CN110079622A - 基于lamp法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，属于分子检测技术领域。本发明包括用于环介导等温扩增(LAMP)的外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，其序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4所示，以及用于扩增反应的缓冲液，dNTP和酶等。本发明的特点在于引物特异性好、准确性高，不需要特殊仪器，操作简便，可以用于肺炎克雷伯菌的快速检测。

Description

基于LAMP法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，尤其是涉及一种环介导等温扩增(LAMP)技术结合量子点发光来检测肺炎克雷伯菌。
背景技术：
肺炎克雷伯菌是肠杆菌科，克雷伯菌属的成员，为一种重要的革兰阴性、人兽共患的条件致病菌。该菌主要引起人和多种动物的肺炎、呼吸道感染、肠炎、肝脓肿、腹膜炎、脑膜炎、腹泻，甚至败血症。多重耐药、强致病性肺炎克雷伯菌菌株的出现给养殖业造成了巨大的经济损失，同时也给人类食品安全造成了严重威胁。因此，建立早期快速检测方法对肺炎克雷伯菌感染的预防和控制具有十分重要的意义。
传统的病原菌检验方法主要通过分离培养的方法，根据病原菌的生理生化特征进行鉴别，但是分离培养需要特殊的实验室设备和人员，耗时长；另一种常用的血清抗体检测方法，也需要血清中抗体达到一定的水平，难以做到初期的快速诊断。PCR技术是近年来常用的肺炎克雷伯菌快速检测方法之一，如专利CN 104946762A公开了一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，并使用荧光定量PCR方法进行检测，这类方法虽然灵敏性和特异性高，但是月存在操作繁琐，需要特殊的热循环仪，如PCR仪或荧光定量PCR仪等，效率较低。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展的一种新的核酸扩增技术，只需要在60-65℃恒定温度条件下反应60分钟就可以完成扩增反应，不需要热循环仪，具有特异性强、操作简便、灵敏度高等优点。
对于LAMP扩增产物的检测，主要有以下方法：1.浊度法，通过扩增过程产生的焦磷酸根与反应体系中的镁离子结合生成沉淀，表明体系中出现了扩增反应，其缺点是白色沉淀引起的浊度通常较弱，不易被观察到；2.颜色变化，如在反应体系中加入羟基萘酚蓝(HNB)，反应生成的焦磷酸根离子与HNB竞争性地与镁离子结合，使HNB从紫罗兰色变成天蓝色来判别反应的发生。本发明采用羟基萘酚蓝染色的方法，可以不开盖，直接从反应体系颜色的变化判断结果。
本发明具有特异性好、准确性高，不需要特殊仪器，操作简便等特点，可以用于肺炎克雷伯菌的快速检测。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的试剂盒。
为达到上述目的，本发明首先提供了四条特异的LAMP引物，引物序列如下：
外引物F3：5’GTTTCTGTACAGACGACGGA 3’；
外引物B3：5’CGAAGACGAACACAGCTT 3’；
内引物FIP：5’GGAACAAACACCACGAGGAACAGTGTTGAGGTGTATCGTC 3’；
内引物BIP：5’TTGCGTAATGATCTGCGCTGAGCGGAGTGGCGTGAT 3’；
本发明提供的LAMP扩增反应体系，当为30μL反应体系时，其优选配置为：
本发明提供的LAMP扩增反应，优选的反应条件为65℃，扩增60分钟。
本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，反应管变成绿色为阳性，保持淡橙色的为阴性。两种对照对于结果判读起决定性作用：
有效扩增：NTC(-)和POS(+)
无效扩增：NTC(+)和POS(+)提示体系污染
无效扩增：NTC(-)和POS(-)提示体系错误或者试剂失效。
本发明提供的试剂盒，还包括LAMP反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为肺炎克雷伯氏菌标准阳性模板。
本发明提供了用于检测肺炎克雷伯氏菌的rcsA基因保守区域靶序列，以及以该序列为基础设计的引物，具有较强的特异性。利用该引物，通过LAMP恒温扩增，可直接通过观测产物颜色变化判断结果，具有特异性高、快速灵敏、检测周期短、不需要特殊的仪器等，可作为检测临床标本的手段。
具体实施方式：
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1.
在无菌EP管中按下表加入各反应试剂，其中阳性对照组加入2.5μL肺炎克雷伯氏菌DNA，阴性对照组中以无菌水替代。
阴性对照组/μL 阳性对照组/μL
肺炎克雷伯氏菌DNA 0 2.5
10xThermobol Buffer 2.5 2.5
MgSO<sub>4</sub>(100mM) 1.5 1.5
dNTP Mix(10μM) 3.5 3.5
FIP(10μM) 4.0 4.0
BIP(10μM) 4.0 4.0
F3(10μM) 0.5 0.5
B3(10μM) 0.5 0.5
BstDNA聚合酶(8U/μL) 1.0 1.0
羟基萘酚蓝(1.2mM) 2.0 2.0
无菌水 10.5 8.0
将上述反应管混匀后置于65℃水浴孵育60分钟，结果显示阴性对照呈紫罗兰色，阳性反应管呈天蓝色，表明本发明使用的引物可以特异地结合到肺炎克雷伯氏菌靶DNA上，产生阳性扩增结果。
实施例2.
在无菌肉汤琼脂培养基上分别培养肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌。分别挑取一个单克隆，用煮沸法提取DNA，按照下表加入各反应试剂：
将上述反应管混匀后置于65℃水浴孵育60分钟，结果肺炎克雷伯菌组反应管呈天蓝色，金黄色葡萄球菌组呈紫罗兰色，表明本发明使用的引物有很好的特异性和灵敏度，其它如金黄色葡萄球菌等不会产生阳性扩增结果，可用于肺炎克雷伯菌的快速诊断。

Claims (5)

1.一种基于LAMP法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述方法包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP，所述引物序列或其特异性片段：
外引物F3：
5’GTTTCTGTACAGACGACGGA 3’；
外引物B3：
5’CGAAGACGAACACAGCTT 3’；
内引物FIP：
5’GGAACAAACACCACGAGGAACAGTGTTGAGGTGTATCGTC 3’；
内引物BIP：
5’TTGCGTAATGATCTGCGCTGAGCGGAGTGGCGTGAT 3’。
2.如权利要求1所述检测肺炎克雷伯菌的方法试剂盒，其特征在于使用LAMP法扩增目的基因片段进行检测，LAMP反应体系为：
。
3.如权利要求1所述检测肺炎克雷伯菌的方法试剂盒，其特征在于使用LAMP法扩增，反应温度为65℃，扩增时间为60分钟。
4.如权利要求1所述的检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于：引物F3、B3、FIP或BIP能特异性地与肺炎克雷伯菌靶基因特异性地结合，引导靶基因片段扩增。
5.如权利要求3中所述扩增反应，扩增结束后反应管变成绿色为阳性，保持淡橙色的为阴性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111500751A (zh) * 2020-04-10 2020-08-07 刘洋 快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法及试剂盒
CN116004862A (zh) * 2022-07-18 2023-04-25 国科宁波生命与健康产业研究院 一种检测肺炎克雷伯菌的cda引物组、试剂盒及其应用

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CN111500751A (zh) * 2020-04-10 2020-08-07 刘洋 快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法及试剂盒
CN111500751B (zh) * 2020-04-10 2023-10-27 刘洋 快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法及试剂盒
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