CN112695119A - 一种水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记为OS900201_K01，其中，OS900201_K01的多态性为A或G。利用所述分子标记，可快速、精准的检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，有利于NRT1.1B基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。

Description

一种水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的SNP分子标记及其 应用
技术领域
本发明涉及水稻育种领域，具体涉及一种水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的SNP分子标记及其应用。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，氮素的高效利用是是促进水稻增产的关键因素之一。有研究通过利用籼稻IR24和粳稻日本晴构建分离群体，定位和克隆了编码硝酸盐转运蛋白的基因NRT1.1B(OsNPF6.5)，日本晴和IR24的NRT1.1B编码区存在2个突变，第1个SNP突变导致编码的氨基酸发生改变(籼稻中为甲硫氨酸，粳稻中为苏氨酸)，可以很大程度上解释籼稻和粳稻之间的氮肥利用效率差异。NRT1.1B不仅具有硝酸盐吸收和转运的功能，而且具有硝酸盐信号感知、传导和放大等功能，水稻通过NRT1.1B调控根系具有氮转化能力的微生物，从而改变根际微环境，进而影响籼粳稻田间氮肥利用效率，含有NRT1.1B的近等基因系分蘖数目以及产量均有显著增加。近等基因系和转基因株系进行田间试验结果表明，相比于未携带该等位基因的品种，携带籼稻NRT1.1B等位基因的粳稻品种能够显著提高产量和硝酸盐利用效率。
因此利用氮高效基因NRT1.1B改良粳稻的氮素的利用效率在水稻育种中具有广阔的应用前景。由于对作物氮利用效率性状的表型测定比较复杂，不仅受环境条件限制，而且依赖丰富的经验，该表型鉴定给育种工作者带来了诸多不便。利用NRT1.1B分子标记辅助育种，让育种工作者不再受制于表型选育，从而加快水稻氮高效利用的品种的选育和NRT1.1B的应用。目前文献中公布的NRT1.1B分子标记大多为CAPs标记，需要进行酶切PCR产物、凝胶电泳检测和酶切产物分析，检测过程使用如染料等实验试剂低毒污染环境，且自动化程度低检测通量小，有非特异扩增的情况发生，导致检测结果无法准备判断，从而限制了检测效率。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的SNP分子标记。
本发明还提出用于检测上述SNP分子标记的引物组。
本发明还提出上述SNP分子标记的基因型的检测方法。
本发明还提出上述SNP分子标记或引物组的应用。
根据本发明的第一方面实施方式的SNP分子标记，所述SNP分子标记为OS900201_K01，其中，OS900201_K01的多态性为A或G。
根据本发明的一些实施方式，所述SNP分子标记OS900201_K01的多态性位点位于Chr1.21759092(MSU7.0 position)。
根据本发明第二方面实施方式的用于检测上述SNP分子标记OS900201_K01的引物组，所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，特异性引物序列包括Primer SeqAllele X和Primer Seq Allele Y，所述Primer Seq Allele X的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述Primer Seq Allele Y的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
根据本发明的一些实施方式，所述Primer Seq Allele X的5’端连接FAM或HEX荧光接头序列，Primer Seq Allele Y的5’端分别连接FAM和HEX荧光接头序列。
根据本发明的一些实施方式，所述引物组在水稻育种中的应用。
根据本发明的第三方面实施方式的上述SNP分子标记的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1、从水稻材料中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用SNP分子标记OS900201_K01的引物，对OS900201_K01分子标记进行检测；
S3、若OS900201_K01的SNP位点碱基为A，判定测试的水稻样品含纯合的氮高效利用的NRT1.1B基因；若检测位点碱基为G，判定测试的水稻样品含有纯合的普通nrt1.1b基因；若检测位点同时检测到A、G，判断待测水稻含有杂合的氮高效利用的NRT1.1B基因。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S1中，水稻材料为叶片和/或种子。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S1中，水稻材料为叶片。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S1中，提取基因组DNA采用简化CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)和/或TPS法。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中，用KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术对SNP位点进行检测。
根据本发明的第四方面实施方式的上述SNP分子标记的应用，所述应用为SNP分子标记在水稻育种中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为利用OS900201_K01分子标记进行检测，选择携带NRT1.1B基因的水稻品系进行后续育种。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供一种检测NRT1.1B基因SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒用于水稻育种。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括上述引物组。
根据本发明实施方式的水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的SNP分子标记，至少具有如下有益效果：通过本发明的水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的SNP分子标记，应用KASP技术反应对水稻材料对NRT1.1B进行基因检测，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B。本发明利用KASP技术对所开发的SNP标记进行基因分型，KASP技术流程中PCR体系构建和荧光信号检测等基本自动化，可实现96，384，1536孔板高通量检测，适用于大规模、高通量的NRT1.1B基因鉴定和筛选。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少PCR产物气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择，减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于NRT1.1B基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例的分子标记开发流程图；
图2为本发明实施例的分子标记OS900201_K01的分型图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明实施例为：一种水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的SNP分子标记及其应用，该分子标记的设计过程，如图1所示，通过已克隆目标基因NRT1.1B确定物理位置，提取SNP位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：
1引物设计
根据文献信息确定NRT1.1B基因关键SNP位点的位置在水稻1号染色体的21759092位碱基(参考日本晴基因组MSU7.0)，提取侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行引物设计。针对这些候选SNP标记，对NRT1.1B供体材料和普通水稻稻品种进行KASP反应验证，挑选出与NRT1.1B供体材料共分离及扩增效果好的的SNP标记OS900201_K01，本发明检测的标记可以用于NRT1.1B的筛选和检测。
OS900201_K01的引物信息如表1所示，每组标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光接头序列。如果样品PCR产物只检测到引物PrimerX对应荧光信号，则检测位点为碱基A，判定测试的水稻样品含纯合的氮高效利用的NRT1.1B基因型；若只检测到引物PrimerY对应荧光信号，则检测位点为碱基G，判定测试的水稻样品含有纯合的普通nrt1.1b基因；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为A：G，判断待测水稻为杂合的氮高效利用的NRT1.1B基因型。引物委托Invitrogen公司合成。
表1 OS900201_K01的标记信息
Figure BDA0002868840790000041
2样品检测
DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。
KASP反应测试：KASP反应测试在Douglas Arraytape基因分型平台上进行。PCR扩增反应使用的扩增体系如表2所示，具体如下：5-50ng模板DNA，烘干后加入100UM的上下游特异引物各0.0013μL，100UM的通用引物0.0033μL，2x KASP Master Mix 0.3945μl，余量为超纯水，总体积为0.8μl。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。
表2 KASP检测的反应体系
终浓度 体积(ul)
100UM Primer C 0.42μM 0.0033
100UM Primer X 0.17μM 0.0013
100UM Primer Y 0.17μM 0.0013
2x KASP Master Mix 1x 0.3945
超纯水 0.3996
总体积 0.8
3标记分型数据
根据上述检测方法，用标记OS900201_K01含有硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的水稻供体品种和普通的水稻品种进行KASP反应验证。供体品种在OS900201_K01测试位点检测结果为碱基A，对照品种在测试位点检测出碱基G，证明了本发明对NRT1.1B基因检测的准确性。标记分型结果如图2所示，其中，红色为纯合NRT1.1B基因型，蓝色为纯合nrt1.1b基因型，紫色为杂合NRT1.1B基因型，从图中可以看出，SNP标记检测的位点为供体特异性位点，OS900201_K01可用于水稻NRT1.1B基因的高效检测。
综上所述，本发明提供的水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的SNP分子标记，可在快速、精准的检测水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B，标记不受环境条件影响，检测结果准确、重复性和稳定性好。
本发明中使用的Douglas Arraytape基因分型平台配套的试剂和耗材均购于英国LGC公司。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 华智生物技术有限公司
<120> 一种水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的SNP分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
cagcctccac ttgctcgcca 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
agcctccact tgctcgccg 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
tggtttgtaa tatgggtgca ggttc 25

Claims (10)

1.一种水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记为OS900201_K01，其中，OS900201_K01的多态性为A或G。
2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记OS900201_K01的多态性位点位于Chr1.21759092。
3.一种用于检测如权利要求1所述的SNP分子标记OS900201_K01的引物组，其特征在于：所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物包括Primer SeqAllele X和Primer Seq Allele Y，所述Primer Seq Allele X的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述Primer Seq Allele Y的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.如权利要求3所述引物组在水稻育种中的应用。
5.一种如权利要求1所述的SNP分子标记的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
S1、从水稻材料中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用如权利要求3所述的引物组，对OS900201_K01分子标记进行检测；
S3、若OS900201_K01的SNP位点碱基为A，判定测试的水稻样品含纯合的氮高效利用的NRT1.1B基因；若检测位点碱基为G，判定测试的水稻样品含有纯合的普通nrt1.1b基因；若检测位点同时检测到A、G，判断待测水稻含有杂合的氮高效利用的NRT1.1B基因。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：步骤S2中，用KASP技术对SNP位点进行检测。
7.如权利要求1或2任一所述SNP分子标记在水稻育种中的应用。
8.如权利要求7所述的SNP分子标记的应用，其特征在于：所述应用为利用OS900201_K01分子标记进行检测，选择携带NRT1.1B基因的水稻品系进行后续育种。
9.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括核苷酸序列如权利要求3所述的引物组。
10.一种基因芯片，其特征在于：所述基因芯片包括核苷酸序列如权利要求3所述的引物组。
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