CN113637790B

CN113637790B - 抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用

Info

Publication number: CN113637790B
Application number: CN202110932690.4A
Authority: CN
Inventors: 黄林; 胡燕灵; 王芳; 刘登才; 伍碧华; 张连全; 袁中伟; 甯顺腙; 郝明; 姜博
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2021-08-13
Filing date: 2021-08-13
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2041-08-13
Also published as: CN113637790A

Abstract

本发明公开了一种抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用，该KASP分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明基于KASP原理以及功能型YrAS2388R和非功能型YrAS2388S基因外显子区内的单碱基差异设计KASP分子标记，本发明的KASP分子标记能区分YrAS2388R纯合抗病和杂合抗病位点，能实现对节节麦抗条锈病基因YrAS2388的高通量检测，能够对YrAS2388R位点分子标记辅助育种高效、准确选择。

Description

抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及一种抗条锈病基因分子标记，具体涉及一种抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用。

背景技术

小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的世界性真菌病害。条锈病在一般流行年份可导致5～25％的小麦产量损失，大流行年份甚至绝收。实践证明，培育推广抗条锈病品种是防治条锈病最经济、有效、安全且环保的措施。

传统的小麦抗病品种培育基于对植株抗性表型选择，具有耗费时间长，抗性鉴定结果易受环境条件的影响，准确性差和效率低。利用分子标记辅助选择育种，能够实现对抗病基因型的直接选择，简单快速；不仅能够降低育种成本，加快选育进程，而且可以实现多基因的聚合育种，提高育种效率。传统的PCR分子标记，如SSR(microsatellites/simplesequence repeat)、CAPS(cleaved amplifiedpolymorphic sequence)，检测技术均依赖凝胶电泳，CAPS标记还需要酶切等繁琐程序，标记存在小麦品种特异性，扩增重复性差，检测效率低下。

单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是指基因组内单个核苷酸改变而引起的DNA序列多态性。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allelespecific PCR，KASP)是一种以SNP为基础的第三代新型基因分型技术。该技术基于PCR过程中引物末端碱基的特异性匹配，实现对SNP/InDel(insertion-deletion)分型，能够精确区分双等位基因。KASP技术不依赖实验室凝胶电泳，具有高通量、遗传稳定性好、检测成本低、准确性高，适宜规模化自动化筛查等特点。目前，KASP标记在小麦基因定位、图位克隆以及分子标记辅助选择育种中广为应用。

YrAS2388基因源自节节麦材料AS2388，是一个已克隆的小麦条锈病抗性基因，编码典型的抗病基因蛋白，具有两个重复的3'非编码区3'UTR1和3'UTR2，赋予小麦、大麦对条锈菌的抗性。在节节麦群体中存在功能型YrAS2388R和非功能型YrAS2388S位点。功能型YrAS2388R表现对小麦条锈菌的广谱抗性且未被广泛应用于小麦抗病育种，对培育抗条锈病小麦品种具有重要的利用价值(Zhang et al.An ancestral NB-LRR with duplicated3’UTRs confers stripe rust resistance in wheat and barley,NatureCommunications,2019,10:4023)。

虽然目前已有可用于鉴定YrAS2388R基因(Huang et al.Molecular tagging ofa stripe rust resistance gene in Aegilops tauschii,2011,Euphytica,179:313-318；Zhang et al.An ancestralNB-LRR with duplicated 3’UTRs confers stripe rustresistance in wheat and barley,Nature Communications,2019,10:4023)及育种辅助选择的标记报道(付道林等，粗山羊草Yr4DS基因在麦族植物抗条锈病育种的应用，中国专利：ZL201811424853.2)。但是，已报道的YrAS2388R连锁SSR标记(Xwmc285,Huang etal.Molecular tagging of a stripe rust resistance gene in Aegilops tauschii,Euphytica,2011,179:313–318)和共分离标记(Yr4DS-PM、Yr4DS-GM和Yr4DS-TM，中国专利：ZL201811424853.2)，均是普通的PCR标记，依赖实验室的凝胶电泳检测，大大影响了对YrAS2388R基因的检测效率。SSR标记Xwmc285与目的基因YrAS2388R的遗传距离较远，约为1.7cM，检测精度不够，而且Xwmc285在部分小麦族植物中没有多态性。共分离标记Yr4DS-PM、Yr4DS-GM和Yr4DS-TM依赖PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳才能实现对YrAS2388R的检测，且Yr4DS-GM扩增产物还需经HaeIII酶切后才能检测，检测效率低、操作繁琐、耗时长、难以实现高通量检测。此外，琼脂糖凝胶电泳检测需要核酸染料(如溴化乙锭)染色，对人体有毒，对环境有害。

因此，开发与YrAS2388R基因共分离的KASP分子标记及建立高效检测体系，对于实现抗条锈病基因YrAS2388R的高通量、自动化、平台化分子辅助选择，促进YrAS2388R在抗病育种中的应用有重要价值和意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用，解决了现有方法检测效率低且检测精度不够的问题，不但可以摆脱凝胶电泳的限制，而且具有简便快速、特异性强、灵敏准确、环境友好、高通量检测的显著优点，可应用于筛选、鉴定或培育抗条锈病品种。

为了达到上述目的，本发明提供了一种抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记，该KASP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一目的是提供用于扩增所述的KASP分子标记的引物组，该引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的YrAS2388-KASP-E5A、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的YrAS2388-KASP-E5B和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的YrAS2388-KASP-E5C。

YrAS2388-KASP-E5A的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，如下所示：

5’-ATCACTTCTTGCAGACTGA-3’；

YrAS2388-KASP-E5B的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)，如下所示：

5’-ATCACTTCTTGCAGACTGG-3’；

YrAS2388-KASP-E5C的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)，如下所示：

5’-CATGAGACATAAGTCCTGG-3’。

优选地，所述YrAS2388-KASP-E5A和YrAS2388-KASP-E5B的5’端添加不同的荧光标签序列，所述荧光标签序列为：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的HEX荧光标签序列，或核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的FAM荧光标签序列。

HEX荧光标签序列(SEQ ID NO.7)，如下所示：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；

FAM荧光标签序列(SEQ ID NO.8)，如下所示：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCT。

本发明的另一目的是提供一种检测YrAS2388基因的KASP分子标记方法，该方法包含：

以提取的待检测小麦基因组DNA为模板，采用所述的引物组进行荧光定量PCR扩增，对PCR扩增产物进行荧光扫描，分析PCR扩增产物的基因型：

若只检测到YrAS2388-KASP-E5A-HEX对应的碱基A，则待检测小麦含有纯合的YrAS2388R基因；

若只检测到YrAS2388-KASP-E5B-FAM对应的碱基G或既未检测到YrAS2388-KASP-E5A-HEX对应的碱基A也未检测到YrAS2388-KASP-E5B-FAM对应的碱基G，则待检测小麦不含YrAS2388R基因；

若同时检测到YrAS2388-KASP-E5A-HEX对应的碱基A和YrAS2388-KASP-E5B-FAM对应的碱基G，则待检测小麦含有杂合YrAS2388R基因。

本发明可使用本领域常规KASP分型软件和仪器对PCR扩增产物进行荧光扫描，对于分析等位基因分型结果的方式依据本领域技术人员添加的荧光标签和使用的分型软件种类而定。

优选地，所述PCR扩增的体系包含：KASP Master mix、模板DNA、所述的引物组、ddH₂O。

优选地，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s；61～55℃退火延伸40s，10个循环，每个循环降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，32个循环。

本发明的另一目的是提供YrAS2388基因的KASP分型检测试剂盒，该试剂盒中的引物为所述的引物组。

本发明的另一目的是提供所述的KASP分子标记或所述的引物组的应用，KASP分子标记或引物组在如下任一项中的应用：

(1)对小麦或大麦抗条锈病基因YrAS2388R的检测或鉴定；

(2)对小麦或大麦条锈菌的防治；

(3)对小麦或大麦抗条锈病品种的选育。

本发明的抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用，解决了现有方法检测效率低且检测精度不够的问题，具有以下优点：

(1)本发明基于KASP原理以及功能型YrAS2388R和非功能型YrAS2388S基因外显子区内的单碱基差异设计KASP分子标记，本发明的KASP分子标记能区分YrAS2388R纯合抗病和杂合抗病位点，能实现对节节麦抗条锈病基因YrAS2388的高通量检测，能够对YrAS2388R位点分子标记辅助育种高效、准确选择；

(2)本发明克服了现有普通PCR标记检测中存在的操作繁琐、特异性不高或重复性不好等缺点，不但可以摆脱凝胶电泳的限制，而且具有简便快速、特异性强、灵敏准确、环境友好、高通量检测的显著优点，可应用于筛选、鉴定或培育抗条锈病品种；

(3)本发明的KASP分子标记可用于YrAS2388R的鉴定和抗条锈病小麦品种的筛选、鉴定和分子辅助选择，可以大大提高抗条锈病育种的效率和准确性。

附图说明

图1为本发明KASP分子标记YrAS2388-KASP-E5在YrAS2388R单基因分离群体(BC₃F₂)中的分型结果。

图2为本发明KASP分子标记YrAS2388-KASP-E5在节节麦群体中的分型结果。

图3为本发明KASP分子标记YrAS2388-KASP-E5在合成小麦中的分型结果。

图4为本发明KASP分子标记YrAS2388-KASP-E5在普通小麦中的分型结果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1检测抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记

来自节节麦Strangulata亚种材料AS2388的抗条锈病基因YrAS2388R位于节节麦4D染色体短臂。图位克隆表明，YrAS2388R基因全长3649bp(NCBI基因登录号为MK736663)，含有3个外显子，编码区序列全长3207bp。利用YrAS2388R第二外显子的2136bp序列(Zhanget al.An ancestral NB-LRR with duplicated 3’UTRs confers stripe rustresistance in wheat and barley,Nature Communications,2019,10:4023)与WheatOmics网站(http://202.194.139.32/)的部分测序小麦品种公布的基因组IWGSCV1.0(CS)、SY_Mattis(SY)、Zang1817、LongReach_Lancer、CDC_Landmark(Landmark)、Mace、Norin61和CDC_Stanley(Stanley)进行比对，获取位于4A、4B和4D染色体上与YrAS2388R的第二外显子同源性高的序列：CS-chr4D:1823282..1825417；SY-chr4D:151389..149254；Zang1817-chr4D:1919666..1921801；LongReach_Lancer-chr4D:1740626..1738491；Landmark-chr4D:2268554..2270689；Mace-chr4D:542837..544972；Norin61-chr4D:2062615..2064750；Stanley-chr4D:2085175..2087310；CS-chr4B:3733786..3735927；SY-chr4B:9693811..9691649；Zang1817-chr4B:3374784..3376919；LongReach_Lancer-chr4B:2673777..2671615；Landmark-chr4B:19633145..19635280；Mace-chr4B:3043258..3045393；Norin61-chr4B:1229056..1226921；Stanley-chr4B:3035178..3037313；CS-chr4A:602872958..602875090；SY-chr4A:595902946..595900811；Zang1817-chr4A:596855923..596858038；LongReach_Lancer-chr4A:592123404..592125539；Landmark-chr4A:605675235..605677370；Mace-chr4A:592662533..592660398；Norin61-chr4A:594370663..594372773；Stanley-chr4A:607181143..607179008)。

同时，从NCBI上下载节节麦感病材料中的YrAS2388S序列(基因登录号为MK736664和MK736665)。将获得的所有序列用MEGA-X 10.2.2进行比对，鉴定出YrAS2388R和YrAS2388S特异SNP位点，确定对应的一段核苷酸序列SEQ ID NO.1作为KASP分子标记。对前期已用普通PCR分子标记检测已知YrAS2388R分布的节节麦、人工合成小麦和普通小麦品种进行KASP反应鉴定，获得能特异区分YrAS2388R，稳定扩增KASP分子标记SEQ ID NO.1的引物组YrAS2388-KASP-E5。本发明检测小麦抗条锈病基因YrAS2388的KASP分子标记检测碱基(G/A)位于小麦中国春参考基因组4D染色体第1824938位(IWGSC V1.0版本)，位于YrAS2388R第二外显子(2136bp)的1657bp处。

实施例2 YrAS2388R的KASP分子标记在分离群体中的验证

前期将小麦品种蜀麦1675中源自节节麦AS2388的YrAS2388R基因导入感病诱发材料SY95-71，通过连续回交，并用普通PCR分子标记辅助选择获得了含YrAS2388R单基因的BC₃F₁植株n86，n86自交获得27个BC₃F₂单株，n86-x表示这个群体里面的单株号。

采用CTAB法提取27个BC₃F₂单株的基因组DNA，利用YrAS2388-KASP-E5A KASP荧光标签引物组，以提取的全基因组DNA为模板，在CFX96Touch^TMreal-time PCR detectionsystem(购自BioRad,USA)上进行PCR扩增。

PCR反应总体积为10μL，PCR反应体系包含：5μL KASP Master mix(HiGeno 2×Probe Mix B)、0.5μL(100ng/μL)模板DNA、0.756μL KASP荧光标签引物混合物、3.744μLddH₂O。其中，KASP荧光标签引物混合物包含：0.168μL(10mM/μL)YrAS2388-KASP-E5A-HEX、0.168μL(10mM/μL)YrAS2388-KASP-E5B-FAM、0.42μL(10mM/μL)YrAS2388-KASP-E5C。

YrAS2388-KASP-E5A-HEX的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)，如下所示：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCACTTCTTGCAGACTGA-3’；

YrAS2388-KASP-E5B-FAM的核苷酸序列，如下所示：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATCACTTCTTGCAGACTGG-3’；

YrAS2388-KASP-E5C的核苷酸序列(SEQ ID NO.6)，如下所示：

5’-CATGAGACATAAGTCCTGG-3’(SEQ ID NO.4)。

PCR扩增程序，具体如下：

(1)95℃预变性10min；

(2)95℃变性20s；

(3)61～55℃退火延伸40s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；

(4)95℃变性20s，55℃退火延伸40s，32个循环。

反应完成后利用软件Bio-RadCFX分型软件(系统)对PCR产物进行荧光数据读取和分型，并与功能型普通PCR标记P175/P176(Zhang et al.An ancestral NB-LRR withduplicated 3'UTRs confers stripe rust resistance in wheat and barley.NatureCommunications,2019,10:4023)鉴定的基因型进行对比。

参见图1(图中黑色表示空白对照，No Template Control，NTC)，在等位基因分型结果中，若为蓝色荧光，则表示只检测到YrAS2388-KASP-E5A-HEX对应的碱基A，则判断小麦材料含有纯合YrAS2388R基因；若为橙色荧光，则表示只检测到YrAS2388-KASP-E5B-FAM对应的碱基G，则判断小麦材料不含有YrAS2388R基因；若为绿色荧光，则表示同时检测到YrAS2388-KASP-E5A-HEX对应的碱基A和YrAS2388-KASP-E5B-FAM对应的碱基G，则判断小麦材料含有杂合YrAS2388R基因。

含YrAS2388R基因的BC₃F₂群体的KASP检测结果如表1所示，功能型普通PCR标记P175/P176鉴定出的携带YrAS2388R的n86群体单株，也能够被本发明的KASP检测标记所准确识别，并且本发明能够区分YrAS2388R纯合和杂合位点。蜀麦1675只检测到YrAS2388-KASP-E5A-HEX对应的碱基A(蓝色荧光)，表明含纯合YrAS2388R；感病SY95-71只检测到YrAS2388-KASP-E5B-FAM对应的碱基G(橙色荧光)，表明含有YrAS2388S；BC₃F₂单株群体中，检测到YrAS2388-KASP-E5A-HEX对应的碱基A(蓝色荧光)，YrAS2388-KASP-E5B-FAM对应的碱基G(橙色荧光)和代表YrAS2388R杂合位点的绿色荧光。结果表明，本发明所述KASP分子标记准确且特异。

表1含YrAS2388R单基因群体(BC₃F₂)的YrAS2388-KASP-E5标记分型结果

注："+"，含YrAS2388R；"-"，不含YrAS2388R；"n86-x"，BC3F2单株，x＝71,……,98。

实施例3小麦抗条锈病基因YrAS2388R KASP分子标记的应用

1、节节麦自然群体基因型鉴定

利用本发明的KASP分子标记对86份节节麦材料(表2)(Zhang et al.Anancestral NB-LRR with duplicated 3'UTRs confers stripe rust resistance inwheat and barley.Nature Communications,2019,10:4023)进行了基因型分析，KASP分子标记检测方法的具体步骤同实施例1，结果如图2(黑色表示YrAS2388-KASP-E5标记无扩增)和表2所示。

YrAS2388R功能标记P175/P176检测为阳性的节节麦材料，KASP分子标记检测表明携带YrAS2388R纯合位点。这些节节麦材料表现对条锈病的抗性。功能标记检测不含YrAS2388R的节节麦材料，KASP标记检测表明这些材料含有YrAS2388S非功能位点或无扩增，这些节节麦材料均感条锈病。结果表明，本发明的KASP分子标记可用于鉴定YrAS2388R，区分抗条锈病和感条锈病节节麦材料。

表2 86份节节麦材料的YrAS2388-KASP-E5标记分型结果

注：X，YrAS2388-KASP-E5标记无扩增；"+"，含YrAS2388R；"-"，不含YrAS2388R；R，抗条锈病；S，感条锈病。

2、人工合成小麦群体基因型鉴定

利用本发明的KASP分子标记对创制的60份新合成小麦材料(表3)进行了基因型检测。结果如图3(图中黑色表示空白对照，No Template Control，NTC)和表3所示。其中，25份材料携带纯合YrAS2388R，35份不含YrAS2388R，与功能标记P175/P176检测结果一致。结果表明，本发明的KASP分子标记能够应用于鉴定人工合成小麦群体的YrAS2388R位点。

表3人工合成小麦群体的YrAS2388-KASP-E5标记分型结果

/>

注："+"，含YrAS2388R；"-"，不含YrAS2388R。

3、普通小麦基因型鉴定

YrAS2388R来源于节节麦，目前还未被广泛应用于小麦育种。目前，仅一个四川省审定品种蜀麦1675含有YrAS2388R基因。以本发明的KASP分子标记对91份普通小麦品种(系)进行基因型检测。结果如图4(黑色表示YrAS2388-KASP-E5标记无扩增)和表4所示。仅蜀麦1675检测到碱基A，表明含有YrAS2388R；感病小麦Avocet检测到碱基G，其余小麦样品均无DNA扩增，表明不含YrAS2388R。KASP标记对YrAS2388R检测与功能标记P175/P176检测结果一致。结果表明，本发明的KASP分子标记可应用于YrAS2388R的鉴定和抗条锈病小麦品种的筛选、鉴定和分子辅助选择。

表4普通小麦的YrAS2388-KASP-E5标记分型结果

/>

注：X，YrAS2388-KASP-E5标记无扩增；"+"，含YrAS2388R；"-"，不含YrAS2388R。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atcacttctt gcagactgag ccgtatgcct ccaggactta tgtctcatg 49

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atcacttctt gcagactga 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atcacttctt gcagactgg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

catgagacat aagtcctgg 19

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tatcacttct tgcagactga 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gaaggtgacc aagttcatgc tatcacttct tgcagactgg 40

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

Claims

1.一种抗条锈病基因YrAS2388R的KASP分子标记，其特征在于，该KASP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.用于扩增如权利要求1所述的KASP分子标记的引物组，其特征在于，该引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的YrAS2388-KASP-E5A、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的YrAS2388-KASP-E5B和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的YrAS2388-KASP-E5C。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述YrAS2388-KASP-E5A和YrAS2388-KASP-E5B的5’端添加不同的荧光标签序列，所述荧光标签序列为：核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的HEX荧光标签序列，或核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的FAM荧光标签序列。

4.一种检测YrAS2388基因的KASP分子标记方法，其特征在于，该方法包含：

以提取的待检测小麦基因组DNA为模板，采用如权利要求2或3所述的引物组进行荧光定量PCR扩增，对PCR扩增产物进行荧光扫描，分析PCR扩增产物的基因型：

5.根据权利要求4所述的KASP分子标记方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系包含：KASP Mastermix、模板DNA、如权利要求2或3所述的引物组、ddH₂O。

6.根据权利要求4所述的KASP分子标记方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s；61～55℃退火延伸40s，10个循环，每个循环降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，32个循环。

7.YrAS2388基因的KASP分型检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中的引物为如权利要求2或3所述的引物组。

8.如权利要求1所述的KASP分子标记或如权利要求2或3所述的引物组的应用，其特征在于，KASP分子标记或引物组在如下任一项中的应用：

(1)对小麦抗条锈病基因YrAS2388R的检测或鉴定；

(2)对小麦条锈菌的防治；

(3)对小麦抗条锈病品种的选育。