CN110578014A - 一种用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法，其包括微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片反应池，所述芯片反应池内包被固定有引物组，所述引物组包含近平滑念珠菌的至少两个不同基因位点的特异性引物组。本发明提供的检测试剂盒和检测方法可检出的近平滑念珠菌具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，同时，还有试剂消耗量小，污染小等优点，该实验全程为闭盖式反应，减少了污染的可能性，成本低、且便携。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法。
背景技术
引起人类疾病的至少有17种念珠菌，其中白色念珠菌引起的感染最常见，但是近年来，随着器官移植，免疫抑制剂、广谱抗生素以及糖皮质激素的应用日益增多，临床常见念珠菌菌谱已经发生了变化，近平滑念珠菌等非白念珠菌感染越来越多见。近平滑念珠菌在自然界呈现广泛分布，不仅在植物、土壤、海水中可以分离到，还可在健康的人和其他哺乳动物的黏膜表面、皮肤以及指甲中发现。在医院环境中，近平滑念珠菌是一种比较独特的念珠菌属的物种，身体皮肤表面是近平滑念珠菌做主要的分离部位。这可能也是近平滑念珠菌容易机会性自身感染的原因，同时，借由医疗相关人员的手部皮肤接触，近平滑念珠菌也可进行院内局部传播。它会导致免疫低下的住院患者出现高感染率和死亡率。常见病症包括肺部念珠菌感染，泌尿系念珠菌感染，腹腔念珠菌感染和念珠菌血症等，特别是导管相关念珠菌血症近平滑念珠菌占有重要地位。临床常规的血液等生化指标分析仅能初步判断病因，无法确定病原菌的种属。
目前临床上对病原菌鉴定的方法主要是培养法。其主要步骤取样、培养、鉴定。培养法本身存在较多缺陷，不能满足临床需要。首先培养法检测耗时长，培养时间与所感染的微生物种类有关，至少用时2-3天，真菌更长，当临床出现急性病症时，培养法无法适用；其次该方法准确性低，尤其是批量鉴定时，样品之间很容易交叉污染；再次受国内实验室安全防护条件的限制，实验室工作人员在分离培养病原菌时存在着高风险被感染的可能；最后培养法对实验条件要求较高，需要的培养基种类较多，乡镇医院、社区医疗单位和户外等均无法使用细菌培养的检测方法，很容易对病人造成贻误。
对于普通PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术鉴定病原微生物的方法，因其检测基因位点单一，而病原菌的基因有多态性和可变异性，在检测准确性方面有一定的弊端。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法，同时检测近平滑念珠菌的多个基因位点，检测迅速。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒，其包括微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片反应池，所述芯片反应池内包被固定有引物组，所述引物组包含近平滑念珠菌的至少两个不同基因位点的特异性引物组。其中，引物组的引物与所述靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链互补。
采用本发明的技术方案，基因位点的检测通过包被固定在芯片反应池中的引物组来实现，本发明的技术方案结合了核酸扩增技术和微流控芯片技术，同时检测近平滑念珠菌的多个基因位点，特异性好，灵敏度高，操作简单，检测迅速。
作为本发明的进一步改进，所述微流控芯片内设有对照组，所述微流控芯片包括进样孔、反应孔和出气孔。
作为本发明的进一步改进，所述对照组包括扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。所述的扩增对照使用与近平滑念珠菌无关的DNA片段为模板扩增、空白对照无引物组、提取对照使用提取质控菌核酸为模板扩增。设置了内对照，可有效质控产品使用的整个过程。
作为本发明的进一步改进，所述近平滑念珠菌的至少两个不同基因位点包括cytb基因、ITS基因、ERG11基因中的至少两个。所述引物组包括近平滑念珠菌cytb基因、ITS基因、ERG11基因位点检测用引物组，这些引物组能扩增靶基因特异碱基序列，所述靶基因分别为近平滑念珠菌cytb基因、ITS基因、ERG11基因，所述引物与所述靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链互补。所述各基因位点的引物组均不少于4条引物。
作为本发明的进一步改进，所述引物组包括cytb基因位点引物组、ITS基因位点引物组、ERG11基因位点引物组；
所述cytb基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.1～5的引物，所述ITS基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.6～11的引物，所述ERG11基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.12～16的引物。
作为本发明的进一步改进，试剂盒包括核酸扩增反应液，所述核酸扩增反应液包括10×Thermomal Buffer，MgSO4 2-10mmol/L，BSA 0.2-2mg/ml，dATP 0.2-3mmol/L，dGTP0.2-3mmol/L，dCTP 0.2-1.5mmol/L，dTTP 0.2-1.5mmol/L，Betaine 0.2-1mol/L，EvaGreen0.2-2×，Bst polymerase0.05-2U/μl。
本发明还公开了一种用于近平滑念珠菌核酸检测的检测方法，包括以下步骤：
步骤S1，样本处理和模板提取，得到待检模板；
步骤S2，将引物组中的单引物进行溶解、稀释并混合得到混合后的引物组，将混合后的引物组固定在微流控芯片的芯片反应池内；
步骤S3，将扩增对照DNA和引物混合之后，固定在芯片反应池内；
步骤S4，核酸扩增，取扩增反应液，加入待检模板；
步骤S5，振荡混匀后离心，将离心后的液体注入微流控芯片内，将微流控芯片放入核酸扩增分析仪中进行扩增；
步骤S6，在核酸扩增分析仪下进行核酸扩增反应产物的检测。根据显色反应，与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线为阴性。
其中，扩增包括恒温扩增和变温扩增。
采用次技术方案，通过针对上述一种病原体的多个基因位点或多个病原体的多个基因位点设计引物，并利用核酸扩增技术，以微流控芯片为载体，进行扩增，并根据显色反应进行结果判读，方法简单，检验快速。
作为本发明的进一步改进，所述样本包括咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹、血液、脑脊液、尿液、脓液、人体组织。
作为本发明的进一步改进，所述模板提取为在芯片外进行手动提取或将样本直接注入微流控芯片进行自动提取。
作为本发明的进一步改进，所述手动提取包括：取待检菌液和灭活的提取质控菌加入离心管中，离心后，弃上清，加入清洗液清洗一次，再次离心后，弃上清，在离心管中加入提取液混匀后加至装有玻璃珠的离心管中进行震荡，然后再恒温金属浴100℃加热5min，离心，取上清做待检模板。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，本发明通过提供3种针对近平滑念珠菌不同基因位点设计的引物组，固定有上述引物组微流控芯片，及包含有上述扩增反应液的试剂盒对样本中近平滑念珠菌的cytb基因、ITS基因、ERG11基因位点进行检测。本发明提供的检测试剂盒和检测方法可检出的近平滑念珠菌具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，同时，还有试剂消耗量小，污染小等优点，该实验全程为闭盖式反应，减少了污染的可能性，成本低、且便携。
附图说明
图1为本发明的微流控芯片的排布示意图。
图2为本发明实施例1中对近平滑念珠菌样本进行检测的结果图，3个不同基因位点都得到检出。
图3为本发明实施例1对部分位点突变的近平滑念株菌样本1进行检测的结果图，ITS基因和cytb基因得以检出。
图4为本发明实施例1对部分位点突变的近平滑念株菌样本2进行检测的结果图，ITS基因得以检出。
上述附图2～图4中，图中横坐标单位是分钟(min)，纵坐标没有单位，“+”表示相应指标检出，“-”表示相应指标未检出。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
以克柔念株菌cytb基因、ITS基因、ERG11基因位点检测来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。
1引物制备
通过筛选出近平滑念珠菌cytb基因、ITS基因、ERG11基因片段设计出核酸扩增引物并合成，得到如下的引物：
近平滑念珠菌cytb基因
序列编号1
正向外引物F3 AGAAACTAGCTCCATTAGCAT
序列编号2
反向外引物B3 TCTTATTGATAGTCCACAACCTA
序列编号3
正向内引物FIP GCCTTTAACTCTGTTGAACACATCGGATATAACGAATTAATCAACCAGC
序列编号4
反向内引物BIP GCATAGCTAGGAAAATACCACTAGCCTATCAACTATTGATGAA ATGTT GG
序列编号5
反向环引物LB AATTTGAATAACTAAACATAAACCTAATAAA
近平滑念珠菌ITS基因
序列编号6
正向外引物F3 TTTCAACAACGGATCTCTTG
序列编号7
反向外引物B3 CTTTCAAGCAAACCCAGC
序列编号8
正向内引物FIP TTCGATGATTCACGAATATCTGCAA-GTTCTCGCATCGATGAAGA
序列编号9
反向内引物BIP TGGTATTCCAAAGGGCATGC-GTATCGCTCAACACCAAAC
序列编号10
正向环引物LF CATATTACTTATCGCATTTCGCTGC
序列编号11
反向环引物LB GAGCGTCATTTCTCCCTCAAAC
近平滑念珠菌ERG11基因
序列编号12
正向外引物F3 TTTACCAAATCTAAGGTGTTCA
序列编号13
反向外引物B3 TTGATTGGGGTGAATCCTT
序列编号14
正向内引物FIP GCAGTGAAGATGGTTATTTCTGGTT-GAAGAAACAGAAAAGTGGCG
序列编号15
反向内引物BIP TCCTTATTAGGAGAAGCAATGAGGACTAAATCAGCATACAATTGAGC
序列编号16
正向环引物LF GTGATTGCAATACATCAACAA
2、微流控芯片制备
参照图1所示的基因芯片排布示意图，芯片反应池内包被固定有近平滑念珠菌cytb基因引物组、近平滑念珠菌ITS基因引物组、近平滑念珠菌ERG11基因引物组、扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。
近平滑念珠菌cytb基因，分别取24μL内引物FIP/BIP(序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示)，3μL外引物F3/B(序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，10μL环引物LB(序列如SEQ ID NO.5所示)三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
近平滑念珠菌ITS基因，分别取24μL内引物FIP/BIP(序列如SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示)，3μL外引物F3/B(序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示)，10μL环引物LF/LB(序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示)三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
近平滑念珠菌ERG11基因，分别取24μL内引物FIP/BIP(序列如SEQ ID NO.14和SEQID NO.15所示)，3μL外引物F3/B(序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示)，10μL环引物LF(序列如SEQ ID NO.16所示)三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
提取对照，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
扩增对照，取0.3μL混合引物和0.2μL琼脂糖溶液及扩增对照DNA0.5μL混合，点在相应位置，自然晾干。
3、样品处理和模板提取，以痰液样本为例；取1mL待检菌液和50μL灭活的提取质控菌加入1.5mL离心管中，12000rpm离心2min后，弃上清，加入600μL清洗液清洗一次，12000rpm离心2min后，弃上清，在离心管中加入200ul提取液充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板。
4核酸扩增
取扩增反应液55μL，加入15μL待检模板，充分混匀后注入芯片。所述扩增反应液中包括如下试剂：
| 序号 | 试剂组分 | 终浓度 |
| 1 | 10×Thermomal Buffer | 1× |
| 2 | MgSO<sub>4</sub> | 2-10mmol/L |
| 3 | BSA | 0.2-2mg/ml |
| 4 | dATP | 0.2-3mmol/L |
| 5 | dGTP | 0.2-3mmol/L |
| 6 | dCTP | 0.2-1.5mmol/L |
| 7 | dTTP | 0.2-1.5mmol/L |
| 8 | Betaine | 0.2-1mol/L |
| 9 | EvaGreen | 0.2-2× |
| 10 | Bst polymerase | 0.05-2U/μl |
所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA聚合酶。
在温度为65℃的核酸扩增分析仪上反应50min。
5扩增产物的检测
与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪设备上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线判定为阴性。
实验结果为：
图2为对近平滑念株菌样本进行检测，cytb，ITS，ERG11基因位点均得到有效扩增，近平滑念珠菌得以有效检出。图3为对部分位点突变的近平滑念株菌样本1进行检测，ITS基因和cytb基因得到有效扩增，ERG11基因位点发生突变未得到扩增，近平滑念珠菌得以有效检出，检测结果不受个别基因位点突变影响。图4为对部分位点突变的近平滑念株菌样本2进行检测，ITS基因得到有效扩增，cytb基因和ERG11基因位点发生突变未得到扩增，近平滑念珠菌仍得以有效检出，检测结果不受部分基因位点突变影响。上述结果与实际相符。
通过上述结果可知，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可在同一张芯片内，同时检测近平滑念珠菌的多个基因位点，当某一基因发生突变时，则该基因位点检测结果为阴性；但是当该菌株的任一基因被检出，则说明近平滑念珠菌呈阳性，因此提高了检测的灵敏度和特异性。另外，可解决近平滑念珠菌的现场快速检测的难题，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携带等诸多优点。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国医科大学附属盛京医院
<120> 一种用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaaactagc tccattagca t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcttattgat agtccacaac cta 23
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcctttaact ctgttgaaca catcggatat aacgaattaa tcaaccagc 49
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcatagctag gaaaatacca ctagcctatc aactattgat gaaatgttgg 50
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatttgaata actaaacata aacctaataa a 31
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttcaacaac ggatctcttg 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctttcaagca aacccagc 18
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttcgatgatt cacgaatatc tgcaagttct cgcatcgatg aaga 44
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggtattcca aagggcatgc gtatcgctca acaccaaac 39
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catattactt atcgcatttc gctgc 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagcgtcatt tctccctcaa ac 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tttaccaaat ctaaggtgtt ca 22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgattgggg tgaatcctt 19
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcagtgaaga tggttatttc tggttgaaga aacagaaaag tggcg 45
<210> 15
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tccttattag gagaagcaat gaggactaaa tcagcataca attgagc 47
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtgattgcaa tacatcaaca a 21
Claims (10)
1.一种用于近平滑念珠菌核酸检测试剂盒，其特征在于：其包括微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片反应池，所述芯片反应池内包被固定有引物组，所述引物组包含近平滑念珠菌的至少两个不同基因位点的特异性引物组。
2.根据权利要求1所述的用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述微流控芯片内设有对照组，所述微流控芯片包括进样孔、反应孔和出气孔。
3.根据权利要求2所述的用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述对照组包括扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。
4.根据权利要求3所述的用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述近平滑念珠菌的至少两个不同基因位点包括cytb基因、ITS基因、ERG11基因中的至少两个。
5.根据权利要求4所述的用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述引物组包括cytb基因位点引物组、ITS基因位点引物组、ERG11基因位点引物组；
所述cytb基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.1~5的引物，所述ITS基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.6~11的引物，所述ERG11基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.12~16的引物。
6.根据权利要求4所述的用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：其包括核酸扩增反应液，所述核酸扩增反应液包括10×Thermomal Buffer，MgSO4 2-10mmol/L，BSA0.2-2mg/ml，dATP 0.2-3mmol/L，dGTP 0.2-3mmol/L，dCTP 0.2-1.5mmol/L，dTTP 0.2-1.5mmol/L，Betaine 0.2-1mol/L，EvaGreen 0.2-2×，Bst polymerase 0.05-2U/μl。
7.一种用于近平滑念珠菌核酸检测的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1，样本处理和模板提取，得到待检模板；
步骤S2，将引物组中的单引物进行溶解、稀释并混合得到混合后的引物组，将混合后的引物组固定在微流控芯片的芯片反应池内；
步骤S3，将扩增对照DNA和引物混合之后，固定在芯片反应池内；
步骤S4，核酸扩增，取扩增反应液，加入待检模板；
步骤S5，振荡混匀后离心，将离心后的液体注入微流控芯片内，将微流控芯片放入核酸扩增分析仪中进行扩增；
步骤S6，在核酸扩增分析仪下进行核酸扩增反应产物的检测。
8.根据权利要求7所述的一种用于近平滑念珠菌核酸检测的检测方法，其特征在于：所述样本包括咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹、血液、脑脊液、尿液、脓液、人体组织。
9.根据权利要求7所述的一种用于近平滑念珠菌核酸检测的检测方法，其特征在于：所述模板提取为在芯片外进行手动提取或将样本直接注入微流控芯片进行自动提取。
10.根据权利要求9所述的一种用于近平滑念珠菌核酸检测的检测方法，其特征在于：所述手动提取包括：取待检菌液和灭活的提取质控菌加入离心管中，离心后，弃上清，加入清洗液清洗一次，再次离心后，弃上清，在离心管中加入提取液混匀后加至装有玻璃珠的离心管中进行震荡，然后再恒温金属浴100℃加热5min，离心，取上清做待检模板。
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|---|---|---|---|---|
| CN113151555A (zh) * | 2021-04-26 | 2021-07-23 | 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江) | 一种用于近平滑念珠菌检测的探针、方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101555526A (zh) * | 2009-05-14 | 2009-10-14 | 浙江大学 | 用于荧光定量pcr法检测肠道近平滑念珠菌的试剂盒 |
| CN107119140A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-09-01 | 北京百康芯生物科技有限公司 | 呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒 |
-
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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