CN110195121A - 一种检测耐甲氧西林金葡菌的cpa引物及试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种检测耐甲氧西林金葡菌的cpa引物及试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测耐甲氧西林金葡菌的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法，该CPA引物是针对两个靶点femA及mecA设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，引物序列如前文SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.10所示；其检测方法是建立检测femA和mecA的交叉引物恒温扩增反应体系，进行交叉引物恒温扩增反应，观察两个反应体系颜色变化，若两个反应体系颜色都变为绿色，说明待检测样品中含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；否则说明检测样品中不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。本发明的引物和方法检测时间快，可以在60分钟左右获得检测结果；此外，检测灵敏度高，达到fg/μL的级别。

Description

一种检测耐甲氧西林金葡菌的CPA引物及试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测耐甲氧西林金葡菌的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法。
背景技术
目前微生物的检测鉴定方法主要分为培养鉴定法、免疫检测法及核酸检测。培养鉴定法及免疫检测法操作繁琐、实验周期长，对实验人员专业水平要求高。
交叉引物恒温扩增(Crossing Priming Amplification,CPA)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但该反应引物设计难度较高，需要在有限的产物长度中设计五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响结果，因此引物的设计尤为重要。
金黄色葡萄球菌(金葡菌)在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及动物和人的排泄物中都存在。这样的情况导致了其对食品的污染机会很高。金葡菌是一种常见的条件致病性食源性微生物，为侵袭性细菌，其分泌的葡萄球肠毒素可导致人类发生食物中毒。其产生的毒素对肠道破坏性大，引起的肠炎疾病起病急，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热和腹泻。由金葡菌感染所导致的中毒食品种类很多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。同时治疗过程中抗生素的使用也导致了大量耐甲氧西林金葡菌在食源性食品中被发现，给人类健康和临床治疗带来了巨大的挑战。目前由耐甲氧西林金葡菌引起的食品安全事故已经成为世界性的卫生问题。
中国专利申请CN 109355403A公开了一种PSR检测耐甲氧西林金葡菌的引物、试剂盒与方法。然而该专利的检测限仅达到pg/μL级别，灵敏度不够高，限制了适用范围。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的CPA引物。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述CPA引物的耐甲氧西林金葡菌检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种耐甲氧西林金葡菌的CPA检测方法，该方法具有灵敏度高(检测限达到fg/μL级别)、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用等特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的CPA引物，是针对两个靶点femA及mecA设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列如下所示：
靶点femA剥离引物4s：5’-tcaaatcgcggtccagtg-3’(SEQ ID NO.1)
靶点femA剥离引物5a：5’-aaccaatcattaccagca-3’(SEQ ID NO.2)
靶点femA交叉引物2a1s：5’-tacctgtaatctcgccataacatcgttgtctatacct-3’(SEQID NO.3)
靶点femA特异引物2a：5’-tacctgtaatctcgccat-3’(SEQ ID NO.4)
靶点femA特异引物3a：5’-ggtaaatatggatcgatatg-3’(SEQ ID NO.5)
靶点mecA剥离引物4s：5’-gcgataatggtgaagtag-3’(SEQ ID NO.6)
靶点mecA剥离引物5a：5’-gatcaatgttaccgtagtt-3’(SEQ ID NO.7)
靶点mecA交叉引物2a1s：5’-ttacgatcctgaatgtttatgactgaacgtccgata-3’(SEQID NO.8)
靶点mecA特异引物2a：5’-ttacgatcctgaatgttt-3’(SEQ ID NO.9)
靶点mecA特异引物3a：5’-tctttaacgcctaaacta-3’(SEQ ID NO.10)。
一种检测耐甲氧西林金葡菌的试剂盒，包括上述的CPA引物；
所述试剂盒中，各CPA引物的浓度优选10μM；
所述的试剂盒还包括如下组分：
A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；
B、Bst DNA聚合酶；优选浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液；
C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；
组分C通过如下方法制备得到：
(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；
(ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1:8)。
一种基于上述试剂盒检测耐甲氧西林金葡菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检样品的DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.8～2.0；
(2)分别建立检测femA和mecA的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于高于80℃的水浴中保温至少2分钟终止反应；
其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；
(3)观察两个反应体系颜色变化，若两个反应体系颜色都变为绿色，说明待检测样品中含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；否则说明检测样品中不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌固有的femA基因是MRSA耐药辅助基因，而mecA是MRSA耐药决定基因。因此mecA、femA基因联合使用不仅能快速筛检耐药株，还免去了繁琐的生化鉴定。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的CPA引物，所述的引物对于不同的MRSA菌株均可实现快速、准确的检出，适用性好，灵敏度高(检测限达到fg/μL级别)。
(2)本发明在恒温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果，操作简便快捷，检测成本较低。本发明的试剂盒及方法特别适用中小型单位及现场检测。
(3)本发明中所提供的针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性靶序列femA及mecA所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列femA及mecA的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的周期。
附图说明
图1为交叉引物恒温扩增反应技术检测femA和mecA靶点的凝胶电泳结果及显色结果图；其中，图A为交叉引物恒温扩增检测femA靶点的凝胶电泳结果(泳道1为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442，泳道2为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442，泳道3为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442，NG为空白对照)；图B为交叉引物恒温扩增反应技术检测mecA靶点的显色结果(1为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC1044，2为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌N315，3为大耐甲氧西林金黄色葡萄球菌N315，NG为空白对照)。
图2为检测femA和mecA靶点的特异性实验结果图，图A为交叉恒温扩增反应检测靶点femA的灵敏度试验的结果图，图B为检测靶点mecA灵敏度试验。其中，1：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442，2：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442，3：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442，4：大肠杆菌O157:H7E019；5：大肠杆菌O157:H7E020；6：大肠杆菌E043；7：大肠杆菌E044；8：大肠杆菌ATCC43895；9：沙门氏菌ATCC29629；10：沙门氏菌ATCC19585；11：沙门氏菌ATCC14028；12：沙门氏菌ATCC13076；13：单增李斯特菌ATCC19116；14：单增李斯特菌ATCC19114；15：单增李斯特菌ATCC19115；16：单增李斯特菌ATCC15313；17：单增李斯特菌ATCC19113；18：铜绿假单胞菌ATCC27853；19：副溶血性弧菌ATCC17802；20：副溶血性弧菌ATCC27969；21：干酪乳杆菌BM-LC14617；22：阴性对照。
图3为检测靶点femA和mecA灵敏度实验结果图，图A为交叉恒温扩增反应检测靶点femA的灵敏度试验的结果图，图B为检测靶点mecA灵敏度试验；其中，1为3.0ng/μL，2为300pg/μL，3为30pg/μL，4为3pg/μL，5为300fg/μL，6为30fg/μL，7为3fg/μL，8为300ag/μL，NG为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
基于交叉引物恒温扩增(CPA)反应技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
(1)使用试剂：
a.浓度各为10μM的剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，引物序列如前文SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示；
b.2×反应储液：由浓度为40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)组成；
c.浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶(大片段，NEB公司)水溶液；
d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配制浓度为50μM的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)；然后取25μL 50μM的钙黄绿素溶液，与10μL 1mM的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
(2)提取待检样品的DNA作为模板DNA：
本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为三株耐甲氧西林金葡菌，分别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442；所有菌株均可由公开途径获得；
采用DNA提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌DNA，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌DNA水溶液的OD260/OD280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。
(2)建立检测femA和mecA靶点的交叉引物恒温扩增反应：
在反应管中配制总体积为26μL的交叉引物恒温扩增反应体系：加入2×反应储液12.5μL，4s与5a等体积混合引物混合液3.0μL，交叉引物2a1s 2.5μL，特异引物2a与3a等体积混合液2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板1.0μL，用去核酸水补充体积至25μL，最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μL，混匀即可。此时各物质浓度为：Tris-HCl20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％(v/v)，甜菜碱0.7M，dNTPs(each)1.4mM，Bst DNA聚合酶8U，剥离引物4s、5a各0.6μM，交叉引物2a1s 1.0μM，特异引物2a及3a各0.5μM。将反应管置于63℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。
(3)显色检测：
待反应结束后，用肉眼观察颜色变化。
结果如图1所示，结果显示：femA和mecA靶点对应的实验组(1-3)的颜色变为绿色，说明含有耐甲氧西林金葡菌，空白对照组(NG)的颜色为黄色，说明不含有耐甲氧西林金葡菌；随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，阳性组呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。
实施例2
交叉恒温扩增反应(CPA)检测耐甲氧西林金葡菌特异性试验，包括以下步骤：
将耐甲氧西林金葡菌NCTC10442与非耐甲氧西林金葡菌的基因组DNA按照实施例1中的反应体系和条件建立交叉恒温扩增反应检测方法，进行特异性试验；
其中，非耐甲氧西林金葡菌为：大肠杆菌O157:H7E019；大肠杆菌O157:H7E020；大肠杆菌E043；大肠杆菌E044；大肠杆菌ATCC43895；沙门氏菌ATCC29629；沙门氏菌ATCC19585；沙门氏菌ATCC14028；沙门氏菌ATCC13076；单增李斯特菌ATCC19116；单增李斯特菌ATCC19114；单增李斯特ATCC19115；单增李斯特菌ATCC15313；单增李斯特菌ATCC19113；铜绿假单胞ATCC27853；副溶血性弧菌ATCC17802；副溶血性弧菌ATCC27969；干酪乳杆菌BM-LC14617。
设置耐甲氧西林金葡菌NCTC10442的基因组为阳性对照，去核酸水为阴性对照。对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，A图检测femA特异性检测结果，B图为检测mecA的特异性结果。结果表明，只有含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442出现梯形条带(泳道1至泳道3)，非耐甲氧西林金黄色葡萄球菌则无。如此表明，基于交叉引物恒温扩增反应检测耐甲氧西林金葡菌的引物具有较高的特异性。
实施例3
交叉恒温扩增反应(CPA)检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的灵敏度对比试验，包括以下步骤：
将耐甲氧西林金葡菌NCTC10442的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为3.0ng/μL，300pg/μL，30pg/μL，3pg/μL，300fg/μL，30fg/μL，3fg/μL，300ag/μL，同时设置阴性对照(去核酸水)，按照实施例1中的反应体系构建交叉恒温扩增方法并对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，以确定检测方法的灵敏度。
结果如图3所示，图A为交叉恒温扩增反应检测femA靶点的灵敏度试验的结果图，图B为检测mecA靶点的灵敏度试验。
结果表明：建立的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌femA及mecA靶点交叉引物恒温扩增反应方法可检测样品中30fg/μL(femA)，300fg/μL(mecA)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA。
结论：从上述实验结果可以看出，交叉恒温扩增反应扩增方法与常规PCR和荧光PCR具有如下优点：
操作和鉴定简便快捷：常规PCR整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量PCR需要2～3小时，本发明所提供的检测方法在60分钟就可出现阳性结果。其次对仪器要求低，仅需要一个普通水浴锅，并可以通过荧光染料直接观测检测结果，省去了传统的电泳检测步骤。在快速检测及现场检测的实践中有广泛的应用前景。
特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，从而完成了细菌的定性检测。
灵敏度高:针对耐加氧西林金葡菌femA及mecA的检测限为30fg/μL，300fg/μL，是常规PCR的10～100倍左右，具有较高的灵敏度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种检测耐甲氧西林金葡菌的CPA引物及试剂盒和检测方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点femA剥离引物4s
<400> 1
tcaaatcgcg gtccagtg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点femA剥离引物5a
<400> 2
aaccaatcat taccagca 18
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点femA交叉引物2a1s
<400> 3
tacctgtaat ctcgccataa catcgttgtc tatacct 37
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点femA特异引物2a
<400> 4
tacctgtaat ctcgccat 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点femA特异引物3a
<400> 5
ggtaaatatg gatcgatatg 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点mecA剥离引物4s
<400> 6
gcgataatgg tgaagtag 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点mecA剥离引物5a
<400> 7
gatcaatgtt accgtagtt 19
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点mecA交叉引物2a1s
<400> 8
ttacgatcct gaatgtttat gactgaacgt ccgata 36
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点mecA特异引物2a
<400> 9
ttacgatcct gaatgttt 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶点mecA特异引物3a
<400> 10
tctttaacgc ctaaacta 18

Claims (8)

1.一组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的CPA引物，其特征在于包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列如下所示：
靶点femA剥离引物4s：5’-tcaaatcgcggtccagtg-3’(SEQ ID NO.1)
靶点femA剥离引物5a：5’-aaccaatcattaccagca-3’(SEQ ID NO.2)
靶点femA交叉引物2a1s：5’-tacctgtaatctcgccataacatcgttgtctatacct-3’(SEQ IDNO.3)
靶点femA特异引物2a：5’-tacctgtaatctcgccat-3’(SEQ ID NO.4)
靶点femA特异引物3a：5’-ggtaaatatggatcgatatg-3’(SEQ ID NO.5)
靶点mecA剥离引物4s：5’-gcgataatggtgaagtag-3’(SEQ ID NO.6)
靶点mecA剥离引物5a：5’-gatcaatgttaccgtagtt-3’(SEQ ID NO.7)
靶点mecA交叉引物2a1s：5’-ttacgatcctgaatgtttatgactgaacgtccgata-3’(SEQ IDNO.8)
靶点mecA特异引物2a：5’-ttacgatcctgaatgttt-3’(SEQ ID NO.9)
靶点mecA特异引物3a：5’-tctttaacgcctaaacta-3’(SEQ ID NO.10)。
2.一种检测耐甲氧西林金葡菌的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的CPA引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：各CPA引物的浓度为10μM。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包括如下组分：
A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4 M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；
B、Bst DNA聚合酶；
C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的组分B是浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的组分C中，钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1:8。
7.一种基于上述试剂盒检测耐甲氧西林金葡菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取待检样品的DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.8～2.0；
(2)分别建立检测femA和mecA的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于高于80℃的水浴中保温至少2分钟终止反应；
(3)观察两个反应体系颜色变化，若两个反应体系颜色都变为绿色，说明待检测样品中含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；否则说明检测样品中不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110951896A (zh) * 2019-12-26 2020-04-03 华南理工大学 一种大肠杆菌志贺毒素ii型的cpa检测引物、试剂盒及方法
WO2021003878A1 (zh) * 2019-07-08 2021-01-14 华南理工大学 一种检测耐甲氧西林金葡菌的cpa引物及试剂盒和检测方法
WO2021129118A1 (zh) * 2019-12-26 2021-07-01 华南理工大学 一种铜绿假单胞菌的cpa检测引物、试剂盒及方法
CN113584197A (zh) * 2021-08-31 2021-11-02 华南理工大学 一种检测肠毒素sea的psr引物、检测试剂盒和检测方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113462756A (zh) * 2021-07-02 2021-10-01 华南理工大学 一种交叉引物恒温技术检测mrsa肠毒素的引物、试剂盒及方法
CN113462797A (zh) * 2021-07-02 2021-10-01 华南理工大学 一种沙门氏菌的cpa检测引物及检测试剂盒和检测方法
CN113512604A (zh) * 2021-07-23 2021-10-19 华南理工大学 杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的cpa引物及试剂盒和检测方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102329790A (zh) * 2011-09-28 2012-01-25 河南省农业科学院 双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条
WO2012133127A1 (ja) * 2011-03-31 2012-10-04 株式会社グライエンス ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法
CN103173561A (zh) * 2013-04-11 2013-06-26 上海市普陀区人民医院 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因mecA的引物和探针
WO2013150376A1 (en) * 2012-04-06 2013-10-10 Geneohm Sciences Canada, Inc. Sequences for detection and identification of methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) of mrej type xxi
CN106434887A (zh) * 2016-08-30 2017-02-22 上海生物信息技术研究中心 快速恒温检测金黄色葡萄球菌的方法、引物及试剂盒
CN106987644A (zh) * 2017-05-05 2017-07-28 宁夏出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 一种用于检测金黄色葡萄球菌的lamp检测用引物组及检测方法
CN107058599A (zh) * 2017-06-22 2017-08-18 上海速创诊断产品有限公司 一种检测金黄色葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及其双信号通道检测方法
US20190040451A1 (en) * 2016-01-08 2019-02-07 Advanced Theranostics Inc. Fully integrated hand-held device to detect specific nucleic acid sequences
CN109355403A (zh) * 2018-08-10 2019-02-19 华南理工大学 一种psr检测耐甲氧西林金葡菌的引物、试剂盒与方法
CN109652574A (zh) * 2019-02-22 2019-04-19 华南理工大学 大肠杆菌o157:h7的cpa引物及试剂盒和检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006271370A (ja) * 2005-03-02 2006-10-12 Kitasato Inst:The 黄色ブドウ球菌とメチシリン耐性菌の検出方法及びキット
US9738938B2 (en) * 2010-05-07 2017-08-22 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Single nucleotide polymorphisms and community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus
CN107460249A (zh) * 2017-09-27 2017-12-12 湖北朗德医疗科技有限公司 一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒
CN110195121B (zh) * 2019-07-08 2023-07-18 华南理工大学 一种检测耐甲氧西林金葡菌的cpa引物及试剂盒和检测方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012133127A1 (ja) * 2011-03-31 2012-10-04 株式会社グライエンス ブドウ球菌属内の菌種を判別する方法
CN102329790A (zh) * 2011-09-28 2012-01-25 河南省农业科学院 双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条
WO2013150376A1 (en) * 2012-04-06 2013-10-10 Geneohm Sciences Canada, Inc. Sequences for detection and identification of methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) of mrej type xxi
CN103173561A (zh) * 2013-04-11 2013-06-26 上海市普陀区人民医院 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因mecA的引物和探针
US20190040451A1 (en) * 2016-01-08 2019-02-07 Advanced Theranostics Inc. Fully integrated hand-held device to detect specific nucleic acid sequences
CN106434887A (zh) * 2016-08-30 2017-02-22 上海生物信息技术研究中心 快速恒温检测金黄色葡萄球菌的方法、引物及试剂盒
CN106987644A (zh) * 2017-05-05 2017-07-28 宁夏出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 一种用于检测金黄色葡萄球菌的lamp检测用引物组及检测方法
CN107058599A (zh) * 2017-06-22 2017-08-18 上海速创诊断产品有限公司 一种检测金黄色葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及其双信号通道检测方法
CN109355403A (zh) * 2018-08-10 2019-02-19 华南理工大学 一种psr检测耐甲氧西林金葡菌的引物、试剂盒与方法
CN109652574A (zh) * 2019-02-22 2019-04-19 华南理工大学 大肠杆菌o157:h7的cpa引物及试剂盒和检测方法

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAEK Y H 等: "Application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to rapid detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus from blood cultures", 《BIOMEDICAL SCIENCE LETTERS》 *
BAEK Y H 等: "Application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to rapid detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus from blood cultures", 《BIOMEDICAL SCIENCE LETTERS》, vol. 25, no. 1, 31 March 2019 (2019-03-31), pages 75 - 82 *
QIAO, B 等: "Cross-priming amplification targeting the coagulase gene for rapid detection of coagulase-positive Staphylococci", 《JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY》 *
QIAO, B 等: "Cross-priming amplification targeting the coagulase gene for rapid detection of coagulase-positive Staphylococci", 《JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY》, vol. 119, 31 December 2015 (2015-12-31), pages 188 - 195, XP055772647, DOI: 10.1111/jam.12836 *
ZHENBO XU 等: "Development and application of loop-mediated isothermal amplification assays on rapid detection of various types of staphylococci strains", 《FOOD RESEARCH INTERNATIONAL》 *
ZHENBO XU 等: "Development and application of loop-mediated isothermal amplification assays on rapid detection of various types of staphylococci strains", 《FOOD RESEARCH INTERNATIONAL》, vol. 47, no. 2, 31 July 2012 (2012-07-31), pages 166 - 173, XP028926076, DOI: 10.1016/j.foodres.2011.04.042 *
申建维 等: "多重分子信标环介导等温扩增快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌", 《中华医院感染学杂志》 *
申建维 等: "多重分子信标环介导等温扩增快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌", 《中华医院感染学杂志》, vol. 16, no. 7, 18 August 2006 (2006-08-18), pages 1 *
陈欢 等: "交叉引物恒温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌", 《中国卫生检验杂志》 *
陈欢 等: "交叉引物恒温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌", 《中国卫生检验杂志》, vol. 29, no. 11, 10 June 2019 (2019-06-10), pages 3 - 6 *
陈欢 等: "联合环介导等温扩增技术和横向流动试纸条检测金黄色葡萄球菌", 《预防医学》 *
陈欢 等: "联合环介导等温扩增技术和横向流动试纸条检测金黄色葡萄球菌", 《预防医学》, vol. 31, no. 4, 2 April 2019 (2019-04-02), pages 423 - 425 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021003878A1 (zh) * 2019-07-08 2021-01-14 华南理工大学 一种检测耐甲氧西林金葡菌的cpa引物及试剂盒和检测方法
CN110951896A (zh) * 2019-12-26 2020-04-03 华南理工大学 一种大肠杆菌志贺毒素ii型的cpa检测引物、试剂盒及方法
WO2021129118A1 (zh) * 2019-12-26 2021-07-01 华南理工大学 一种铜绿假单胞菌的cpa检测引物、试剂盒及方法
CN113584197A (zh) * 2021-08-31 2021-11-02 华南理工大学 一种检测肠毒素sea的psr引物、检测试剂盒和检测方法

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