CN108754017A - 一种辅助检测大豆油脂含量高低的caps标记及其应用 - Google Patents

一种辅助检测大豆油脂含量高低的caps标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辅助检测大豆油脂含量的CAPS标记及其应用，涉及遗传育种技术领域，采用本发明的CAPS标记鉴定大豆油脂含量高低时，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物是否两条带或者仅一条带产物。若酶切产物中含有两条主带，被检测的大豆材料为低油脂含量的大豆，若酶切产物只有一条主带，则被检测的大豆材料为高油脂含量的大豆。本发明的优点在于：提供了一种辅助检测大豆油脂含量的分子标记，该分子标记为一种新的鉴定大豆油脂含量的CAPS标记，能够方便、有效、准确的鉴定出大豆油脂含量高低，利用本发明的分子标记可以筛选油脂含量高和油脂含量低的大豆材料，提高育种过程中选择油脂含量高的大豆品种的效率，并且可以加快油脂含量低大豆的育种进程。

Description

一种辅助检测大豆油脂含量高低的CAPS标记及其应用
技术领域
本发明涉及的是遗传育种技术领域，尤其涉及的是与大豆油脂含量高低相关的CAPS标记及其检测方法。
背景技术
大豆是世界上最重要的油料作物，大豆油占全球植物油产量的30％左右，脂肪酸约占大豆种子质量的20％,脂肪酸在若干疾病的预防和治疗方面起重要作用，包括癌症，心脏疾病和近视等。大豆油脂还能作为生物柴油的重要原料。因此提高大豆油脂含量不仅对人类健康有重要作用，而且对于经济和能源的开发应用也具有重要作用。
大豆的种子油脂含量由多个数量性状位点(QTL)或基因和各种环境条件控制。因此，使用传统的育种方法复杂且难以提高大豆的产量。分子标记为育种者寻找新的变异来源提供了快速而准确的方法，也可以用于调查控制数量遗传性状的遗传因子。使用分子标记间接选择重要的农艺性状(如种子大小种子油脂含量等)或标记辅助选择(MAS)可以提高传统植物育种计划的效率。大豆育种的主要目标是改善种子产品的质量以满足人类和/或动物的需求。随着大豆共有遗传图谱的发展，分子标记显着促进了许多大豆群体中控制重要数量性状的常见QTL的鉴定。然而，大多数鉴定的QTL/SNP标记很少应用于大豆的育种计划。据报道，通过全基因组鉴定的SNP基因型有效地促进了关联分析在作物中QTL作图的适用性。具有SNP标记的GWAS已经在许多植物物种中进行了各种重要性状的鉴定，并且能够鉴定不同作物中广泛复杂性状的致病基因，包括拟南芥，玉米，高粱和大豆。因此，鉴定与种子油脂含量相关性状相关的SNP位点将有助于在大豆育种进程。
基于PCR的标记已被广泛用作快速和可靠地检测SNP的手段，SNP产生特异性限制性位点以区分一对等位基因。衍生的限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术分析使我们能够区分不同的单核苷酸变化，不产生限制性位点差异的等位基因。是用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很少，以至无多态出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性。是PCR标记的有力补充。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种用于辅助检测大豆种子油脂含量的CAPS标记及其应用，以解决难以有效筛选大豆种子油脂含量高和油脂含量低以及现有筛选技术稳定性较差等问题。
本发明提供一种大豆油脂含量显著相关的SNP标记，所述SNP标记为碱基C或G，位于大豆第18号染色体54211957bp处。
进一步，本发明还提供一种以上述的SNP标记开发的CAPS标记，所述CAPS标记具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其中，所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列中，自5’端起的第250bp为所述SNP标记，n＝g或c。
进一步，本发明还提供一种用于扩增上述CAPS标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：
F：AATACTCGGACACTCCCACCT SEQ ID NO.2
R：ATTCTAACCTCCCATACCCAT SEQ ID NO.3。
进一步，本发明还提供一种利用上述CAPS的引物对鉴定大豆油脂含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提取待测大豆基因组DNA；
(2)以SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所述的序列为引物，对步骤1提取的待测大豆基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物：
(3)将扩增产物用Ava11限制性核酸内切酶进行酶切，获得酶切产物，若酶切产物仅含一条主带，则对应待测大豆油脂含量高；若酶切产物包含两条主带，则对应待测大豆油脂含量低。栽培大豆油脂含量通常在18％-20％左右，油脂含量在18％以下为低油脂含量品种，油脂含量在23％以上为高油脂含量品种。
进一步，所述PCR扩增的扩增体系为：2.0μL的模板DNA(100ng/μL)，2.0μL的10×Buffer,2.0μL dNTPs，引物各(10μM)0.5μL,1.0U ex-Taq酶0.2μL，ddH2O 12.8μL；反应条件为：95℃变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共循环36次；最后72℃延伸10min。
进一步，所述步骤3中反应体系组成：3.8μL ddH2O，10×Buffer1μL，PCR产物5μL，0.2μL Ava11限制性核酸内切酶，反应条件为：酶切温度37℃，酶切反应时间为3h。
本发明还提供一种如上述CAPS标记在辅助选择大豆油脂含量高低中的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
(1)标记稳定：本研究鉴定了在多种环境或遗传背景下使用不同群体在大豆中稳定和有效的一个SNP位点。该SNP位点对大豆籽粒油脂含量具有显著的选择性。
(2)快速准确：通过本发明，只需提取大豆基因组DNA进行PCR扩增，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，即可有效的鉴定大豆籽粒油脂含量的高低。实现筛选大豆油脂含量差异材料的第一步。因此该分子标记在今后的大豆籽粒油脂含量辅助选择育种中具有巨大的应用前景。
(3)本发明提出了一种辅助检测大豆种质资源油脂含量的引物和检测方法。
附图说明
图1为20份油脂含量极值的来自1600份全国大豆精准鉴定种质资源的大豆品种的CAPS标记PCR扩增片段基因琼脂糖凝胶电泳系统检测结果示意图。
其中：M为2K Marker，编号1-10为油脂含量高的材料，编号11-20为油脂含量低的材料。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一
本实施例提供一种大豆油脂含量显著相关的SNP标记，SNP标记为碱基C或G，位于大豆第18号染色体54211957bp处。
实施例二
本实施例提供一种根据实施例一中SNP标记开发的CAPS标记，该CAPS标记具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其中，在SEQ ID NO.1的核苷酸序列中，自5’端起的第250位碱基n＝g或c为实施例一种的SNP标记。
实施例三
本实施例提供一种用于扩增实施例二中CAPS标记的引物对，该引物对的核苷酸序列为：
F：AATACTCGGACACTCCCACCT SEQ ID NO.2
R：ATTCTAACCTCCCATACCCAT SEQ ID NO.3。
实施例四
本实施例提供一种利用实施例三中CAPS的引物对鉴定大豆油脂含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提取待测大豆基因组DNA；
(2)以SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所述的序列为引物，对步骤1提取的待测大豆基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物：
PCR扩增的扩增体系为：2.0μL的模板DNA(100ng/μL)，2.0μL的10×Buffer,2.0μLdNTPs，引物各(10μM)0.5μL,1.0U ex-Taq酶0.2μL，ddH2O 12.8μL；反应条件为：95℃变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共循环36次；最后72℃延伸10min；
(3)将扩增产物用Ava11限制性核酸内切酶进行酶切，反应体系组成：3.8μLddH2O，10×Buffer1μL，PCR产物5μL，0.2μL Ava11限制性核酸内切酶，反应条件为：酶切温度37℃，酶切反应时间为3h，获得酶切产物；
(4)若酶切产物仅含一条主带，则对应待测大豆油脂含量高；若酶切产物包含两条主带，则对应待测大豆油脂含量低。
研究选用1600份全国大豆精准鉴定种质资源(由中国农业科学院作物科学研究所提供)中油脂含量高的品种10份，油脂含量低的品种10份，共20份材料，详细材料清单如附表1。
表1选择的20份栽培大豆的籽粒油脂含量
附表2选择的20份栽培大豆籽粒油脂含量方差分析结果
研究选用10份高油脂含量品种Mean±SD为24.668±0.55567％,标准误(SE)为0.17572；10份低油脂含量品种Mean±SD为16.676±0.81775％，标准误(SE)为0.2586。P＝0.000方差分析结果表明，大豆籽粒油脂含量与所述基因表现为极显著相关。所述分子标记为一种新的鉴定大豆油脂含量的CAPS标记，能够方便、有效、准确的鉴定出大豆油脂含量高低，利用本发明的分子标记可以筛选油脂含量高和油脂含量低的大豆材料，提高育种过程中选择油脂含量高的大豆品种的效率，并且可以加快油脂含量低大豆的育种进程。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种辅助检测大豆油脂含量高低的CAPS标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 989
<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max L. Merr)
<220>
<221> mutation
<222> (250)..(250)
<223> n is g or c
<220>
<221> misc_feature
<222> (250)..(250)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 1
aatactcgga cactcccacc ttacctataa ctatttgctt aaagaaaata cttcttagat 60
tgatcaataa ataaccatta ggagtgaatt cagttcccta atgataatta gagatacatt 120
acctaaaaat gataatcttg tgaaatggct cataagtcta aagccaacta agatatataa 180
aataaccaca taaatattaa ggtaagagac tattaatttt cattcattat tctcatttat 240
tactattggn accttagtgt tgaaatgtct tatataggta tcctaacttt cgaccagcct 300
gccaaatatt atttggaaaa ataacatcac ctaaaggact tacacaaaca gaaaatttat 360
ctgtctactc tgtgtaggta cacaaactaa aggcaattat tttagtgaag gtaattaaaa 420
gggcaagagt agttgtgtta ttttaccgtt caaaagcaac ttagtgctta ttttcaccaa 480
tattatttta agactgcttg ctattcatat aatctcataa tccccatgac agaattaaaa 540
tgttggttaa aaacgactag gattgtcgga gataaacaat gcaagagaaa aacaaagata 600
aacaatttca attcacctag cctgcttgat ggggtattgg tttccttaca gaaacaaaca 660
accataaggc agcaatttat caacgtaacg ctactatttg gtaatcctgg tcaaaacgga 720
aaaacattca gtaattttag tttgtaaaag cataaatata tatatacttt gcatttaccg 780
tggtacaata aaaactgaat aatgctaata aactatgttc tcacacctat tttattatag 840
tagaaaatgt cttcttagag ttttggttca tagatgagtc ttaccatgca tcaaatgaaa 900
atgtgggtgt gaatacgaaa attttggcac atcactatca ttttgaaagg ggagtactta 960
tttattatat gggtatggga ggttagaat 989
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequence)
<400> 2
aatactcgga cactcccacc t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic sequence)
<400> 3
attctaacct cccataccca t 21

Claims (7)

1.一种大豆油脂含量显著相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记为碱基C或G，位于大豆第18号染色体54211957bp处。
2.一种以如权利要求1所述的SNP标记开发的CAPS标记，其特征在于，所述CAPS标记具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其中，所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列中，自5’端起的第250位碱基为所述SNP标记，n＝g或c。
3.一种用于扩增权利要求2所述CAPS标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为：
F：aatactcggacactcccacct SEQ ID NO.2
R：attctaacctcccatacccat SEQ ID NO.3。
4.一种利用如权利要求3所述CAPS的引物对鉴定大豆油脂含量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)提取待测大豆基因组DNA；
(2)以SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所述的序列为引物，对步骤1提取的待测大豆基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物：
(3)将扩增产物用Ava11限制性核酸内切酶进行酶切，获得酶切产物；
(4)若酶切产物仅含一条主带，则对应待测大豆油脂含量高；若酶切产物包含两条主带，则对应待测大豆油脂含量低。
5.根据权利要求4所述的鉴定大豆油脂含量的方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系为：2.0μL的模板DNA(100ng/μL)，2.0μL的10×Buffer,2.0μL dNTPs，引物各(10μM)0.5μL,1.0U ex-Taq酶0.2μL，ddH2O 12.8μL；反应条件为：95℃变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共循环36次；最后72℃延伸10min。
6.根据权利要求5所述的鉴定大豆油脂含量的方法，其特征在于，所述步骤3中反应体系组成：3.8μL ddH2O，10×Buffer1μL，PCR产物5μL，0.2μL Ava11限制性核酸内切酶，反应条件为：酶切温度37℃，酶切反应时间为3h。
7.一种如权利要求2所述CAPS标记在辅助选择大豆油脂含量高低中的应用。
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