CN111363843A - 鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b基因型的pcr/ldr分子标记和方法 - Google Patents

鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b基因型的pcr/ldr分子标记和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B基因型的PCR/LDR分子标记和方法，属于水稻育种技术领域。本发明所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，PCR引物对正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。LDR探针包括一条荧光标记探针Probe‑FAM，序列如SEQ ID NO.3所示，一条籼型等位基因特异探针Probe‑ind，序列如SEQ ID NO.4所示，一条粳型等位基因特异探针Probe‑jap，序列如SEQ ID NO.5所示。本发明方法不仅能准确快速的鉴定水稻品种或育种群体中各个株系中硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的基因型，而且能实现较多样品的高通量检测。

Description

鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B基因型的PCR/LDR分子 标记和方法
技术领域
本发明涉及水稻育种技术领域，尤其涉及一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B基因型的PCR/LDR的分子标记和方法。
背景技术
亚洲栽培稻包括籼稻和粳稻两个亚种，它们在形态、发育与生理、适应的生态环境等方面都出现了较大的分化。研究发现籼稻对氮肥的利用效率比粳稻高，产量也相对较高。
2015年，我国科学家发现籼稻和粳稻对氮肥的利用效率的差异是由于硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的分化引起的。序列分析显示，籼稻和粳稻NRT1.1B基因在编码区第980位的一个碱基变异，籼稻中为T,而粳稻中为C。研究表明，将籼型NRT1.1B基因导入粳稻，可使粳稻的氮肥利用率和产量获得较大幅度的提高，一般较对照增幅10％，最高可达到30％。因此，籼型NRT1.1B等位基因对于改良粳稻的氮肥利用效率具有重大的实际利用价值。可通过籼粳人工杂交结合标记辅助育种等方式将籼型NRT1.1B基因导入粳稻品种，以提高粳稻氮肥利用效率(Hu B,et al.,Variation in NRT1.1B contributes to nitrate-usedivergence between rice subspecies,Nat Genet.,2015,7(7):834-838)。
根据NRT1.1B基因980位碱基的功能性SNP位点，田门祥等利用四引物扩增受阻突变体系PCR(ARMS-PCR)方法设计了一个分子标记(中国专利公开号：CN105112504A)；方琳等开发了与NRT1.1B等位基因共分离的PCR功能标记(方琳等，水稻氮高效基因NRT1.1B功能标记开发和资源筛选，分子植物育种，http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.s.20200304.1023.002.html)。此外李军等根据籼稻和粳稻NRT1.1B基因的内含子中序列差异，设计了一个InDel分子标记，同样实现了对NRT1.1B基因的基因型鉴定(李军等，水稻氮高效利用基因NRT1.1B InDel分子标记的开发与应用，分子植物育种，2016,14(12):3405-3413)。然而这些基于PCR的分子标记方法，需要对PCR产物进行核酸电泳，在操作上比较繁琐，并不利于对育种过程中较多样品进行高通量的基因型鉴定。
聚合酶链式反应-连接酶检测反应(polymerase chain reaction/ligasedetection reaction,PCR/LDR)是今年来发展起来的一种核酸检测技术，该方法具有较高灵敏度、准确度，并且该方法能够实现多个遗传位点的同时检测，实现较高通量的基因型检测，在医学广泛的用于疾病的诊断(Gibriel A A et al.，Advances in ligase chainreaction and ligation-based amplifications for genotyping assays:Detectionand applications.Mutat Res.,2017,773:66-90)。
发明内容
本发明的技术问题：本发明针对传统基于PCR、电泳技术的分子标记技术的检测过程相对繁琐，不利于进行较多样品时的高通量分析等缺点，根据籼型和粳型NRT1.1B等位基因在编码区980位存在的一个SNP位点设计了一种基于PCR/LDR技术的分子标记，用于快速、准确的鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的基因型，为筛选鉴定携带有籼型NRT1.1B等位基因水稻种质资源和氮高效水稻品种的标记辅助选择育种提供参考。
本发明第一个目的是提供一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B基因型的PCR/LDR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括一对PCR引物和LDR探针，其中，所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-AATATGGGTGCAGGTTCCTGG-3’；
反向引物序列：5’-CCACCTGCTTCACCTCCTC-3’；
所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条籼型等位基因特异探针Probe-ind，一条粳型等位基因特异探针Probe-jap；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-TCGCCGGCGACTCCGCCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’
所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTGCACAGCCTCCACTTGCTCGCCA-3’
所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACAGCCTCCACTTGCTCGCCG-3’。
进一步地，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和18个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。
进一步地，所述籼型等位基因特异探针Probe-ind由16个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；所述粳型等位基因特异探针Probe-ind由18个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。
本发明第二个目的在于提供上述分子标记在水稻育种过程对NRT1.1B基因型的鉴定中的应用。
本发明最后提供了一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)水稻植株基因组DNA的提取；
(2)用PCR引物对水稻植株基因组DNA进行PCR扩增；PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-AATATGGGTGCAGGTTCCTGG-3’；
反向引物序列：5’-CCACCTGCTTCACCTCCTC-3’；
(3)以PCR扩增产物为模板，以权利要求3-5所述探针进行LDR反应；所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条籼型等位基因特异探针Probe-ind，一条粳型等位基因特异探针Probe-jap；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-TCGCCGGCGACTCCGCCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’
所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTGCACAGCCTCCACTTGCTCGCCA-3’
所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACAGCCTCCACTTGCTCGCCG-3’；
(4)LDR反应产物用ABI3730测序仪对LDR反应产物测序，根据LDR产物的大小确定检测水稻样品的基因型。
本发明提供的鉴定NRT1.1B基因型的方法具体包括以下步骤：
(1)水稻植株叶片基因组DNA的提取：取50mg左右叶片，用剪刀剪碎，放入2ml离心管，加入600μl1.5×CTAB溶液(1.5％CTAB，75mM Tris-HCl，15mM EDTA，1.05M NaCl，PH8.0)和一粒直径5mm的钢珠，在快速研磨仪上70Hz的频率震荡研磨90s；研磨后的样品在56℃水浴锅中温浴20min，加入450μl氯仿，剧烈震荡后，12000转/min离心10min；取450μl上清液到另一个1.5ml的离心管中，加入900μl的无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱放置10min，12000转/min离心10min，弃上清，晾干后加入200μl的双蒸水溶解DNA，放-20℃冰箱备用。
(2)PCR扩增体系：25μl的PCR反应体系包括50ng水稻基因组DNA，正向引物和反向引物各0.5pmol，10mM Tris-HCl(pH＝8.8),1.5mM MgCl2,50mM KCl,0.8％(v/v)NP-40,dATP、dGTP、dCTP和dTTP 200μM，以及5U of Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性2分钟；然后40个循环的94℃变性30秒，56℃退火90秒，72℃延伸60秒；最后72℃延伸10分钟。
(3)LDR反应体系：10μl的LDR反应体系包括50mM Tris-HCl(pH 7.5)；10mM MgCl2；10mM DTT；1mM NAD+；3条LDR探针各LDR 0.2pmol；2U的Taq DNA连接酶；4μl的PCR产物。LDR反应程序：95℃变性2分钟；40个循环94℃变性15秒50℃退火链接25秒。反应结束后的LDR产物用ABI 3730 DNA测序仪分析，根据FAM荧光峰值的位置确定检测样品的NRT1.1B基因型。若FAM荧光峰值在77个碱基的位置，则对应样品的NRT1.1B基因型为籼型。若FAM荧光峰值在79个碱基的位置；则对应样品的NRT1.1B基因型为粳型；若存在77和79两个峰，则对应样品的NRT1.1B基因型为杂合型。
本发明与现有技术相比，其有效效果为：
本发明提供的一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B基因型的分子标记方法采用PCR关联LDR方法(聚合链式酶反应关联连接酶检测反应)进行检测，本发明提供的方法能够方便的粳型NRT1.1B基因的分型，得到的结果具有可靠、稳定、操作简便、快速的特点，适用于较多样品的高通量检测，在种植资源的NRT1.1B基因型鉴定，和氮高效水稻新品种的分子辅助育种中有较大的应用价值。
附图说明
图1为申繁14和9311NRT1.1B基因型的测序结果。
图2为实施例1的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
1、水稻材料
申繁14是三系杂交粳稻花优14的恢复系，9311是超级杂交稻亲本籼稻品种，我国在2002年完成了9311的全基因组草图，通过测序发现申繁14和9311NRT1.1B基因在编码区第980位碱基分别为C和T,表明申繁14和9311分别携带粳型和籼型的NRT1.1B(图1)，所使用的F1来源于申繁14与9311的杂交。
2、水稻基因组DNA提取：
申繁14、9311及其杂交F1代水稻植株各取50mg左右叶片，用剪刀剪碎，放入2ml离心管，加入600μl1.5×CTAB溶液(1.5％CTAB，75mM Tris-HCl，15mM EDTA，1.05M NaCl，PH8.0)和一粒直径5mm的钢珠，在快速研磨仪上70Hz的频率震荡研磨90s；研磨后的样品在56℃水浴锅中温浴20min，加入450μl氯仿，剧烈震荡后，12000转/min离心10min；取450μl上清液到另一个1.5ml的离心管中，加入900μl的无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱放置10min，12000转/min离心10min，弃上清，晾干后加入200μl的双蒸水溶解DNA，放-20℃冰箱备用。
3、PCR扩增：
PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-AATATGGGTGCAGGTTCCTGG-3’；
反向引物序列：5’-CCACCTGCTTCACCTCCTC-3’。
申繁14、9311及其杂交F1代水稻基因组DNA，进行PCR扩增，所用PCR正向引物如SEQID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。PCR扩增体系：25μl的PCR反应体系包括50ng水稻基因组DNA，正向引物和反向引物各0.5pmol，10mM Tris-HCl(pH＝8.8),1.5mM MgCl2,50mM KCl,0.8％(v/v)NP-40,dATP、dGTP、dCTP和dTTP 200μM，以及5U of Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性2分钟；然后40个循环的94℃变性30秒，56℃退火90秒，72℃延伸60秒；最后72℃延伸10分钟。
4、对PCR扩增产物进行LDR反应：
LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条籼型等位基因特异探针Probe-ind，一条粳型等位基因特异探针Probe-jap；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-TCGCCGGCGACTCCGCCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’
所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTGCACAGCCTCCACTTGCTCGCCA-3’
所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACAGCCTCCACTTGCTCGCCG-3’。
LDR反应体系：10μl的LDR反应体系包括50mM Tris-HCl(pH 7.5)；10mM MgCl2；10mM DTT；1mM NAD+；3条LDR探针各LDR 0.2pmol；2U的Taq DNA连接酶；4μl的PCR产物。LDR反应程序：95℃变性2分钟；40个循环94℃变性15秒50℃退火链接25秒。
LDR反应产物的检测：
反应结束后的LDR产物用ABI 3730DNA测序仪分析，根据FAM荧光峰值的位置确定检测样品的NRT1.1B基因型。若FAM荧光峰值在77个碱基的位置，则对应样品的NRT1.1B基因型为籼型。若FAM荧光峰值在79个碱基的位置；则对应样品的NRT1.1B基因型为粳型；若存在77和79两个峰，则对应样品的NRT1.1B基因型为杂合型。申繁14、9311及其杂交F1三个样品的检测结果申繁14携带粳型NRT1.1B基因，9311携带籼型NRT1.1B基因，F1则为杂合型(图2)。
实施例2
实施例2中所用水稻样品为申繁14和9311杂交F2代群体的48个株系，其他检测的步骤和方法与实施例1相同。检测结果见表1。
Figure BDA0002449299450000071
Figure BDA0002449299450000081
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，同样落于本发明所要求的保护范围之内。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B基因型的PCR/LDR分子标记和方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatatgggtg caggttcctg g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccacctgctt cacctcctc 19
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgccggcga ctccgccgcc tttttttttt tttttttt 38
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttttttttt ttttttgcac agcctccact tgctcgcca 39
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttttttttt ttttttttgc acagcctcca cttgctcgcc g 41

Claims (7)

1.一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B基因型的PCR/LDR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括一对PCR引物和LDR探针，其中，所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-AATATGGGTGCAGGTTCCTGG-3’；
反向引物序列：5’-CCACCTGCTTCACCTCCTC-3’；
所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条籼型等位基因特异探针Probe-ind，一条粳型等位基因特异探针Probe-jap；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-TCGCCGGCGACTCCGCCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’
所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTGCACAGCCTCCACTTGCTCGCCA-3’
所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACAGCCTCCACTTGCTCGCCG-3’。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和18个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。
3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述籼型等位基因特异探针Probe-ind由16个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；所述粳型等位基因特异探针Probe-ind由18个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。
4.权利要求1-3中任一项所述分子标记在水稻育种过程对NRT1.1B基因型的鉴定中的应用。
5.一种鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)水稻植株基因组DNA的提取；
(2)用PCR引物对水稻植株基因组DNA进行PCR扩增；PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-AATATGGGTGCAGGTTCCTGG-3’；
反向引物序列：5’-CCACCTGCTTCACCTCCTC-3’；
(3)以PCR扩增产物为模板，以权利要求3-5所述探针进行LDR反应；所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条籼型等位基因特异探针Probe-ind，一条粳型等位基因特异探针Probe-jap；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-TCGCCGGCGACTCCGCCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’
所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTGCACAGCCTCCACTTGCTCGCCA-3’
所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACAGCCTCCACTTGCTCGCCG-3’；
(4)LDR反应产物用ABI3730测序仪对LDR反应产物测序，根据LDR产物的大小确定检测水稻样品的基因型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和18个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述籼型等位基因特异探针Probe-ind由16个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；所述粳型等位基因特异探针Probe-ind由18个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。
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