp的核苷酸序列)，则待测胡萝卜的基因型为基因型I；如果PCR扩增产物含有序列表中的序列11所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列10所示的核苷酸序列，则待测胡萝卜的基因型为基因型I’。
结果表明，胡萝卜50119的基因型为基因型I，胡萝卜澳K的基因型为基因型I’。
B、分子标记MtD3的多态性检测
1、提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用MtD3F和MtD3R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行如下判断：如果PCR扩增产物含有序列表中的序列12所示的核苷酸序列(即304bp的核苷酸序列)且不含有序列表中的序列13所示的核苷酸序列(即586bp的核苷酸序列)，则待测胡萝卜的基因型为基因型II；如果PCR扩增产物含有序列表中的序列13所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列12所示的核苷酸序列，则待测胡萝卜的基因型为基因型II’。
结果表明，胡萝卜50119的基因型为基因型II，胡萝卜澳K的基因型为基因型II’。
C、分子标记MtD4的多态性检测
1、提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用MtD4F和MtD4R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行如下判断：如果PCR扩增产物含有序列表中的序列14所示的核苷酸序列(即266bp的核苷酸序列)且不含有序列表中的序列15所示的核苷酸序列(即525bp的核苷酸序列)，则待测胡萝卜的基因型为基因型III；如果PCR扩增产物含有序列表中的序列15所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列14所示的核苷酸序列，则待测胡萝卜的基因型为基因型III’。
结果表明，胡萝卜50119的基因型为基因型III，胡萝卜澳K的基因型为基因型III’。
多态性检测二的检测结果和多态性检测一的检测结果完全一致。
上述结果表明，步骤一开发的分子标记MtD2、分子标记MtD3和分子标记MtD4均具有较高的多态性。
实施例2、MSS分子标记的应用
本实施例中的PCR反应体系均为10μL，由1μL待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA(浓度为50-100ng/μL)、1μL 10×PCR反应缓冲液(含Mg2+)、1μL dNTPs(浓度为2.5mM)、0.2μL上游引物(浓度为10μM)、0.2μL下游引物(浓度为10μM)、0.2μL Taq DNA聚合酶(浓度为2.5U/μL)和6.4μL ddH2O组成。
10×PCR反应缓冲液(含Mg2+)为天根生化科技(北京)有限公司的产品。
本实施例中的PCR反应程序均为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
一、应用一
待测胡萝卜为从美国农业部蔬菜研究中心(VCRU，ARS-USDA)引进保存的16个胡萝卜材料，公众可以从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。16个胡萝卜材料的编号见表1中第1列，育性类型见表1中第2列。
1、提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA。
2、分别以待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，采用MtD2F和MtD2R组成的引物对(MtD2F为上游引物，MtD2R为下游引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型A(显示一条带，为210bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型I；如果PCR扩增产物为带型A’(显示一条带，为281bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型I’。
实验结果见表1中第3列。结果表明，育性类型为CMS的胡萝卜材料的基因型均为基因型I，育性类型为保持系的胡萝卜材料的基因型均为基因型I’。分子标记MtD2的符合率为100％。
表1
材料编号 育性类型 分子标记MtD2 分子标记MtD3 分子标记MtD4
2566A CMS 210bp 304bp 266bp
2566B 保持系 281bp 586bp 525bp
3640A CMS 210bp 304bp 266bp
3640B 保持系 281bp 586bp 525bp
4367A CMS 210bp 304bp 266bp
4367B 保持系 281bp 586bp 525bp
6274A CMS 210bp 304bp 266bp
6274B 保持系 281bp 586bp 525bp
6333A CMS 210bp 304bp 266bp
6333B 保持系 281bp 586bp 525bp
6366A CMS 210bp 304bp 266bp
6366B 保持系 281bp 586bp 525bp
7254A CMS 210bp 304bp 266bp
7254B 保持系 281bp 586bp 525bp
8080A CMS 210bp 304bp 266bp
8080B 保持系 281bp 586bp 525bp
4、分别以待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，采用MtD3F和MtD3R组成的引物对(MtD3F为上游引物，MtD3R为下游引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
5、将步骤4得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型B(显示一条带，为304bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型II；如果PCR扩增产物为带型B’(显示一条带，为586bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型II’。
实验结果见表1中第4列。结果表明，育性类型为CMS的胡萝卜材料的基因型均为基因型II，育性类型为保持系的胡萝卜材料的基因型均为基因型II’。分子标记MtD3的符合率为100％。
6、分别以待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，采用MtD4F和MtD4R组成的引物对(MtD4F为上游引物，MtD4R为下游引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
7、将步骤6得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型C(显示一条带，为266bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型III；如果PCR扩增产物为带型C’(显示一条带，为525bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型III’。
实验结果见表1中第5列。结果表明，育性类型为CMS的胡萝卜材料的基因型均为基因型III，育性类型为保持系的胡萝卜材料的基因型均为基因型III’。分子标记MtD4的符合率为100％。
二、应用二
待测胡萝卜为20个胡萝卜材料。20个胡萝卜材料的编号和品种名称记载于如下文献中：中国蔬菜品种资源目录.第一册.中国农业科学院蔬菜花卉研究所主编.北京：万国学术出版社.1992.p60-71.中国蔬菜品种资源目录.第二册.中国农业科学院蔬菜花卉研究所主编.北京：气象出版社.1998.P38-44.20个胡萝卜材料的编号见表2中第1列，根色见表2中第2列，育性类型均为可育(见表2中第3列)。
1、提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA。
2、分别以待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，采用MtD2F和MtD2R组成的引物对(MtD2F为上游引物，MtD2R为下游引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型A(显示一条带，为210bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型I；如果PCR扩增产物为带型A’(显示一条带，为281bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型I’。
实验结果见表2中第4列。结果表明，材料编号为V01B0159、V01B0165和V01B0232的胡萝卜材料的基因型均为基因型I，其它胡萝卜材料的基因型均为基因型I’。分子标记MtD2的符合率为85％。
表2
4、分别以待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，采用MtD3F和MtD3R组成的引物对(MtD3F为上游引物，MtD3R为下游引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
5、将步骤4得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型B(显示一条带，为304bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型II；如果PCR扩增产物为带型B’(显示一条带，为586bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型II’。
实验结果见表2中第5列。结果表明，材料编号为V01B0388的胡萝卜材料的基因型均为基因型II，其它胡萝卜材料的基因型均为基因型II’。分子标记MtD3的符合率为95％。
6、分别以待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，采用MtD4F和MtD4R组成的引物对(MtD4F为上游引物，MtD4R为下游引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
7、将步骤6得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型C(显示一条带，为266bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型III；如果PCR扩增产物为带型C’(显示一条带，为525bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型III’。
实验结果见表2中第6列。结果表明，20个胡萝卜材料的基因型均为基因型III’。分子标记MtD4的符合率为100％。
三、应用三
待测胡萝卜为9个胡萝卜品种(商业途径获得)。WC1602、WC1604、WC1701、WC1702和WC1703为上海惠和种业有限公司的产品。SK316为日本坂田种苗株式会社的产品。红誉6号和红誉7号为大连米可多国际种苗有限公司的产品。皇家红为青岛圣派华种苗有限公司的产品。9个胡萝卜品种的编号见表3中第1列，育性类型见表3中第2列。
1、提取待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA。
2、分别以待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，采用MtD2F和MtD2R组成的引物对(MtD2F为上游引物，MtD2R为下游引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型A(显示一条带，为210bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型I；如果PCR扩增产物为带型A’(显示一条带，为281bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型I’。
实验结果见表3中第3列。结果表明，育性类型为可育的胡萝卜材料的基因型均为基因型I’，育性类型为不育的胡萝卜材料的基因型均为基因型I。分子标记MtD2的符合率为100％。
表3
材料编号 育性类型 分子标记MtD2 分子标记MtD3 分子标记MtD4
WC1602 不育 210bp 304bp 266bp
WC1604 不育 210bp 304bp 266bp
WC1701 不育 210bp 304bp 266bp
WC1702 不育 210bp 304bp 266bp
WC1703 不育 210bp 304bp 266bp
SK316 不育 210bp 304bp 266bp
红誉6号 可育 281bp 586bp 525bp
红誉7号 可育 281bp 586bp 525bp
皇家红 不育 210bp 304bp 266bp
4、分别以待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，采用MtD3F和MtD3R组成的引物对(MtD3F为上游引物，MtD3R为下游引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
5、将步骤4得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型B(显示一条带，为304bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型II；如果PCR扩增产物为带型B’(显示一条带，为586bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型II’。
实验结果见表3中第4列。结果表明，育性类型为可育的胡萝卜材料的基因型均为基因型II’，育性类型为不育的胡萝卜材料的基因型均为基因型II。分子标记MtD3的符合率为100％。
6、分别以待测胡萝卜幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，采用MtD4F和MtD4R组成的引物对(MtD4F为上游引物，MtD4R为下游引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
7、将步骤6得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果PCR扩增产物为带型C(显示一条带，为266bp)，则待测胡萝卜的基因型为基因型III；如果PCR扩增产物为带型C’(显示一条带，为525bp)，则待测胡萝卜的基因型为III’。
实验结果见表3中第5列。结果表明，育性类型为可育的胡萝卜材料的基因型均为基因型III’，育性类型为不育的胡萝卜材料的基因型均为基因型III。分子标记MtD4的符合率为100％。
上述结果表明，采用分子标记MtD4可以判断胡萝卜材料是否为瓣化型雄性不育，且准确率为100％。
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 分子标记MtD4在鉴定胡萝卜瓣化型雄性不育中的应用
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gaatgttttc gtttcatata tatggaaaag ctagcaatgc catttcccta ccgataagct 60
ataacttgaa c 71
<210> 2
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
agctagaggt aggcgaagaa gtgctataag gtgcatcata agaagtcttt gtatcatagt 60
tgttgccatc atagctatca gaagaagtgc tataaggtgc attagtagaa gttgtatccc 120
gttctctttg cacacgttct gtatcatagt agtcccgcgc agaggtagaa gttgtatctg 180
ctgtatcata gttgttgcta gagcagctat cattgtcacc agagctagtt gaagaatggt 240
tagagctatc attgccagag ctagttgaag aatggttctc ag 282
<210> 3
<211> 264
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
tcctgctctc gagggggcgg gctcctggag cgaactactc attgctgtgt tgccccaacc 60
caaggaaggg cacttggtga ggagcattgt tttgaggtag ggaaagcgtg gttgacaaac 120
cacttcgagg aggcgactgg ggtgctttca tcaaatgatg catgtgggct gagccattcc 180
catcccaagc ggtggcccga ttcggcctgg cccggtcggg aagagagtca catagagact 240
actactctcc gggaatctct ttct 264
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gcgctaagca agaaggaaag c 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
tgcaagttga agcaaaaggg tag 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
aagtagtctt ggtgccagag c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
ctcctaatgc agctacgaag gg 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
agcattgtcc gagttagtag gc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
acatggctgg ctacatacaa gt 22
<210> 10
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
gcgctaagca agaaggaaag ctgttagagc tctatagcag taaaacctac caatgggttt 60
accctaggga taagcttgaa aaacaagaat gttttcgttt catatatatg gaaaagctag 120
caatgccatt tccctaccga gaagctataa cttgaacgaa tgttttcgtt tcatatagct 180
gcaaaaccta cccttttgct tcaacttgca 210
<210> 11
<211> 281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
gcgctaagca agaaggaaag ctgttagagc tctatagcag taaaacctac caatgggttt 60
accctaggga taagcttgaa aaacaagaat gttttcgttt catatatatg gaaaagctag 120
caatgccatt tccctaccga taagctataa cttgaacgaa tgttttcgtt tcatatatat 180
ggaaaagcta gcaatgccat ttccctaccg ataagctata acttgaacga atgttttcgt 240
ttcatatagc tgcaaaacct acccttttgc ttcaacttgc a 281
<210> 12
<211> 304
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
aagtagtctt ggtgccagag ctagaggtag gcgaagaagt gctattcctg aaagcgagtg 60
agtagaccta tatacggtat acgaacgata gaagacaaag aaaagaaaga agtgctagct 120
ggtgtcgcct tctctcttac ttatctattc ccatccatct tccctggaag gaagcctaat 180
ggtatgattt cagatcatgc ttggggcgct tccgactgtc ttagtgcttt tgaagtatcc 240
attgaaatat ctctttcagt gcccggtttc cacaaagcat tgcccttcgt agctgcatta 300
ggag 304
<210> 13
<211> 586
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
aagtagtctt ggtgccagag ctagaggtag gcgaagaagt gctataaggt gcatcataag 60
aagtctttgt atcatagttg ttgccatcat agctatcaga agaagtgcta taaggtgcat 120
tagtagaagt tgtatcccgt tctctttgca cacgttctgt atcatagtag tcccgcgcag 180
aggtagaagt tgtatctgct gtatcatagt tgttgctaga gcagctatca ttgtcaccag 240
agctagttga agaatggtta gagctatcat tgccagagct agttgaagaa tggttctcag 300
aagtagtatt gggcgaagaa gtgctattcc tgaaagcgag tgagtagacc tatatacggt 360
atacgaacga tagaagacaa agaaaagaaa gaagtgctag ctggtgtcgc cttctctctt 420
acttatctat tcccatccat cttccctgga aggaagccta atggtatgat ttcagatcat 480
gcttggggcg cttccgactg tcttagtgct tttgaagtat ccattgaaat atctctttca 540
gtgcccggtt tccacaaagc attgcccttc gtagctgcat taggag 586
<210> 14
<211> 266
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
agcattgtcc gagttagtag gcagcgccta ccaagcaaag ctttcttgaa gaggctgggc 60
tggttccttt tcggcgtcca ccccttcttt atttagatgt tgaggcaagg caagccccag 120
gaaagtatag gctggctccc agctccatct cggccggcat cctgctctcg agggggcggg 180
ctttcctatg ggagtcccgc tgcgacctct gaccgtccgt cccgtctcat cttgatttgg 240
ctatacttgt atgtagccag ccatgt 266
<210> 15
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
agcattgtcc gagttagtag gcagcgccta ccaagcaaag ctttcttgaa gaggctgggc 60
tggttccttt tcggcgtcca cccctattta gatgttgagg caaggcaagc cccaggaaag 120
tataggctgg ctcccagctc catctcggcc ggcatcctgc tctcgagggg gcgggctcct 180
ggagcgaact actcattgct gtgttgcccc aacccaagga agggcacttg gtgaggagca 240
ttgttttgag gtagggaaag cgtggttgac aaaccacttc gaggaggcga ctggggtgct 300
ttcatcaaat gatgcatgtg ggctgagcca ttcccatccc aagcggtggc ccgattcggc 360
ctggcccggt cgggaagaga gtcacataga gactactact ctccgggaat ctctttctat 420
gttagcttgc gggggcgggc tttcctatgg gagtcccgct gcgacctctg accgtccgtc 480
ccgtctcatc ttgatttggc tatacttgta tgtagccagc catgt 525

Claims (10)

1.特异引物对，由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成；所述特异DNA片段中具有胡萝卜基因组中引物F和引物R组成的引物对的靶序列；
所述引物F为如下a1)或a2)：
a1)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
a2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物R为如下a3)或a4)：
a3)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
a4)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子。
2.如权利要求1所述的特异引物对，其特征在于：所述特异引物对由所述引物F和所述引物R组成。
3.一种试剂盒，包括权利要求1或2所述特异引物对。
4.权利要求1或2所述特异引物对、或、权利要求3所述试剂盒的应用，为如下b1)-b5)中的任一种：
b1)鉴定待测胡萝卜携带DNA片段1还是DNA片段2；
b2)筛选携带所述DNA片段1且不携带所述DNA片段2的胡萝卜品种；
b3)筛选携带所述DNA片段2且不携带所述DNA片段1的胡萝卜品种；
b4)鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育；
b5)筛选瓣化型雄性不育的胡萝卜品种；
所述DNA片段1的核苷酸序列如序列表中序列14所示；
所述DNA片段2的核苷酸序列如序列表中序列15所示。
5.以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述特异引物对扩增得到的DNA片段。
6.权利要求5所述DNA片段的应用，为b4)或b5)：
b4)鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育；
b5)筛选瓣化型雄性不育的胡萝卜品种。
7.DNA片段1和/或DNA片段2；
所述DNA片段1的核苷酸序列如序列表中序列14所示；
所述DNA片段2的核苷酸序列如序列表中序列15所示。
8.权利要求7所述DNA片段1和/或所述DNA片段2的应用，为b4)或b5)：
b4)鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育；
b5)筛选瓣化型雄性不育的胡萝卜品种。
9.一种鉴定待测胡萝卜是否为瓣化型雄性不育的方法，包括如下步骤：检测待测胡萝卜的基因型为基因型III还是基因型III’，基因型III的胡萝卜为瓣化型雄性不育，基因型III’的胡萝卜不为瓣化型雄性不育；
所述基因型III为待测胡萝卜的基因组DNA中含有权利要求7所述DNA片段1且不含有所述DNA片段2；所述基因型III’为待测胡萝卜的基因组DNA中含有权利要求7所述DNA片段2且不含有所述DNA片段1。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述检测待测胡萝卜的基因型为基因型III还是基因型III’的方法为G1)或G2)：
G1)以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用权利要求2所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中具有266bp的DNA片段且不具有525bp的DNA片段、则待测胡萝卜的基因型为基因型III，如果PCR扩增产物中具有525bp的DNA片段且不具有266bp的DNA片段、则待测胡萝卜的基因型为基因型III’；
G2)以待测胡萝卜的基因组DNA为模板，采用权利要求2所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行测序；
如果PCR扩增产物含有序列表中的序列14所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列15所示的核苷酸序列、待测胡萝卜的基因型为基因型III，
如果PCR扩增产物含有序列表中的序列15所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列14所示的核苷酸序列、则待测胡萝卜的基因型为基因型III’。
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