CN107119140A - 呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒 - Google Patents

呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒 Download PDF

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CN107119140A CN201710459405.5A CN201710459405A CN107119140A CN 107119140 A CN107119140 A CN 107119140A CN 201710459405 A CN201710459405 A CN 201710459405A CN 107119140 A CN107119140 A CN 107119140A
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苏海峰
高亚平
吴国君
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Abstract

本发明基于微流控芯片技术，结合核酸等温扩增技术对七种呼吸道致病菌进行快速检测。属于呼吸道病原菌安全快速检测领域。本技术通过将样品快速处理后，与试剂盒中试剂混合。混合液加入到微流控芯片中。预先加载在微流控芯片中的引物与混合液中可能存在的微生物基因模板在特定的单一温度下，发生核酸等温扩增反应。反应体系中的荧光染料与扩增产物结合产生荧光信号。通过仪器判读确定呼吸道中是否存在此七种病原。本方法采用微流控芯片技术减少了对样品量的需求，增加了检测通量，可同时检测七种致病菌。使用核酸等温扩增技术，增加检测特异性和敏感性；操作简单，反应时间短。为临床提供一种简单迅速的呼吸道致病菌检测技术。

Description

呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒
技术领域
本技术属于呼吸道致病菌快速检测领域。涉及一种微流控芯片快速检测技术和核酸等温扩增技术；具体涉及一种呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒，具体包含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特定基因保守序列具有的特异性引物和引物组；还涉及将引物和引物组用于等温扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
下呼吸道感染(Lower Respiratory Tract Infection,LRTI)是常见的呼吸系统疾病住院原因之一，包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等。常见病症包括社区获得性肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重期、支气管扩张急性加重期等。对于下呼吸道感染性疾病，临床常规的血液等生化指标分析仅能通过免疫细胞及球蛋白水平初步判断病因，无法确定病原菌的种属。临床上呼吸道感染性疾病非典型性和混合感染的趋势逐渐增加，很难通过病原鉴定以外的方法进行诊治。
目前临床上对病原菌鉴定的方法主要是培养法。其主要步骤取样、培养、鉴定。培养法本身存在较多缺陷，不能满足临床需要。首先培养法检测耗时长，培养时间与所感染的细菌种类有关，至少用时2-3天，当临床出现急性病症时，培养法无法适用；其次该方法准确性低，尤其是批量鉴定时，样品之间很容易互相感染；并且难以检出需要特殊培养条件的细菌，如军团菌、L-型细菌、肺炎链球菌等；再次受国内实验室安全防护条件的限制，实验室工作人员在分离培养病原菌时存在着高风险被感染的可能；最后培养法对实验条件要求较高，需要的培养基种类较多，乡镇医院、社区医疗单位和户外等均无法使用细菌培养的检测方法，很容易对病人造成贻误。对于普通PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术鉴定病原微生物的方法，因其对实验室要求高，需要特殊仪器，容易出现假阳性和交叉污染等缺点，也不利于其应用的开展。
综上所述，在当前医疗卫生重心转移的大背景下，在临床上尤其是基层医疗机构对快速准确，操作简单，实验环境要求低的诊断产品具有迫切需求。
其中，现有技术CN102952875A提供了一种细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒。该试剂盒包括扩增待测细菌耐药基因的引物对和检测探针。该基因芯片包括检测待测细菌耐药基因的探针。利用该试剂盒和基因芯片进行耐药基因检测的方法，包括步骤：1)利用试剂盒中的引物，PCR扩增待测样本DNA中的耐药基因；2)扩增产物与试剂盒中的检测探针进行荧光标记反应；3)荧光标记的扩增产物与基因芯片进行杂交，确定样本所含耐药基因。该方法包括核酸提取、多重PCR和荧光标记反应、基因芯片预处理、荧光标记的多重PCR产物与芯片的杂交反应、芯片扫描和结果分析五个步骤操作复杂。且每个步骤都需要诸多的仪器和苛刻的实验环境，很容易遭成扩增产物污染，出现结果假阳性。另外与科研单位相比医院检验科实验用仪器较少，尤其是区域型小医院没有经费及条件购置多通道PCR仪，且该方案中原材料包括探针，探针的成本较高将导致产品售价过高，超出部分患者接受范围不利于该试剂盒推广。
现有技术CN104313166A一种铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒，所述铜绿假单胞菌多重耐药基因包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因，试剂盒包括核酸扩增组份和杂交组份；核酸扩增组份具体包括：预混液、引物混合液、聚合酶、阳性质控品、阴性质控品；杂交组份具体包括：微球杂交液、质控微球和链霉亲和素-藻红蛋白。该方案中的探针及微球都是价格较贵的原料，荧光定量PCR仪的价格较高，需要经培训的专业人士操作，部分医院更没有相关仪器。另外该方法PCR过程中设计较多升降温过程，使得整个实验时间周期较长。
本发明所开发的呼吸道核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)，结合了恒温扩增技术，实时荧光技术和微流控芯片技术，对下呼吸道分泌物样本中的核酸进行检测，特异性好，灵敏度高，操作简单，检测迅速。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的一个目的在于提供一种呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒，包含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌七种致病菌特异性片段检测用引物组。
具体地，本发明通过以下技术方案实现：
一种呼吸道微流控芯片快速检测试剂盒，所述试剂盒为对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌进行检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特异性基因为模板设计的特异性引物组、检测芯片、核酸扩增反应液、阳性模板。
所述引物组包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌七种病原菌检测用引物组，其特征在于能扩增靶基因特异碱基序列，所述靶基因分别为：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌，为所述引物与所述靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链互补。所述引物组由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌各6个引物组成。
所述引物组包含：
一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 TTATGTATCAGGTACTTAT
反向外引物 B3 TTTTGTTATTTAACCCAATCATTTA
正向内引物 FIP
ATTCTTCGTTACTCATTACATACATGTGAATTATTATAACTTGTAATAAC
反向内引物 BIP
AACCGAAGATAAAAAAGAACCTCTGAATATTTTTTGAGTTGAACCTGGTG
正向环引物 LF AATGGATAGACGTCATATGAAGGT
反向环引物 LB CTCAACAAGTTCCAGATTACAACTT
可以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因特异性序列；
一种金黄色葡萄球菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 GTTACTTTACAGATATAATG
反向外引物 B3 GAAAAAGTGTACGAGTTCTTGA
正向内引物 FIP GTTTCATAACCTTCATAAATATTTCCATACAGTCATTTCACTAA
反向内引物 BIP GAGGTCATTTAATATTTATTACTTCGATCACTGGACCTAG
正向环引物 LF AACTCATAGTGTACAACA
反向环引物 LB GTACCTGTTATGAAAGTGTTCA
可以扩增金黄色葡萄球菌基因特异性序列；
一种大肠埃希菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 GTAATCGTGGTGATTGATGA
反向外引物 B3 GGTTCGTTGTAAATACTCCA
正向内引物 FIP TCTTTCGTATTGTTTACCTACTTATGTCGTATTTAACCTC
反向内引物 BIP TACATAGAAGAGTAAGTCAACGTTTTGGTTTTTGTCACTATATATC
正向环引物 LF TTCGAAACCAATTACTAAAGA
反向环引物 LB TATAACTTACAGTAGATT
可以扩增大肠埃希菌基因特异性序列；
一种肺炎克雷伯菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 GTCTCTACAATAGGAAT
反向外引物 B3 ATGAGACCTACTGGGACA
正向内引物 FIP AACCTAAATGTTAAAATAAGTCAGGGAGACGACCGT
反向内引物 BIP AGTTAATAAAGTAGGAGTACTTTATTTTGTTCTAGTATGGAATCGG
正向环引物 LF CGATGACATAATAAATAACCG
反向环引物 LB TATATATACCACTACCA
可以扩增肺炎克雷伯菌基因特异性序列。
一种铜绿假单胞菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 TGTTATGGAAATGTCCACCTT
反向外引物 B3 TCTTATGATATTTCTGAG
正向内引物 FIP GTACAGAACATAATACAGAGGAACACGATGAACAACGT
反向内引物 BIP ATATCGTCTGACCTATACCCTTCGTCATACTTTAGAT
正向环引物 LF CCAGATAAGAGAATTTCAGA
反向环引物 LB ATATTATCGTTATCAGG
可以扩增铜绿假单胞菌基因特异性序列；
一种鲍曼不动杆菌伯检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 TGTTACAATTAACTTCTTATA
反向外引物 B3 CTTGTAATATCGTTATAGTAGTT
正向内引物 FIP
AGTGAATTCGGTTATCGTAATATCGAATAATAAAAAAAAATTAGTCAC
反向内引物 BIP AATGATATGTATCAAAATATAGAGTATTAACTCATGTTAGATGG
正向环引物 LF TATAAGAGAGGTCTAC
反向环引物 LB CCGTTAAAAATTATAAGG
可以扩增鲍曼不动杆菌基因特异性序列。
一种嗜麦芽窄食单胞菌伯检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 GTATAATATTGGAGGTTCCT
反向外引物 B3 ATGAAGTAGTACAGATG
正向内引物 FIP TATACAAGATATCAATAGTGTAACCTATGATCAGGGA
反向内引物 BIP ACAACTAGTCGTTCACCGGTACGAGTAAATTACAAACTAGATG
正向环引物 LF GATTACGGGGTAGGAA
反向环引物 LB ACCCGATGACAAGGGTAT
可以扩增嗜麦芽窄食单胞菌基因特异性序列。
本发明前述每组引物都经多次筛选，最终引物为扩增效率高，特异性好的引物序列。
本发明的另一个目的在于提供一种呼吸道微流控芯片快速检测芯片，是针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特异性基因片段的检测方法及专用的微流控芯片。
所述专用微流控芯片，其特征在于微流控芯片上固定有上述七种引物组及阳性质控品和阴性质控品组成的阵列。
所述检测方法是指基于核酸等温扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的检测方法。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
本发明所提供的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的方法，是通过针对上述七种病原菌特定基因片段设计引物，并利用核酸等温扩增技术，以微流控芯片为载体，在恒温平台上进行扩增，并根据显色反应进行结果判读。
本发明的另一个目的在于，提供七种利用上述不同引物组基于核酸等温扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的检测试剂盒。其特征在于，所述试剂盒至少包括含有扩增反应液及上述固定有上述引物组的基因芯片。
所述扩增反应液中包括如下试剂：
表1扩增反应液具体组分及浓度
序号 试剂组分 终浓度
1 10×ThermoPol Buffer 1×
2 MgSO4 2-7mmol/L
3 BSA 0.2-2mg/ml
4 dATP 0.2-3mmol/L
5 dGTP 0.2-3mmol/L
6 dCTP 0.2-1.5mmol/L
7 dTTP 0.2-1.5mmol/L
9 Betaine 0.2-1mol/L
10 dUTP 0.01-0.5mmol/L
11 EvaGreen 1×
13 UNG 0.001U/μl
14 Bst polymerase 0.25-0.5U/μl
所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA聚合酶。
所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为TE缓冲液；所述阳性对照模板为酵母菌DNA片段(1～100nM)。
本发明同时提供一种使用前述呼吸道微流控芯片快速检测试剂盒的检测方法，为所述七种呼吸道致病菌的检测试剂盒的检测方法，该方法具体步骤为：
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于痰液样品标本；临床样本液化后取1mL菌液加入离心管中，12000rpm，离心2min后弃上清，加入600μL超纯水，12000rpm，离心2min后弃上清对菌液进行清洗，在离心管中加入200ul超纯水充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板。
2)分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 0.1％琼脂糖混合，点在相应位置.
3)阳性质控品，取0.159μL1×105酵母DNA，0.545μl0.1％琼脂糖和0.296μl引物混合之后，点在相应位置。
4)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的核酸等温扩增
取扩增反应液，加入待检模板，形成如下的反应体系。
表2反应体系中具体组分及浓度
振荡混匀后离心，将离心后的上清液注入芯片，转至iChip-400仪器(ichip-仪器为本公司自主研发的等温显色检测系统，包括软件和硬件两部分)中，温度65℃进行反应，时间60min。
5)核酸反应产物的检测
检测：与阴性对照孔比较，检测孔在iChip-400设备上有S形曲线判定为阳性。在iChip-400设备上未见S形曲线为阴性。
本发明通过提供七种针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特定基因片段具有特异性的引物组，固定有上述引物组微流控芯片，及包含有上述扩增反应液的试剂盒对样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌进行检测。
本发明提供的检测试剂和检测方法可检出1×10‐3CFU/μL的耐药菌、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，可解决携带耐药基因的病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，还拥有试剂消耗量小，该试剂盒仅需要48μL扩增反应液便可以同时对11中耐药基因进行检测、污染小，该实验全称为闭盖氏反应，且体系中含有UNG酶，减少了污染的可能、成本低、且便携等诸多优点。
附图说明
图1为基因芯片排布示意图，其中，①为进样口卡扣，②为进样孔，③为反应池，④为排气孔；
图2为用图1所示的基因芯片对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行实际检测结果；
图3为用图1所示的基因芯片对金黄色葡萄球菌进行实际检测结果；
图4为用图1所示的基因芯片对大肠埃希菌进行实际检测结果；
图5为用图1所示的基因芯片对肺炎克雷伯菌进行实际检测结果；
图6为用图1所示的基因芯片对铜绿假单胞菌进行实际检测结果；
图7为用图1所示的基因芯片对鲍曼不动杆菌进行实际检测结果；
图8为用图1所示的基因芯片对嗜麦芽窄食单胞菌进行实际检测结果。
图中，1-10通道和“+”、“-”分别代表的是图中右侧曲线为质控线，用于质控芯片和仪器，左侧曲线为检测指标的扩增线；横坐标单位是分钟(min)纵坐标没有单位；1-10通道和“+”、“-”含义如下：
1为阳性质控，2为阴性质控，3为耐甲氧西林葡萄球菌，4为金黄色葡萄球菌，5为大肠埃希氏菌，6为肺炎克雷伯菌，7为铜绿假单胞菌，8为鲍曼不动杆菌，9为嗜麦芽窄食单胞菌，10为阴性质控；“+”代表相应指标检出“-”代表相应指标未检出。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明进行说明，以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌检测过程通过基因芯片来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一
1引物制备
通过大量实验筛选出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特异性基因的核酸片段设计出核酸扩增引物并合成，得到如下的引物：
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
序列编号1
正向外引物 F3 TTATGTATCAGGTACTTAT
序列编号2
反向外引物 B3 TTTTGTTATTTAACCCAATCATTTA
序列编号3
正向内引物 FIP
ATTCTTCGTTACTCATTACATACATGTGAATTATTATAACTTGTAATAAC
序列编号4
反向内引物 BIP
AACCGAAGATAAAAAAGAACCTCTGAATATTTTTTGAGTTGAACCTGGTG
序列编号5
正向环引物 LF AATGGATAGACGTCATATGAAGGT
序列编号6
反向环引物 LB CTCAACAAGTTCCAGATTACAACTT
金黄色葡萄球菌
序列编号7
正向外引物 F3 GTTACTTTACAGATATAATG
序列编号8
反向外引物 B3 GAAAAAGTGTACGAGTTCTTGA
序列编号9
正向内引物 FIP GTTTCATAACCTTCATAAATATTTCCATACAGTCATTTCACTAA
序列编号10
反向内引物 BIP GAGGTCATTTAATATTTATTACTTCGATCACTGGACCTAG
序列编号11
正向环引物 LF AACTCATAGTGTACAACA
序列编号12
反向环引物 LB GTACCTGTTATGAAAGTGTTCA
大肠埃希菌
序列编号13
正向外引物 F3 GTAATCGTGGTGATTGATGA
序列编号14
反向外引物 B3 GGTTCGTTGTAAATACTCCA
序列编号15
正向内引物 FIP TCTTTCGTATTGTTTACCTACTTATGTCGTATTTAACCTC
序列编号16
反向内引物 BIP TACATAGAAGAGTAAGTCAACGTTTTGGTTTTTGTCACTATATATC
序列编号17
正向环引物 LF TTCGAAACCAATTACTAAAGA
序列编号18
反向环引物 LB TATAACTTACAGTAGATT
肺炎克雷伯菌
序列编号19
正向外引物 F3 GTCTCTACAATAGGAAT
序列编号20
反向外引物 B3 ATGAGACCTACTGGGACA
序列编号21
正向内引物 FIP AACCTAAATGTTAAAATAAGTCAGGGAGACGACCGT
序列编号22
反向内引物 BIP AGTTAATAAAGTAGGAGTACTTTATTTTGTTCTAGTATGGAATCGG
序列编号23
正向环引物 LF CGATGACATAATAAATAACCG
序列编号24
反向环引物 LB TATATATACCACTACCA
铜绿假单胞菌
序列编号25
正向外引物 F3 TGTTATGGAAATGTCCACCTT
序列编号26
反向外引物 B3 TCTTATGATATTTCTGAG
序列编号27
正向内引物 FIP GTACAGAACATAATACAGAGGAACACGATGAACAACGT
序列编号28
反向内引物 BIP ATATCGTCTGACCTATACCCTTCGTCATACTTTAGAT
序列编号29
正向环引物 LF CCAGATAAGAGAATTTCAGA
序列编号30
反向环引物 LB ATATTATCGTTATCAGG
鲍曼不动杆菌
序列编号31
正向外引物 F3 TGTTACAATTAACTTCTTATA
序列编号32
反向外引物 B3 CTTGTAATATCGTTATAGTAGTT
序列编号33
正向内引物 FIP
AGTGAATTCGGTTATCGTAATATCGAATAATAAAAAAAAATTAGTCAC
序列编号34
反向内引物 BIP AATGATATGTATCAAAATATAGAGTATTAACTCATGTTAGATGG
序列编号35
正向环引物 LF TATAAGAGAGGTCTAC
序列编号36
反向环引物 LB CCGTTAAAAATTATAAGG
嗜麦芽窄食单胞菌
序列编号37
正向外引物 F3 GTATAATATTGGAGGTTCCT
序列编号38
反向外引物 B3 ATGAAGTAGTACAGATG
序列编号39
正向内引物 FIP TATACAAGATATCAATAGTGTAACCTATGATCAGGGA
序列编号40
反向内引物 BIP ACAACTAGTCGTTCACCGGTACGAGTAAATTACAAACTAGATG
序列编号41
正向环引物 LF GATTACGGGGTAGGAA
序列编号42
反向环引物 LB ACCCGATGACAAGGGTAT
2基因芯片制备
参照图1所示的基因芯片排布示意图，芯片是由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌所对应七组引物，PC(阳性质控品)、NC(阴性质控品)组成的阵列。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。
金黄色葡萄球菌，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。
大肠埃希菌，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。
肺炎克雷伯，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。
铜绿假单胞菌，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。
鲍曼不动杆菌，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。
嗜麦芽窄食单胞菌，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 0.1％琼脂糖混合，点在相应位置，自然晾干。
阳性质控品，取0.159μL1×105酵母DNA，0.545μl0.1％琼脂糖和0.296μl引物混合之后，点在相应位置，自然晾干。
3耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌基因组。
4上述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌七种菌株基因DNA提取：
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌取1mL菌液加入1.5mL离心管中，12000rpm，离心2min后弃上清，加入600μL超纯水，再次12000rpm，离心2min后弃上清对菌液进行清洗，在离心管中加入200μL超纯水充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴加热5min，12000rpm离心2min取上清。
5基于核酸扩增法的基因扩增
取扩增反应液28μL，加入35μL待检模板及7μL水，形成如下表总体积为70μL的反应体系，反应体系如下：(反应总体积为70μL)
表3反应体系中各组分及浓度
在温度为65℃的iChip-400上反应50分钟。
6扩增产物的检测
与阴性对照孔比较，检测孔在iChip-400设备上有S形曲线判定为阳性。在iChip-400设备上未见S形曲线为阴性。
实验结果为：
图2为用图1所示的基因芯片对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行实际检测结果；
图3为用图1所示的基因芯片对金黄色葡萄球菌进行实际检测结果；
图4为用图1所示的基因芯片对大肠埃希菌进行实际检测结果；
图5为用图1所示的基因芯片对肺炎克雷伯菌进行实际检测结果；
图6为用图1所示的基因芯片对铜绿假单胞菌进行实际检测结果；
图7为用图1所示的基因芯片对鲍曼不动杆菌进行实际检测结果；
图8为用图1所示的基因芯片对嗜麦芽窄食单胞菌进行实际检测结果；
通过上述结果可知，本发明提供的检测试剂和检测方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，可解决呼吸道病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携等诸多优点。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超过权利要求所记载的技术方案前提下，还有其他变体或改型。
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ttatgtatca ggtacttat 19
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ttttgttatt taacccaatc attta 25
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Claims (8)

1.一种呼吸道微流控芯片快速检测试剂盒，所述试剂盒为对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌进行检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌特异性基因为模板设计的特异性引物组、检测芯片、核酸扩增反应液、阳性模板。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌各6个引物组成。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物具体为：
所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测用引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 TTATGTATCAGGTACTTAT
反向外引物 B3 TTTTGTTATTTAACCCAATCATTTA
正向内引物 FIP
ATTCTTCGTTACTCATTACATACATGTGAATTATTATAACTTGTAATAAC
反向内引物 BIP
AACCGAAGATAAAAAAGAACCTCTGAATATTTTTTGAGTTGAACCTGGTG
正向环引物 LF AATGGATAGACGTCATATGAAGGT
反向环引物 LB CTCAACAAGTTCCAGATTACAACTT
可以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因特异性序列；
所述金黄色葡萄球菌检测用引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 GTTACTTTACAGATATAATG
反向外引物 B3 GAAAAAGTGTACGAGTTCTTGA
正向内引物 FIP GTTTCATAACCTTCATAAATATTTCCATACAGTCATTTCACTAA反向内引物 BIPGAGGTCATTTAATATTTATTACTTCGATCACTGGACCTAG
正向环引物 LF AACTCATAGTGTACAACA
反向环引物 LB GTACCTGTTATGAAAGTGTTCA
可以扩增金黄色葡萄球菌基因特异性序列；
所述大肠埃希菌检测用引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 GTAATCGTGGTGATTGATGA
反向外引物 B3 GGTTCGTTGTAAATACTCCA
正向内引物 FIP TCTTTCGTATTGTTTACCTACTTATGTCGTATTTAACCTC
反向内引物 BIP
TACATAGAAGAGTAAGTCAACGTTTTGGTTTTTGTCACTATATATC
正向环引物 LF TTCGAAACCAATTACTAAAGA
反向环引物 LB TATAACTTACAGTAGATT
可以扩增大肠埃希菌基因特异性序列；
所述肺炎克雷伯菌检测用引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 GTCTCTACAATAGGAAT
反向外引物 B3 ATGAGACCTACTGGGACA
正向内引物 FIP AACCTAAATGTTAAAATAAGTCAGGGAGACGACCGT
反向内引物 BIP
AGTTAATAAAGTAGGAGTACTTTATTTTGTTCTAGTATGGAATCGG
正向环引物 LF CGATGACATAATAAATAACCG
反向环引物 LB TATATATACCACTACCA
可以扩增肺炎克雷伯菌基因特异性序列；
所述铜绿假单胞菌检测用引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 TGTTATGGAAATGTCCACCTT
反向外引物 B3 TCTTATGATATTTCTGAG
正向内引物 FIP GTACAGAACATAATACAGAGGAACACGATGAACAACGT
反向内引物 BIP ATATCGTCTGACCTATACCCTTCGTCATACTTTAGAT
正向环引物 LF CCAGATAAGAGAATTTCAGA
反向环引物 LB ATATTATCGTTATCAGG
可以扩增铜绿假单胞菌基因特异性序列；
所述鲍曼不动杆菌伯检测用引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 TGTTACAATTAACTTCTTATA
反向外引物 B3 CTTGTAATATCGTTATAGTAGTT
正向内引物 FIP
AGTGAATTCGGTTATCGTAATATCGAATAATAAAAAAAAATTAGTCAC
反向内引物 BIP
AATGATATGTATCAAAATATAGAGTATTAACTCATGTTAGATGG
正向环引物 LF TATAAGAGAGGTCTAC
反向环引物 LB CCGTTAAAAATTATAAGG
可以扩增鲍曼不动杆菌基因特异性序列；
所述嗜麦芽窄食单胞菌伯检测用引物组由下列引物组成：
正向外引物 F3 GTATAATATTGGAGGTTCCT
反向外引物 B3 ATGAAGTAGTACAGATG
正向内引物 FIP TATACAAGATATCAATAGTGTAACCTATGATCAGGGA
反向内引物 BIP ACAACTAGTCGTTCACCGGTACGAGTAAATTACAAACTAGATG正向环引物 LFGATTACGGGGTAGGAA
反向环引物 LB ACCCGATGACAAGGGTAT
可以扩增嗜麦芽窄食单胞菌基因特异性序列。
4.如权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为核酸扩增专用引物。
5.一种呼吸道微流控芯片快速检测芯片，其特征在于，所述检测芯片为微流控芯片，并预先固定了权利要求2中所述引物组，并设置阴性质控和阳性质控。
6.权利要求5所述的检测芯片，其特征在于，所述阴性质控使用TE作为模板扩增，阳性质控使用酵母DNA片段为模板扩增。
7.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增反应液包括如下试剂：
8.一种使用权利要求1-7任一项所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于痰液样品标本；取1mL待检菌液加入1.5mL离心管中，12000rpm离心2min后，弃上清，加入600μL超纯水，12000rpm离心2min后，弃上清对菌液进行清洗，在离心管中加入200ul超纯水充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板。
2)分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 0.1％琼脂糖混合，将引物固定在芯片上。
3)阳性质控品，取0.545μl0.1％琼脂糖，0.159μL1×105酵母DNA和0.296μl引物混合之后，点在相应位置。
4)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌的核酸等温扩增
取扩增反应液，加入待检模板，形成如下的反应体系，振荡混匀后离心，将离心后的液体注入芯片，将芯片放入iChip-400四通道芯片恒温扩增核酸分析仪中，温度65℃进行反应，时间50min，反应体系组分及浓度如下，反应总体积70ul，
4)核酸等温扩增反应产物的检测；
检测：与阴性质控孔比较，检测孔在iChip-400四通道芯片恒温扩增核酸分析仪设备上有S形曲线判定为阳性。在iChip-400四通道芯片恒温扩增核酸分析仪设备上未见S形曲线为阴性。
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