CN103173561A

CN103173561A - 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因mecA的引物和探针

Info

Publication number: CN103173561A
Application number: CN2013101254123A
Authority: CN
Inventors: 金姝; 黄德魁; 张骥; 朱晴晖; 邹玉涵
Original assignee: SHANGHAI PUTUO DISTRICT PEOPLE'S HOSPITAL
Current assignee: SHANGHAI PUTUO DISTRICT PEOPLE'S HOSPITAL
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2033-04-11
Also published as: CN103173561B

Abstract

本发明提供一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantStaphylococcusaureus,MRSA)中耐药基因mecA的引物和探针。本发明还提供了检测MRSA中耐药基因mecA方法和检测试剂盒。本发明采用直接检测耐药基因mecA的保守序列部分，不受菌株mecA基因变异的影响，结果为MRSA诊断的金标准。本发明所提供的特异性引物和探针适用于目前已知包含序列变异的菌株。

Description

检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因mecA的引物和探针

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用PCR方法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)中耐药基因mecA的特异性引物和探针。

背景技术

控制医院内和社区MRSA的感染及其扩散是全球范围的重要公共卫生策略。2007年，欧洲抗生素监测网(监测了31个欧洲国家，超过600家实验室)报道每100000个住院病人日的MRSA菌血症的发病率从0.2上升到24.4。2005年美国监测网(监测了全美国300家临床微生物实验室)报道了在非ICU病房、ICU病房及门诊分离出的金黄色葡萄球菌中MRSA的比例分别为59%、55%和48%。两项荟萃分析的结果显示，与MRSA血流感染相关的死亡率是MSSA(methicillin sensitive Staphylococcus aureus, MSSA,甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌)的两倍。MRSA感染的治疗费用显著高于MSSA。因此对MRSA的早期诊断显得尤为重要。

常规的细菌培养需48-72小时获得结果，MRSA的快速分子检测仅需2小时。据报道，美国商品化的(BD GeneOhm? MRSA ACP)快速分子检测法的灵敏度和特异性分别可达到85%和95%。MRSA对甲氧西林的耐药是由耐药基因岛-葡萄球菌染色体mec盒（Staphylococcal Cassette Chromosome mec, SCCmec）介导，SCCmec整合于染色体复制起始点附近、一个功能暂未阐明的开放式阅读框架X(orfX)基因处，有利于耐药基因的高表达。根据orfX基因和SCCmec整合位点的不同可对MRSA进行分型(即MREJ分型)，目前BD GeneOhm? MRSA ACP试剂盒检测的目的序列即在SCCmec整合位点和orfX基因内，其可检测MREJ i-vii型，而MREJ有20型之多，因此使用该试剂易造成假阴性，有报道称其检测灵敏度可能基于不同的流行株而低至50%；同时该试剂并不是直接检测SCCmec盒中的耐药基因mecA，因此当出现一个不含耐药基因mecA的“空”SCCmec盒的变体时，就会导致假阳性结果。

美国临床实验室标准化委员会制定的MRSA病原学诊断的金标准是检测SCCmec盒中的耐药基因mecA和/或耐药基因编码的蛋白PBP2a。mecA基因通过编码青霉素结合蛋白2a（PBP2a, 一种降低β内酰胺抗生素亲和力的酶）而赋予对甲氧西林耐药的特征。mecA基因全长2007bp，其表达产物pbp2a蛋白的全长为668个氨基酸。

目前有文献报道用PCR和探针检测mecA基因，其都是用GENEBANK中某一条特定的mecA基因全序列进行引物和探针的设计。没有考虑到基因和蛋白的变异。相当一部分引物和/或探针的序列正好处于易发生变异的位点处，容易导致假阴性结果。

发明内容

针对上述技术的不足，本发明的目的在于提供一种用PCR方法检测MRSA的引物，其直接检测耐药基因mecA。

本发明的再一目的是提供所述引物配合使用的荧光探针。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种用PCR方法MRSA耐药基因mecA的特异性引物，其核苷酸序列分别为：

上游引物：5- GGTTACGGACAAGGTGAAATACTGA -3(SEQ ID NO.1) ；

下游引物：5- GTGTCTTTTAATAAGTGAGGTGCGTTA -3(SEQ ID NO.2) 。

本发明还提供了与引物配合使用的荧光探针，探针的5标记荧光基团FAM，3标记淬灭基团TAQMAN-MGB。

在本发明的一个实施例中，与上述引物配合使用的荧光探针核苷酸序列为：5- FAM-CCAGTACAGATCCTTTC-TAQMAN-MGB -3(SEQ ID NO.3)。

本发明还提供了上述引物和荧光探针在检测MRSA耐药基因mecA的检测试剂盒中的应用。

本发明提供一种检测MRSA耐药基因mecA的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立阴性对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。

本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，其中20μL的反应体系为：Premix Ex Taq^TM (2×) 10ul(购自TAKARA公司)，20uM的上、下游引物各0.6μL，20uM的探针0.2μL，模板2μL(DNA含量50-200ng)，H₂O 6.6μL。

本发明采用的实时荧光定量PCR的反应程序为：

94℃ 预变性2min；

94℃ 变性10s，60℃ 退火及PCR反应31s，共40个循环；

37℃ 10s。

本发明还提供一种用于检测MRSA耐药基因mecA 的试剂盒，其包括上述特异性引物以及配合引物使用的探针。

本发明试剂盒的引物序列为：

上游引物：5- GGTTACGGACAAGGTGAAATACTGA -3，（SEQ ID NO.1）；

下游引物：5-GTGTCTTTTAATAAGTGAGGTGCGTTA-3，（SEQ ID NO.2）

探针：5-FAM-CCAGTACAGATCCTTTC-TAQMAN-MGB-3(SEQ ID NO.3)。

本发明采用直接检测耐药基因mecA的保守序列部分，不受菌株mecA基因变异的影响，结果为MRSA诊断的金标准。本发明所提供的特异性引物和探针适用于目前已知包含序列变异的菌株。

附图说明

图1为临床分离的20株MRSA和1株甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌 (methicillin sensitive Staphylococcus aureus, MSSA) DNA提取后，用PCR的方法检测耐药基因的结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

实施例1 所用引物和探针的设计与合成

发明人分析了NCBI数据库中的47个pbp2a蛋白序列和1个临床分离株中该蛋白的序列，其中有23个蛋白序列完全相同，在余下25个蛋白序列中共发现以下15种变异，其中以246位氨基酸变异最常见，具体见表1。

表1

因此，发明人在设计引物和探针时避开以上变异位点。同时由于mecA序列的A+T含量高达70%，退火温度较低，导致杂交特异性降低，因此，发明人采用MGB探针。探针的3’端结合了MGB(minor groove binder，小沟结合物)，它可以结合在DNA双螺旋的小沟里，从而起到稳定DNA双螺旋的作用，使得探针的Tm值增高，增加了探针的杂交稳定性，提高了配对与非配对模板间的Tm值差异，使非特异性杂交显著降低。

设计的引物序列具体见表2。

表2

实施例2

检测常规细菌培养鉴定的临床分离株MRSA(100株)和MSSA(50株)，以标准菌株33591(购自美国标准生物品收藏中心, ATCC)作为mecA基因阳性对照，以标准菌株25923(购自美国标准生物品收藏中心, ATCC)作为mecA基因的阴性对照。

1、在血平板上复苏标准菌株33591、25923。用TIANamp Bacteria DNA Kit提取标准菌株的DNA。

2、用TIANamp Bacteria DNA Kit分别提取生长于血平板上的临床分离的金黄色葡萄球菌DNA。

3、按照实施例1进行引物和探针的合成。

寡核苷酸名称	序列	靶基因	核苷酸位点
				P上	5-GGTTACGGACAAGGTGAAATACTGA-3	mecA	1552-1576
P下	5-GTGTCTTTTAATAAGTGAGGTGCGTTA-3	mecA	1632-1658
				MGB探针	5-FAM-CCAGTACAGATCCTTTC-TAQMAN-MGB-3	mecA	1582-1598

4、引物和探针的浓度均配置为20uM。PCR反应混合液购自TAKARA公司。

5、在PCR反应孔中按以下要求加入反应液，总体积20ul。

P上：0.6μL（20uM储存浓度）；

P下：0.6μL（20uM储存浓度）；

MGB探针：0.2μL（20uM储存浓度）；

DNA：2μL（DNA含量可以为50-200ng之间）；

Premix Ex Taq^TM (2×)：10μL （2×储存液）；

H₂O：6.6μL。

4、混匀后使用lightcycler 480 II荧光定量PCR仪，按以下条件进行反应：

94℃ 2min；

94℃ 10s，60℃ 31s，共40个循环；

37℃ 10s。

5、分析数据：1）阳性对照有明显的S型曲线，且0<CT值<35，同时阴性对照无明显的S型曲线，CT值为0，判断实验结果有效。2）样本有明显的S型曲线，且0<CT值<35，判断为mecA基因阳性。3）有无明显的S型曲线，或CT值>35，判断为阴性。

6、结果：

本发明的引物和探针以及所采用的PCR反应物浓度、反应缓冲液和反应条件可以得到明显的S型曲线(如图1所示)，可用于mecA基因的分子检测。

100例MRSA全部为mecA基因阳性；50例MSSA全部为mecA基因阴性。与常规细菌培养鉴定的结果完全符合，见表1。

表1

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市普陀区人民医院

<120> 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因mecA的引物和探针

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggttacggac aaggtgaaat actga 25

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgtctttta ataagtgagg tgcgtta 27

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccagtacaga tcctttc 17

Claims

1.检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因mecA的引物，其特征在于，其核苷酸序列为：

上游引物：5- GGTTACGGACAAGGTGAAATACTGA -3(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5- GTGTCTTTTAATAAGTGAGGTGCGTTA -3(SEQ ID NO.2)。

2. 与权利要求1所述引物配合使用的探针。

3. 根据权利要求2所述的探针，其特征在于，其核苷酸序列为：

5- FAM-CCAGTACAGATCCTTTC-TAQMAN-MGB-3 (SEQ ID NO.3)。

4. 权利要求1所述引物或权利要求2或3所述探针在检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因mecA的检测试剂盒中的应用。

5. 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因mecA的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，利用权利要求1所述引物和权利要求2或3所述探针进行实时荧光定量PCR，同时设立阴性对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。

6. 根据权利要求5所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系，其中20μL的反应体系为：Premix Ex Taq^TM (2×) 10ul，20uM的上、下游引物各0.6μL，20uM的探针0.2μL，模板2μL（DNA含量为50-200ng），H₂O 6.6μL。

7. 根据权利要求5或6所述的实时荧光定量PC检测方法，其特征在于，采用的实时荧光定量PCR的反应程序为：

94℃ 预变性2min；

94℃ 变性10s，60℃ 退火及PCR反应 31s，共40个循环；

37℃ 10s。

8. 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因mecA 的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的引物以及配合引物使用的权利要求2或3所述的探针。