CN116397042A - 与大豆百粒重相关的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与大豆百粒重相关的SNP标记及其应用，该SNP标记为大豆基因组版本Glycine max Wm82.a2.v1的Chr18:3450376，该SNP标记的多态性为G或A。本发明基于该SNP标记开发了一种辅助检测大豆百粒重的dCAPS分子标记，所述dCAPS分子标记的碱基转换位点位于第18号染色体3450376位，扩增所述dCAPS分子标记的引物组的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。利用该SNP(G/A)非同义突变以及设计出的dCAPS分子标记引物，可实现快速准确的检测大豆百粒重大/小的品种，实现筛选百粒重大或小的大豆品种的目的。

Description

与大豆百粒重相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种与大豆百粒重相关的SNP标记，以及基于该SNP标记开发的dCAPS分子标记在辅助检测大豆百粒重中的应用。

背景技术

大豆育种的关键不仅在于亲本选配，更主要的是对性状的选择。百粒重(hundred-grain weight)指的是100粒种子的重量，以克表示，是体现种子大小与充实程度的一项指标，其是构成大豆产量的重要农艺性状。

在大豆产量的构成因素中，百粒重既是一个遗传力较高的性状，也是一个对外界环境比较敏感的性状。常规育种年限长、效率低且成本高，而分子标记反映生物个体基因组DNA片段的差异，直接反应种质资源本质，具有高效、准确以及经济等优点，能够大幅缩短育种周期，是传统育种技术的有力补充。

基于PCR的dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)技术通过在扩增引物中加入错配碱基，结合SNP位点引入限制性内切酶位点，从而可以酶切检测几乎所有SNPs。该技术自发明以来大量应用于分子遗传学及种质资源品种品系鉴定等方面研究，且相比于传统测基因型来说具有耗时短、成本低及操作简单的优点。

本发明致力于阐明一种与大豆百粒重相关的SNP标记，以及基于该SNP标记开发的dCAPS分子标记在辅助检测大豆百粒重中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明有必要提供一种与大豆百粒重相关的SNP标记，利用该SNP(G/A)非同义突变以及设计出的dCAPS分子标记引物，即可实现快速准确的检测大豆百粒重大/小的品种，实现筛选百粒重大或小的大豆品种的目的，且该dCAPS分子标记适用测定的大豆品种更为广泛，能够显著提高鉴定的准确度。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供了一种与大豆百粒重相关的SNP标记，所述SNP标记为大豆基因组版本Glycine max Wm82.a2.v1的Chr18:3450376，该SNP标记的多态性为G或A。

本发明进一步提供了一种辅助检测大豆百粒重的dCAPS分子标记，所述dCAPS分子标记的碱基转换位点位于第18号染色体3450376位，扩增所述dCAPS分子标记的引物组的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。该dCAPS分子标记的引物长度精简为25bp左右，从而能够显著的提高扩增效率。

本发明进一步提供了如前所述的dCAPS分子标记在辅助检测大豆百粒重中的应用。

本发明进一步提供了用于检测如前所述的dCAPS分子标记的试剂或试剂盒在辅助检测大豆百粒重中的应用，所述试剂或试剂盒中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物组。

本发明进一步提供了一种用于辅助检测大豆百粒重的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒中包含如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物组。

进一步方案，所述试剂或试剂盒中，包含限制性内切酶Hind III。

本发明进一步提供了一种辅助检测大豆百粒重的方法，包括以下步骤：

提取大豆全基因组DNA；

采用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物组对提取的大豆基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

采用限制性内切酶Hind III对所述扩增产物进行酶切，获得酶切产物；

对酶切产物进行电泳检测，根据酶切产物的条带类型判断大豆百粒重。

进一步方案，所述PCR扩增的体系包括：7.5μL 2×Rapid Taq Master Mix，0.6μL上游引物，0.6μL下游引物，2μL大豆基因组DNA和4.3μL ddH₂O。

进一步方案，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，循环36次；72℃延伸5min；4℃保存。

进一步方案，根据酶切产物的条带类型判断大豆百粒重具体为：

若酶切产物为长度168bp的特征条带，判断被检测大豆材料为百粒重小的大豆；若酶切产物为两条长度分别为144bp、24bp的特征条带，判断被检测大豆材料为百粒重大的大豆。

本发明的有益效果：

本发明通过对大豆品种的全基因组DNA序列分析发现SNP标记Chr18:3450376，该SNP标记的多态性为G或A，其与大豆百粒重显著相关。因此，基于该SNP标记开发了用于辅助检测大豆百粒重的dCAPS分子标记。

通过本发明的dCAPS分子标记，只需提取大豆总基因组DNA序列进行PCR扩增，酶切后进行电泳检测，根据条带数量和大小的不同，即可快速准确的鉴定大豆百粒重大/小的品种。实现快速筛选百粒重大或者小的大豆品种的目的。

本发明鉴定了多种环境和遗传背景下的不同群体，结果表明，本发明中的dCAPS分子标记与大豆百粒重显著相关，该dCAPS分子标记可作为大豆百粒重分子标记辅助育种新工具，并对大豆百粒重具有显著的选择性。

本发明同时设计了辅助检测大豆种质资源百粒重的引物和检测方法，对大豆优异种质资源的筛选鉴定具有重要意义。

附图说明

图1为实施例3中扩增产物琼脂糖电泳图，M为2K Marker，编号1-4条带大小是144bp,为百粒重小的材料；编号5-8条带大小是168bp，为百粒重大的材料。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。

实施例1确认SNP标记

通过大豆基因组重测序数据(数据来源https://sfgb.rmbreeding.cn/index)，经过分析发现SNP标记突变位点位于大豆基因组第18号染色体3450376处，该SNP标记的多态性为G或A。

实施例2设计引物

利用在线软件dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计上游引物，Primer 5.0软件设计下游引物，根据SNP位点处碱基的差异，在特异性扩增引物F端引入可以使用限制性内切酶Hind III进行酶切的错配碱基A，得到用于扩增dCAPS分子标记的引物组：

上游引物为：5’-TGATTCACTCTAGGTTATCTGTGAA-3’(SEQ ID No.1)；

下游引物为：5’-ATCTATCTAAACTAGTGGGAAAATG-3’(SEQ ID No.2)。

实施例3辅助检测大豆百粒重的方法

1、提取大豆全基因组DNA

本实施例中以8份已知基因型的大豆材料(编号和具体信息为：1-四粒圆；2-横阳青皮豆；3-蒙81104；4-红黑豆；5-Athow；6-赶乱子；7-Flyer；8-亳县千斤豆)作为待测大豆样品，采用CTAB法提取大豆样品全基因组DNA，具体步骤如下：

(1)在2mL离心管中加入适量磨碎后的样品，加入800μL CTAB提取液，混匀后置于65℃水浴锅10min，每3min上下翻转一次；

(2)加入800μL核酸提取液(24：1)，振荡1min后，12000rpm离心5min，吸取上清液600μL(不能吸取到其他层)转入新的1.5mL离心管；

(3)加入等体积异丙醇(预冷)，上下翻转10次左右，静置2min，12000rpm离心5分钟，弃上清；

(4)加入500μL 70％乙醇(预冷)，用枪头轻轻吹打清洗DNA絮状沉淀(注意不能将沉淀吹散)，12000rpm离心2分钟，弃乙醇；

(5)通风橱中风干30min，加入100μL ddH₂O溶解；

(6)使用紫外可见分光光度计检测DNA纯度和浓度，置于-20℃冰箱保存。

2、PCR扩增

以步骤1中各待测大豆全基因组DNA为模板，采用实施例2中设计的引物组进行PCR扩增，获得扩增产物；

其中，PCR扩增体系如下：

具体的扩增程序为：

3、酶切

采用限制性内切酶Hind III对步骤2中的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；

其中，具体的酶切体系如下：

酶切程序为：37℃酶切3h。

4、电泳检测

取10μL步骤3中得到的酶切产物采用4％琼脂糖凝胶电泳检测。

若酶切产物中含有144bp和24bp两条带即为带型I，则判断被检测的大豆材料为百粒重小的大豆；若酶切产物中仅含有168bp一条带即为带型II，则判断被检测的大豆材料百粒重大的大豆。

本实施例中电泳检测结果如图1中所示的，可以看出，编号1-4条带大小是144bp为带型I，为百粒重小的大豆；编号5-8条带大小为168bp为带型II，为百粒重大的大豆。

实施例4

本实施例中，利用上述dCAPS分子标记及大豆百粒重的检测方法对101份大豆核心种质资源材料进行基检测，并在2018、2019和2020三个年份的百粒重进行方差分析，从而验证该dCAPS分子标记的可靠性。

结果见表1和表2。

表1三年大豆百粒重的方差分析

备注：表1中，在最大的平均数上标上字母a，与之相差显著的平均数，标记字母b。

通过表1中的结果可以看出，本发明中公开的dCAPS分子标记适用于2018-2020三年的百粒重数据分析，并具有显著性差异。

表2 101份大豆核心种质资源的带型

根据表2中带型分型结果显示，101份大豆材料中，带型I材料有71份，带型II材料有30份，可以看出，采用本发明中的dCAPS分子标记和以及基于该dCAPS分子标记的大豆百粒重检测方法，能够很好的检测出百粒重的品种，且其适用范围更广，准确度高。通过本实施例中同时对101份大豆材料SNP检测和3年的百粒重数据相关性分析，本发明中的分子标记适用测定大豆品种更广泛，并且能够显著提高鉴定的准确度。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种与大豆百粒重相关的SNP标记在辅助检测大豆百粒重中的应用，其特征在于，所述SNP标记为大豆基因组版本Glycine max Wm82.a2.v1的Chr18:3450376，该SNP标记的多态性为G或A。

2.一种辅助检测大豆百粒重的dCAPS分子标记，其特征在于，所述dCAPS分子标记的碱基转换位点位于第18号染色体3450376位，扩增所述dCAPS分子标记的引物组的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求2所述的dCAPS分子标记在辅助检测大豆百粒重中的应用。

4.用于检测如权利要求2所述的dCAPS分子标记的试剂或试剂盒在辅助检测大豆百粒重中的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物组。

5.一种用于辅助检测大豆百粒重的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒中包含如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物组。

6.如权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒中，包含限制性内切酶Hind III。

7.一种辅助检测大豆百粒重的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取大豆全基因组DNA；

采用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的引物组对提取的大豆基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

采用限制性内切酶Hind III对所述扩增产物进行酶切，获得酶切产物；

对酶切产物进行电泳检测，根据酶切产物的条带类型判断大豆百粒重。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系包括：7.5μL 2×RapidTaq Master Mix，0.6μL上游引物，0.6μL下游引物，2μL大豆基因组DNA和4.3μL ddH₂O。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，循环36次；72℃延伸5min；4℃保存。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，根据酶切产物的条带类型判断大豆百粒重具体为：

若酶切产物为长度168bp的特征条带，判断被检测大豆材料为百粒重小的大豆；若酶切产物为两条长度分别为144bp、24bp的特征条带，判断被检测大豆材料为百粒重大的大豆。

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