CN102453749A - 检测食品中转基因成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了检测食品中转基因成分的方法及其试剂盒。本发明的试剂盒所述试剂盒包含两组引物组，其中第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cpt1基因、Rch10基因、Xa21基因、lrp基因和osvte基因的引物对。本发明还提供了用于检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒和方法。本发明的方法和试剂盒能高效、快速、灵敏、特异性地检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。

Description

检测食品中转基因成分的方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域。具体地说，本申请涉及检测食品中转基因成分的方法和试剂盒。

背景技术

随着转基因技术的发展，通过导入外源基因可以实现对植物和动物原有基因的改造，从而得到营养成分改善、抗逆性能提高、性状优良的植物和动物。目前，越来越多的转基因植物和动物被批准进入商品化生产。与此同时，这类通过转基因技术得到的动植物及其加工产品(如食品)的使用安全性问题也日益引起了人们的关注。因此，转基因食品成分的检测成为转基因食品安全评估的基础。

目前国际上对食品中转基因成分的检测主要采用PCR法，以及在此基础上发展出的实时定量PCR法及多重PCR法。所检测的靶基因大多是已知商品化的转基因食品成分中的几种，主要是抗虫、抗除草剂成份。但是，对于正在研发阶段的抗逆、品质改良、生长发育等转基因植物成分的检测则基本未涉及。

发明内容

本发明建立了高效、快速、灵敏、特异的多重PCR(Multiplex PCR)-LDR(连接酶检测反应)-UA(通用芯片)检测方法，将有助于转基因食品成分的检测，有利于在此基础上进一步评估新型转基因食品成分的安全性。本发明可被食品安全检测机构应用于食品中转基因成分的检测。

本发明第一方面提供了一种用于检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含两组引物组，其中第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cpt1基因、Rch10基因、Xa21基因、lrp基因和osvte基因的引物对。

本发明另一方面提供了一种检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a)提取所述食品的DNA；

b)用第一引物组对所述提取的DNA进行PCR扩增，所述第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；用第二引物组对提取的DNA进行PCR扩增，所述第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cpt1基因、Rch10基因、Xa21基因、lrp基因和osvte基因的引物对；

c)检测所述PCR扩增产物，从而确定所述食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。

本发明还有一个方面提供了一种用于检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包含以下两组探针：

1)鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与固定在基因芯片上的Zip探针序列互补的序列；和

2)通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。

本发明还有一个方面提供了一种检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供核酸混合物；

b)在核酸混合物中加入通用探针和鉴别探针，用耐高温DNA连接酶进行连接酶反应；其中，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与Zip探针序列互补的序列；所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记；

c)使步骤b)所得反应物在固定有Zip探针的芯片上进行杂交反应，检测杂交结果，从而确定核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。

本发明以转基因水稻为例，提供了一种检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，该检测方法具有高效、快速、灵敏、特异的优点。本发明的方法有助于检测市场上是否有未经批准的转基因水稻流入，以满足消费者对于转基因产品的知情权和选择权，同时为进一步评估新型转基因食品成分的安全性奠定了基础。

本发明的其它方面、优点或益处可通过下文详细描述结合附图得知。

附图说明

图1显示了用PCR检测Bt/CpT1双价抗虫转基因水稻及其亲本(未转基因水稻)中的启动子和终止子的结果，其中1：空白对照；2：未转基因水稻，3：Bt/CpT1转基因水稻。

图2显示了转AGLU/RCH10基因水稻及其亲本中肌动蛋白、18s rRNA和nos终止子的PCR扩增结果，其中1：未转基因水稻；2-7：转AGLU/RCH10基因水稻的几个株系。

图3显示了PCR检测转基因水稻中的AGLU/RCH10基因的结果，其中1：未转基因水稻；2-4：转AGLU/RCH10基因水稻的几个株系。

图4显示用多重PCR检测转基因水稻中外源基因的启动子、终止子及内源标志基因的结果。

图5显示用多重PCR检测转基因水稻中的外源基因的结果。

图6显示转基因水稻初筛芯片杂交结果。A，转基因水稻；B，非转基因水稻。每个株系均包括转基因水稻及其亲本：转Xa21基因抗白叶枯病水稻，Bt/CpT I双价抗虫水稻，RCH10/AGLU双价抗纹枯病水稻，转Bar基因抗除草剂水稻，转四菱豆高赖氨酸蛋白质(lrp)水稻，转OSVTE1基因耐旱水稻。

图7显示转基因水稻外源基因芯片杂交结果。A，转基因水稻；B，非转基因水稻。每个株系均包括转基因水稻及其亲本：转Xa21基因抗白叶枯病水稻，Bt/CpT I双价抗虫水稻，RCH10/AGLU双价抗纹枯病水稻，转Bar基因抗除草剂水稻，转四菱豆高赖氨酸蛋白质(lrp)水稻，转OSVTE1基因耐旱水稻。

具体实施方式

本发明将多重PCR(Multiplex PCR)与连接酶检测反应(Ligation detectionreaction，LDR)-通用芯片(universal array，UA)技术相结合，从而建立了一种高效、快速、灵敏、特异的植物源性转基因成分检测方法。

首先，本发明提供了一种用于检测食品(例如水稻加工产品)中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含两组引物组，其中第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cpt1基因、Rch10基因、Xa21基因、lrp基因和osvte基因的引物对。

在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含以下引物对：

CaMV 35s  启动子  正向    agactggcgaaccagttcatacaga(SEQ ID NO：5)

                  反向    gcaatggaatccgaggaggt(SEQ ID NO：6)

nos  终止子       正向    tgaatcctgttgccggtctt(SEQ ID NO：7)

                  反向    aaatgtataattgcgggactctaatc(SEQ ID NO：8)

FMV 35s  启动子   正向    cagcattccagattgggttca(SEQ ID NO：9)

                  反向    cttttggctaatggtttggagac(SEQ ID NO：10)

Bar               正向    tgcaccatcgtcaaccactaca(SEQ ID NO：11)

                  反向    ctgccagaaacccacgtcat(SEQ ID NO：12)

Bt                正向    aacctgtgggagaatccttgc(SEQ ID NO：13)

                  反向    cttgccatccgctgtttaca(SEQ ID NO：14)

Cpt1              正向    ctaaatcaatacctcctcaatgcca(SEQ ID NO：15)

                  反向    cttactcatcatcttcatccctgga(SEQ ID NO：16)

Rch10             正向    cagcacaacccaaagccata(SEQ ID NO：17)

                  反向    gcgaagcccgagtaggagct(SEQ ID NO：18)

Xa21              正向    cagcacaacccaaagccatat(SEQ ID NO：19)

                  反向    gcgaagcccgagtaggagc(SEQ ID NO：20)

lrp               正向    gagaagaccgactgctacacct(SEQ ID NO：21)

                  反向    gcagagaacaacaggacgaaga(SEQ ID NO：22)

osvte             正向    cagtggctcctgctatcctttaca(SEQ ID NO：23)

                  反向    caaagcagcaccaccaactatg(SEQ ID NO：24)。

在一个优选的实施方案中，所述第一引物组和所述第二引物组混合在一起。在另一实施方案中，所述第一引物组和所述第二引物组分开放置。

在另一优选的实施方案中，所述试剂盒还包含用于同时扩增多目的基因的PCR反应体系。作为本发明的一个具体实施例，所述PCR反应体系为：DNA模板(即提取的DNA)各100ng，10×PCR缓冲液10μl，dNTP各10mmol/L 2μl，上、下游引物混合物各5μmol/L 1μl，Taq酶2μl，双蒸水补足至100μl。所述PCR反应条件为：95℃模板变性5min，95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸10min。当然，上述条件仅仅是适用于本发明方法的一个具体实验条件，本领域技术人员完全能够在不影响PCR扩增的情况下对上述步骤或反应条件进行变化或改动，所有的这些改动均在本发明的等同范围内。

在另一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含连接酶检测基因芯片系统。因此，本发明的另一方面还提供了一种连接酶检测基因芯片系统，所述系统包含：

连接酶反应体系；

基因芯片，所述芯片上连接了Zip探针序列；

鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与所述Zip探针序列互补的序列；

通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。

所述连接酶反应体系包含耐高温的DNA连接酶。本领域技术人员可以根据现有技术选择适用于本发明的具体种类的DNA连接酶。

适用于本发明方法的一个具体的反应体系是：10μL经消化的多重PCR产物，20mM Tris-HCl(pH 7.6)，10mM DTT，1mM NAD，0.1％Triton X-100，每种鉴别探针各1pmol，每种通用探针各1pmol，40U/μL Taq DNA连接酶0.5μL。LDR反应条件为94℃30s，63℃4min，共40个循环。

连接酶是一种封闭DNA/RNA链上缺口(Nick)的酶，借助NAD+或ATP水解提供的能量催化2条核酸单链的3′端羟基和5′端磷酸基团反应形成磷酸二酯键。在连接酶催化两段探针连接过程中，连接酶识别位点3′端5个碱基之内任何一个位置的碱基发生错配都会导致连接探针不能正常连接。因此，在本发明的方法中，鉴别探针和通用探针被设计成了分别与目标基因中的两个毗邻的片段互补。当PCR扩增产物中存在待测基因时，连接酶就能将两端探针连接起来，随后通过鉴别探针中的cZip探针序列(与Zip探针序列互补)与基因芯片上的Zip探针序列结合而固定在芯片上。利用各种检测手段检测通用探针上的可检测标记从而实现检测目的。

在一个优选的实施方案中，所述鉴别探针包含如SEQ ID NO：25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO：37-48所示的探针序列。

在另一优选的实施方案中，所述可检测标记例如可以是荧光团、发色团、放射活性原子(例如³²P和¹²⁵I)、密电子试剂、酶、以及具有特异性结合配偶的配体。酶通常靠其活性来检测。例如，辣根过氧化物酶通常是检测其将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)转变成蓝色的能力，可用分光光度计定量测定。其它替换和可能性对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，所以也应属于本发明范围内的等价方案。

因此，本发明还有一个方面提供了一种用于检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包含以下两组探针：

1)鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与固定在基因芯片上的Zip探针序列互补的序列；和

2)通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。

所述待检测的核酸混合物中可能含有待检测的转基因成分。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒可用于检测水稻外源基因的启动子(如CaMV 35S启动子、FMV35S启动子)、终止子(如nos终止子)和及内源标志基因(如肌动蛋白基因)以及外源基因(如Bar基因、Bt基因、Cpt1基因、Rch10基因、Xa21基因、lrp基因和osvte基因)。在这一情况下，所述核酸混合物可以是用本发明所述的多重PCR方法获得的PCR扩增产物。此时，所述鉴别探针包含如SEQ ID NO：25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO：37-48所示的探针序列。

本发明另一方面提供了一种检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a)提取所述食品的DNA；

b)用第一引物组对所述提取的DNA进行PCR扩增，所述第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；用第二引物组对提取的DNA进行PCR扩增，所述第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cpt1基因、Rch10基因、Xa21基因、lrp基因和osvte基因的引物对；

c)检测所述PCR扩增产物，从而确定所述食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。

所述步骤a)可以采用本领域技术人员熟知的各类DNA提取技术或市售的DNA提取试剂盒来进行。在一个优选的实施方案中，可采用购自DNA提取试剂盒(TakaraCat.No.D9093)。

在一个优选的实施方案中，在所述步骤b)中采用以下引物对对提取的DNA进行PCR扩增：

CaMV 35s  启动子    正向    agactggcgaaccagttcatacaga(SEQ ID NO：5)

                    反向    gcaatggaatccgaggaggt(SEQ ID NO：6)

nos 终止子          正向    tgaatcctgttgccggtctt(SEQ ID NO：7)

                    反向    aaatgtataattgcgggactctaatc(SEQ ID NO：8)

FMV 35s 启动子      正向    cagcattccagattgggttca(SEQ ID NO：9)

                    反向    cttttggctaatggtttggagac(SEQ ID NO：10)

Bar                 正向    tgcaccatcgtcaaccactaca(SEQ ID NO：11)

                    反向    ctgccagaaacccacgtcat(SEQ ID NO：12)

Bt                  正向    aacctgtgggagaatccttgc(SEQ ID NO：13)

                    反向    cttgccatccgctgtttaca(SEQ ID NO：14)

Cpt1                正向    ctaaatcaatacctcctcaatgcca(SEQ ID NO：15)

                    反向    cttactcatcatcttcatccctgga(SEQ ID NO：16)

Rch10               正向    cagcacaacccaaagccata(SEQ ID NO：17)

                    反向    gcgaagcccgagtaggagct(SEQ ID NO：18)

Xa21   正向    cagcacaacccaaagccatat(SEQ ID NO：19)

       反向    gcgaagcccgagtaggagc(SEQ ID NO：20)

Lrp    正向    gagaagaccgactgctacacct(SEQ ID NO：21)

       反向    gcagagaacaacaggacgaaga(SEQ ID NO：22)

Osvte  正向    cagtggctcctgctatcctttaca(SEQ ID NO：23)

       反向    caaagcagcaccaccaactatg(SEQ ID NO：24)。

所述步骤b)中的PCR反应体系为：提取的DNA各100ng，10×PCR缓冲液10μl，dNTP各10mmol/L 2μl，上、下游引物混合物各5μmol/L 1μl，Taq酶2μl，双蒸水补足至100μl；所述PCR反应条件为：95℃模板变性5min，95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸10min。

所述步骤b)中的两个扩增反应可以分开进行，也可以同时进行。

在本发明的另一优选实施方案中，在所述步骤c)中，采用连接酶检测基因芯片系统检测所述PCR扩增产物，所述系统包含：

连接酶反应体系；

基因芯片，所述芯片上连接了Zip探针序列；

鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与所述Zip探针序列互补的序列；

通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。

具体而言，所述连接酶反应和基因芯片检测步骤如下：

a)提供待检测样品，例如PCR扩增产物；

b)用蛋白酶(如LPK)消化PCR扩增产物；

c)在扩增产物中加入设计好的各种通用探针和鉴别探针，用耐高温DNA连接酶进行连接酶反应；

d)使步骤c)所得反应物在固定有Zip探针的芯片上进行杂交反应，从而使芯片上的Zip探针序列与鉴别探针中的cZip探针序列(即与所述Zip探针序列互补的序列)杂交，然后检测杂交结果。

作为一个本发明的具体实例，所述步骤c)的连接酶反应体系如下：10μL经消化的多重PCR产物，20mM Tris-HCl(pH 7.6)，10mM DTT，1mM NAD，0.1％TritonX-100，每种鉴别探针各1pmol，每种通用探针各1pmol，40U/μL Taq DNA连接酶0.5μL。LDR反应条件为94℃30s，63℃4min，共40个循环。

在本发明的另一优选方案中，所述鉴别探针包含如SEQ ID NO：25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO：37-48所示的探针序列。

在本发明的另一优选方案中，将对应于外源基因调控元件(例如CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子)的Zip探针固定于第一基因芯片上，将对应于外源基因(例如Bar基因、Bt基因、Cpt1基因、Rch10基因、Xa21基因、lrp基因和osvte基因)的Zip探针固定于第二基因芯片上，从而能够实现用前者来初步筛选食品中是否存在转基因成分，用后者来确定食品中存在哪种转基因成分。

本发明上述的连接酶检测基因芯片系统检测也可以用于检测通过其它方法从水稻或水稻加工产品获得的核酸混合物。因此，本发明另一方面提供了一种检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供待检测样品，例如核酸混合物(例如从水稻或水稻加工产品获得的核酸混合物)；

b)在待检测样品中加入通用探针和鉴别探针，用耐高温DNA连接酶进行连接酶反应；其中，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与固定在基因芯片上的Zip探针序列互补的序列；所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记；

c)使步骤b)所得反应物在固定有Zip探针的芯片上进行杂交反应，从而使芯片上的Zip探针序列与鉴别探针中的cZip探针序列(即与所述Zip探针序列互补的序列)杂交，然后检测杂交结果，从而确定核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。

在一个优选的实施方案中，所述鉴别探针包含如SEQ ID NO：25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO：37-48所示的探针序列。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》1-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

1.转基因作物样本的收集

本发明者收集了8种转基因水稻样本(表1)，这些样本的性状包括：抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆、品质改良。

表1收集的转基因水稻样本

2.转基因植物DNA制备

按照生产商说明书用DNA提取试剂盒(TaKaRa Cat.No.D9093)提取转基因植物样本DNA。

3.多重PCR反应条件的优化及反应特异性分析

3.1PCR引物设计

根据转基因作物中外源基因(调控元件、标记基因或表达基因)及物种特异性内源基因，应用MIT Whitehead Institute的Primer 3.0软件设计并合成多种PCR引物(表2，3)，使所有引物的Tm值尽量相同或相近，引物与引物之间的同源性尽量低，PCR扩增产物相差50bp以上。

表2用于水稻转基因成分初步筛选的PCR引物

表3用于水稻特异性转基因成分检测的PCR引物

3.2PCR检测单个目的基因反应条件的确定

先确定检测转基因作物中单个外源基因的PCR反应条件。反应体系如下：

DNA模板50ng，10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP(各10mmol/L)0.5μl，上、下游引物混合物(各5μmol/L)0.25μl，10mM Tris-HCl(pH 8.3)，Taq酶1μl，双蒸水补足至25μl。在PTC-100DNA热循环仪上扩增，反应条件为：95℃模板变性5min，95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸10min。反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。结果如图1-3所示，其显示了转基因水稻内源参照基因和外源基因的PCR扩增结果。

3.3多重PCR反应体系的建立及反应条件优化

3.3.1用于转基因成分初步筛选的多重PCR反应体系的建立及反应条件优化

此反应体系是通过检测外源基因调控元件(启动子、终止子)初步筛选水稻中是否含有转基因成份。此体系检测的基因包括CaMV 35s启动子、nos终止子、FMV35s启动子，以及用于确定水稻物种的内源标志基因肌动蛋白，18s rRNA做为阳性对照。PCR引物序列见表2。

本发明者在建立PCR反应检测单个目的基因的基础上，经过多次实验，不断优化反应条件，确定了能同时扩增多目的基因的多重PCR反应体系：DNA模板各100ng，10×PCR缓冲液10μl，dNTP(各10mmol/L)2μl，上、下游引物混合物(各5μmol/L)1μl，Taq酶2μl，双蒸水补足至100μl。在PTC-100DNA热循环仪上扩增热循环仪上扩增，反应条件为：95℃模板变性5min，95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸10min。图4显示了用于初步筛选确定有无转基因成分的多重PCR反应结果，其中通过一个反应就能同时检测外源基因的启动子和终止子、内源标志基因及阳性对照，共5种目标序列。

3.3.2用于检测特定转基因成分的多重PCR反应体系的建立及条件优化

此反应体系是在初筛阳性的基础上进一步确定样本中含有哪种转基因成份。此体系检测的基因包括Bar、Bt、Cpt1、Rch10、Xa21、lrp、和osvte。PCR引物序列见上表3。反应体系及条件同3.3.1。图5显示在优化的反应条件下用多重PCR反应检测特定转基因成分的结果。如图所示，通过一次PCR反应能同时检测7种转基因成分。

4.连接酶检测反应(LDR)反应并优化反应条件

上述多重PCR扩增完成后，用蛋白酶消化PCR产物，条件如下：多重PCR产物10μL，1μLPK(20mg/ml)，70℃消化10min，94℃20min，终止反应。多重PCR产物经蛋白酶消化后用耐高温DNA连接酶进行LDR反应。LDR反应体系如下：10μL经消化的多重PCR产物，20mM Tris-HCl(pH 7.6)，10mM DTT，1mMNAD，0.1％Triton X-100，每种鉴别探针各1pmol，每种通用探针各1pmol，40U/μL Taq DNA连接酶0.5μL。LDR反应条件为94℃30s，63℃4min，共40个循环。

5.基因芯片寡聚核苷酸探针的设计、合成及芯片制备

根据文献报道的探针设计方法(J Mol Biol，1999；292：251)，从已有探针库内挑选合适的Zip探针及通用探针。方法如下：根据每一待测基因片段的序列设计鉴别探针(discriminating probe)(表4，5，6)，在其5’端带有与固定在芯片上的Zip探针(表7)互补的序列，3’端与待测的基因序列互补，设计尽量使所有探针的Tm值基本一致。在通用探针(common probe)上标记有荧光基团，鉴别探针和通用探针只有在与被测基因完全互补的情况下才能被连接酶连接并检测出荧光信号。

表4检测外源基因调控元件和内源标志基因的通用探针序列

表5检测外源基因调控元件和内源标志基因的鉴别探针序列

表6检测外源转入靶基因的鉴别探针序列

按已有的方法将Zip探针点样于活化的石英玻片制备芯片(Qin，S.，Zhao，X.，Pan，Y.，Liu，J.，Feng，G.，Fu，J.，Bao，J.，Zhang，Z.，He，L.，2005.EurJ Hum Genet.13，807-814.)。

表7检测水稻中转基因成分所对应的Zip探针序列

6.芯片杂交

将适量LDR反应产物与2×杂交液混匀后加于芯片进行杂交反应，反应混合物94℃2min，立即置于冰上，杂交反应65℃3h.

按照文献方法(Qin，S.，Zhao，X.，Pan，Y.，Liu，J.，Feng，G.，Fu，J.，Bao，J.，Zhang，Z.，He，L.，2005.Eur J Hum Genet.13，807-814.)得到芯片杂交结果。图6为用该芯片得到的杂交结果，图6A显示在转基因水稻样本中，除水稻内源标志基因(水稻肌动蛋白)和阳性对照外，外源基因启动子(35s启动子，FMV启动子)和终止子(nos终止子)检测结果为阳性。图6B为非转基因水稻样本的芯片杂交结果，显示未检测到外源基因启动子和终止子。

图7A显示，在转基因水稻样本，检测到存在外源基因Cpt1，Bt，Irp，Bar，osvte，Xa21和RCH10。而在非转基因水稻样本，上述基因检测结果均为阴性(图7B)。

利用上述多重PCR-LDR-UA检测体系检测了上海市9种常见的水稻样品，在所检测的基因中，均未检出阳性结果。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

Claims (10)

1.一种用于检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含两组引物组，其中第一引物组包含特异性扩增CaMV35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cpt1基因、Rch10基因、Xa21基因、lrp基因和osvte基因的引物对。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中所述试剂盒包含以下引物对：

CaMV 35s 启动子   正向    agactggcgaaccagttcatacaga(SEQ ID NO：5)

                  反向    gcaatggaatccgaggaggt(SEQ ID NO：6)

nos 终止子        正向    tgaatcctgttgccggtctt(SEQ ID NO：7)

                  反向    aaatgtataattgcgggactctaatc(SEQ ID NO：8)

FMV 35s 启动子    正向    cagcattccagattgggttca(SEQ ID NO：9)

                  反向    cttttggctaatggtttggagac(SEQ ID NO：10)

Bar               正向    tgcaccatcgtcaaccactaca(SEQ ID NO：11)

                  反向    ctgccagaaacccacgtcat(SEQ ID NO：12)

Bt                正向    aacctgtgggagaatccttgc(SEQ ID NO：13)

                  反向    cttgccatccgctgtttaca(SEQ ID NO：14)

Cpt1              正向    ctaaatcaatacctcctcaatgcca(SEQ ID NO：15)

                  反向    cttactcatcatcttcatccctgga(SEQ ID NO：16)

Rch10             正向    cagcacaacccaaagccata(SEQ ID NO：17)

                  反向    gcgaagcccgagtaggagct(SEQ ID NO：18)

Xa21              正向    cagcacaacccaaagccatat(SEQ ID NO：19)

                  反向    gcgaagcccgagtaggagc(SEQ ID NO：20)

lrp               正向    gagaagaccgactgctacacct(SEQ ID NO：21)

                  反向    gcagagaacaacaggacgaaga(SEQ ID NO：22)

osvte             正向    cagtggctcctgctatcctttaca(SEQ ID NO：23)

                  反向    caaagcagcaccaccaactatg(SEQ ID NO：24)。

3.如权利要求1或所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含连接酶检测基因芯片系统，所述系统包含：

连接酶反应体系；

基因芯片，所述芯片上连接了Zip探针序列；

鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与所述Zip探针序列互补的序列；

通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述鉴别探针包含如SEQ ID NO：25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO：37-48所示的探针序列。

5.一种用于检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的试剂盒，所述试剂盒包含以下两组探针：

1)鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与固定在基因芯片上的Zip探针序列互补的序列；和

2)通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述鉴别探针包含如SEQ ID NO：25-36所示的探针序列；所述通用探针包含如SEQ ID NO：37-48所示的探针序列。

7.一种检测食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a)提取所述食品的DNA；

b)用第一引物组对所述提取的DNA进行PCR扩增，所述第一引物组包含特异性扩增CaMV 35S启动子、nos终止子和FMV 35S启动子的引物对；用第二引物组对提取的DNA进行PCR扩增，所述第二引物组包含特异性Bar基因、Bt基因、Cpt1基因、Rch10基因、Xa21基因、lrp基因和osvte基因的引物对；

c)检测所述PCR扩增产物，从而确定所述食品中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤b)中采用以下引物对对提取的DNA进行PCR扩增：

CaMV 35s 启动子 正向    agactggcgaaccagttcatacaga(SEQ ID NO：5)

                反向    gcaatggaatccgaggaggt(SEQ ID NO：6)

nos 终止子      正向    tgaatcctgttgccggtctt(SEQ ID NO：7)

                反向    aaatgtataattgcgggactctaatc(SEQ ID NO：8)

FMV 35s 启动子  正向    cagcattccagattgggttca(SEQ ID NO：9)

                反向    cttttggctaatggtttggagac(SEQ ID NO：10)

Bar             正向    tgcaccatcgtcaaccactaca(SEQ ID NO：11)

                反向    ctgccagaaacccacgtcat(SEQ ID NO：12)

Bt    正向    aacctgtgggagaatccttgc(SEQ ID NO：13)

      反向    cttgccatccgctgtttaca(SEQ ID NO：14)

Cpt1  正向    ctaaatcaatacctcctcaatgcca(SEQ ID NO：15)

      反向    cttactcatcatcttcatccctgga(SEQ ID NO：16)

Rch10 正向    cagcacaacccaaagccata(SEQ ID NO：17)

      反向    gcgaagcccgagtaggagct(SEQ ID NO：18)

Xa21  正向    cagcacaacccaaagccatat(SEQ ID NO：19)

      反向    gcgaagcccgagtaggagc(SEQ ID NO：20)

Lrp   正向    gagaagaccgactgctacacct(SEQ ID NO：21)

      反向    gcagagaacaacaggacgaaga(SEQ ID NO：22)

Osvte 正向    cagtggctcctgctatcctttaca(SEQ ID NO：23)

      反向    caaagcagcaccaccaactatg(SEQ ID NO：24)。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在所述步骤c)中，采用连接酶检测基因芯片系统检测所述PCR扩增产物，所述系统包含：

连接酶反应体系；

基因芯片，所述芯片上连接了Zip探针序列；

鉴别探针，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与所述Zip探针序列互补的序列；

通用探针，所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记。

10.一种检测核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供核酸混合物；

b)在核酸混合物中加入通用探针和鉴别探针，用耐高温DNA连接酶进行连接酶反应；其中，所述鉴别探针包含与目标基因的第一片段互补的第一探针序列以及与固定在芯片上的Zip探针序列互补的序列；所述通用探针包含与目标基因的第二片段互补的第二探针序列，所述第一片段和所述第二片段毗邻，且所述通用探针携带可检测标记；

c)使步骤b)所得反应物在固定有Zip探针的芯片上进行杂交反应，检测杂交结果，从而确定核酸混合物中是否存在转基因成分以及存在何种转基因成分。

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