CN116121427B - 一种基于荧光rpa技术检测肠炎沙门氏菌的试剂盒及其应用 - Google Patents
一种基于荧光rpa技术检测肠炎沙门氏菌的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光RPA技术检测肠炎沙门氏菌的试剂盒及其应用。本申请所解决技术问题是如何提供一种适用于检测肠炎沙门氏菌的RPA引物和体系。可在芽孢杆菌属、伯克霍尔德菌属、布氏菌属、弗朗西斯菌属、沙门氏菌属、埃希氏菌属、弧菌属和葡萄球菌属干扰下准确鉴定出肠炎沙门氏菌。基因组最低检测限为1.21fg/μL，灵敏度能达到15fg/反应；而阳性质粒的最低检测限可达到0.4拷贝/μL，灵敏度为5.2拷贝/反应。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种基于荧光RPA技术检测肠炎沙门氏菌的试剂盒及其应用。
背景技术
肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)属泛嗜性沙门氏菌，能引起各种动物的胃肠炎和败血症，是一种常见的人兽共患致病菌。肠炎沙门氏菌主要是经食物传播，少数经水传播，感染动物后能在其肝脏、脾脏、肠道内大量定植，并向环境中排菌，引起人类的食物中毒。在我国，由沙门氏菌引起的食物中毒案例中约有70～80％是由肠炎沙门氏菌引起的，临床上多表现为败血症、肠热症、腹泻、恶心呕吐等症状。自上世纪80年代爆发于美国以来，肠炎沙门氏菌得到全世界广泛关注。在1981年的英国，肠炎沙门氏菌感染病例仅占沙门氏菌属感染病例的10％，而在1997年爆发之际，这个数字上升到了70％。近年来，有关肠炎沙门氏菌感染的报道越来越多，在肿脓性关节炎、肿胸、关节腔积液、脑膜炎等病症部位中都有检测到肠炎沙门氏菌的报道。因此，加强肠炎沙门氏菌的检测能力对于有效控制其对人类的感染十分重要。
目前，检测肠炎沙门氏菌的常用方法如分离培养病原菌，酶联免疫吸附测定(ELISA)，荧光定量PCR(qPCR)等方法，虽然可准确的检测到病原菌，但皆不适用于野外及现场检测。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是近年来新兴的一项核酸检测技术，因其快速、灵敏、仪器便于携带而得到广泛运用，目前已用于多种传染源的核酸检测，但检测肠炎沙门氏菌的RPA体系尚未建立。本研究应用实时荧光RPA技术为肠炎沙门氏菌的现场快速诊断和流行病调查提供一种全新的技术支持。
发明内容
本申请解决的技术问题是建立基于荧光RPA技术检测肠炎沙门氏菌检测体系。
为了解决上述问题，本申请提供了用于检测肠炎沙门氏菌的特异序列。
所述特异序列核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA。
为了解决上述问题，本申请还提供了用于检测肠炎沙门氏菌的组合物。
所述组合物包括名称分别为lygD-F3和lygD-R2的引物对和名称为lygD-P2的探针，所述lygD-F3是核苷酸序列为SEQ ID No.4的单链DNA分子，所述lygD-R2是核苷酸序列为SEQ ID No.7的单链DNA分子；所述lygD-P2的结构为SEQ ID No.12-四氢呋喃残基-SEQID No.13，SEQ ID No.12的第31位核苷酸T标记荧光基团，SEQ ID No.13的第2位核苷酸T标记淬灭基团，3’端进行阻断修饰。
上述引物组合物中，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LC RED640、LC RED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种，所述SEQ ID No.13的3’端连接C3-spacer。
所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。
为了解决上述问题，本申请还提供了鉴定或辅助鉴定肠炎沙门氏菌的产品，
所述产品包括下述任一种：
D1)含有上述组合物的体外核酸扩增试剂；
D2)含有上述组合物及探针或D1)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；
D3)含有上述引物组合物及探针、D1)所述体外核酸扩增试剂或D2)所述试剂盒的检测产品。
本申请中，所述体外核酸扩增技术可为聚合酶链式反应(PCR)、链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)和依赖核酸序列的扩增(NASBA)、滚环核酸扩增(RCA)、环介导等温扩增(lamp)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、依赖解旋酶的等温扩增技术(HDA)或Qβ复制技术。
本申请，以重组酶聚合酶扩增技术(RPA)为扩增手段进行特异性扩增。
上述的产品中，D1)中所述体外核酸扩增试剂还包括进行重组酶聚合酶扩增所需的其它试剂。
上文中，所述重组酶聚合酶扩增所需的其它试剂为荧光RPA扩增试剂盒(TwistAmpTMexo Kit)中的基础缓冲液(Primer Free Rehydration buffer)、基础反应单元(冻干微球)和醋酸镁(MgOAc)。
TwistAmpTM exo Kit(货号：TAEXO02KIT)为Twi stDx公司的荧光RPA扩增试剂盒。
上述的组合物在下述任一中的应用；
E1)在鉴定或辅助鉴定样本中是否含有肠炎沙门氏菌或制备鉴定或辅助鉴定样本中是否含有肠炎沙门氏菌的产品中的应用；
E2)在检测样本中是否含有肠炎沙门氏菌或制备检测样本中是否含有肠炎沙门氏菌的产品中的应用；
E3)在鉴别区分样本中肠炎沙门氏菌和其他病原菌或制备用于鉴别区分样本中肠炎沙门氏菌和其他病原菌的产品中的应用；
E4)在制备用于诊断或辅助诊断肠炎沙门氏菌引起的疾病的产品中的应用；
E5)在筛查肠炎沙门氏菌引起的疾病或制备筛查肠炎沙门氏菌引起的疾病的产品中的应用；
E6)在肠炎沙门氏菌防控中的应用。
上述的产品在下述任一中的应用；
F1)在鉴定或辅助鉴定样本中是否含有肠炎沙门氏菌或制备鉴定或辅助鉴定样本中是否含有肠炎沙门氏菌的产品中的应用；
F2)在检测样本中是否含有肠炎沙门氏菌或制备检测样本中是否含有肠炎沙门氏菌的产品中的应用；
F3)在鉴别区分样本中肠炎沙门氏菌和其他病原菌或制备用于鉴别区分样本中肠炎沙门氏菌和其他病原菌的产品中的应用；
F4)在制备用于诊断或辅助诊断肠炎沙门氏菌引起的疾病的产品中的应用；
F5)在筛查肠炎沙门氏菌引起的疾病或制备筛查肠炎沙门氏菌引起的疾病的产品中的应用；
F6)在肠炎沙门氏菌防控中的应用。
所述样本可为环境样品(如水)或作为食品的动物组织和/或器官等。
为了解决上述问题，本申请还提供了鉴定或辅助鉴定肠炎沙门氏菌的方法。
所述方法包括利用上述的组合物或上述的产品对上述的样品进行重组酶聚合酶扩增，根据荧光信号确定样品中是否存在肠炎沙门氏菌。
上文中，所述扩增体系为50μL。
反应体系中上游引物0.42μM、下游引物0.42μM、探针0.12μM、1×TwistAmpTM exoKit基础缓冲液、16.8mM醋酸镁。
上述的方法中，所述重组酶聚合酶扩增的反应条件为39℃，20min。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
有益效果
本研究应用实时荧光RPA技术为肠炎沙门氏菌的现场快速诊断和流行病调查提供一种全新的技术支持。
本申请筛选获得一段特异序列lygD为靶标序列，一对引物和探针。所述特异序列核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA；所述引物包括lygD-F3和lygD-R2，所述lygD-F3是核苷酸序列为SEQ ID No.4的单链DNA分子，所述lygD-R2是核苷酸序列为SEQ ID No.7的单链DNA分子；所述探针lygD-P2的结构为SEQ ID No.12-四氢呋喃残基-SEQ ID No.13，SEQ IDNo.12的第31位核苷酸T标记FAM荧光基团，SEQ ID No.13的第2位核苷酸T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行阻断修饰。在39℃温度下，反应20min。可通过荧光强度值判断样品中是否存在肠炎沙门氏菌。基因组最低检测限为1.21fg/μL，灵敏度能达到15fg/反应；而阳性质粒的最低检测限可达到0.4拷贝/μL，灵敏度为5.2拷贝/反应。本申请提供的引物和探针可以在实际情况中进行样本检测。
附图说明
图1为肠炎沙门氏菌实时荧光RPA探针和引物对的筛选；其中，A.探针筛选的荧光扩增曲线图，P1、P2分别为表1的lygD-P1、lygD-P2；B.扩增引物第1轮筛选，每组反应10min时荧光信号值热图，其中，F1、F2、F3和F4分别为表1的lygD-F1、lygD-F2、lygD-F3、lygD-F4，R1、R2、R3和R4分别为表1的lygD-R1、lygD-R2、lygD-R3和lygD-R4；C.扩增引物第2轮筛选，每组反应10min时荧光信号值热图。
图2为肠炎沙门氏菌基因组DNA实时荧光RPA检测技术灵敏度评价；其中，A.灵敏度评价的荧光扩增曲线图，图为5次重复实验中的一组代表；B.独立重复性检测图，n＝5次独立重复实验，t检验；ns，不显著；*，p<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图3为肠炎沙门氏菌pUC57-lygD实时荧光RPA检测技术灵敏度评价；其中，A.灵敏度评价的荧光扩增曲线图，图为4次重复实验中的一组代表；B.独立重复性检测图，n＝4次独立重复实验，t检验；ns，不显著；*，p<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，****，P<0.0001。
图4为肠炎沙门氏菌实时荧光RPA检测技术的特异性评价。n＝4次独立重复实验，平均值±S.E.M，t检验；ns，不显著；****，P<0.0001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用GraphPad Prism 7.04统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Paired t test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
实验材料
细菌菌株
实验中共涉及16种病原菌，肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthraci)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiamallei)、牛布氏菌(Brucellabovis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、羊布氏菌(Brucella melitensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，菌株均由军事医学研究院微生物流行病研究所提供。
将上述1mL热灭活供试细菌菌液采用DNA Mini Ki t基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)提取菌液全基因组DNA，用100μL AE缓冲液洗脱，采用Qub i t 4.0核酸浓度测量仪进行基因组核酸定量，备用。
1.2试剂与仪器
DNA Mini Ki t基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)；荧光RPA扩增试剂盒(Twi stAmpTM exo Ki t，Twi stDx公司)；阳性参考质粒、引物及探针(上海生工生物工程股份有限公司)；核酸快速扩增检测系统(Opt iGene，Geni e II)；Qub i t 4.0核酸浓度测量仪(美国Thermo Fi sher Sc i ent ifi c公司)。
实施例1肠炎沙门氏菌引物对和探针的设计和筛选
1.1靶标序列选定
发明人在前期研究基础上，经过多番筛选和比对，选定肠炎沙门氏菌的染色体特异序列lygD为靶标序列，可将肠炎沙门氏菌特异性检出。序列见表1。
1.2引物对和探针设计
利用常用的PCR设计软件Primer Premier 6，更改该软件的默认参数(对引物Tm值，长度和扩增片段长度等参数进行相应的更改)，利用该软件对靶序列设计RPA引物；按照荧光法RPA探针设计原则(英国TwistDX公司RPA试剂盒说明书)设计相应探针。引物和探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成，其序列及修饰见表1。
表1靶序列、引物与探针
注：其中idsp表示无碱基四氢呋喃THF残基，i6famdt表示该位置的核苷酸T被标记荧光基团FAM，ibhq1dt表示该位置的核苷酸T被标记淬灭基团BHQ1，3’端标记C3-spacer进行C3-spacer阻断修饰。也就是探针lygD-P2的结构为SEQ ID No.12-四氢呋喃残基-SEQIDNo.13，SEQ ID No.12的第31位核苷酸T标记FAM荧光基团，SEQ ID No.13的第2位核苷酸T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行阻断修饰。
1.3阳性参考质粒的构建
针对上述SEQ ID NO 1序列构建肠炎沙门氏菌检测靶标基因阳性参考质粒pUC57-lygD，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，合成质粒产品通过安全与质量检测。其中，载体质粒pUC57由上海生工合成，载体为商业化载体，货号B52201-0100。
阳性参考质粒pUC57-lygD的构建：
将核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO 1的片段替换pUC57载体(上海生工合成)的限制性核酸内切酶SmaI识别位点间的片段，保持pUC57载体的其它核苷酸序列不变，得到阳性参考质粒pUC57-lygD。
利用Qubit 4.0核酸定量仪测定重组阳性参考质粒pUC57-lygD的浓度，并换算出拷贝数浓度(拷贝数/μL)，对已知拷贝数浓度的质粒进行适当的倍比稀释后用于RPA检测体系灵敏度的分析。
1.4RPA引物对与探针的筛选
将上述制备的肠炎沙门氏菌基因组DNA按10倍梯度稀释至24.2fg/μL和2.42fg/μL，备用。
1.4.1以上述稀释的浓度为24.2fg/μL的肠炎沙门氏菌基因组DNA作为模板DNA，以lygD-F1/R1为引物，分别以lygD-P1或lygD-P2为探针，使用荧光RPA扩增试剂盒TwistAmpTMexo Kit(TwistDX)进行实时荧光RPA扩增，同时以去离子水为模板作为阴性对照。RPA扩增反应体系为50μL：将表1中RPA引物(10μM)各2.1μL，探针(10μM)0.6μL，TwistAmpTM exo Kit中基础缓冲液29.2μL，加入到基础反应单元，并充分混匀，在管盖上加入3μL的280mM醋酸镁(MgOAc)溶液，加入模板13μL充分混匀后，短暂离心后迅速放入GenieⅡ等温扩增荧光检测系统进行RPA反应。反应条件：39℃，20min。结果如图1A所示，探针lygD-P2荧光信号更强，效果更佳。
1.4.2以上述稀释的浓度为24.2fg/μL的肠炎沙门氏菌基因组DNA作为模板DNA，分别以lygD-F1/R1、lygD-F1/R2、lygD-F1/R3、lygD-F1/R4、lygD-F2/R1、lygD-F2/R2、lygD-F2/R3、lygD-F2/R4、lygD-F3/R1、lygD-F3/R2、lygD-F3/R3、lygD-F3/R4、lygD-F4/R1、lygD-F4/R2、lygD-F4/R3、lygD-F4/R4为引物，以lygD-P2为探针进行交叉筛选，按照1.4.1的反应体系和方法进行实时荧光RPA反应，结果如图1B所示，筛选出lygD-F3/R2，lygD-F4/R4，lygD-F2/R2，lygD-F4/R3共4个引物对。
再以上述稀释的浓度为2.42fg/μL的肠炎沙门氏菌基因组DNA作为模板，分别以上述筛选出的lygD-F3/R2，lygD-F4/R4，lygD-F2/R2，lygD-F4/R3为引物，以lygD-P2为探针，进行第二轮筛选，按照1.4.1的反应体系和方法进行实时荧光RPA反应，筛选出引物对lygD-F3/R2荧光信号更强，效果更佳，结果如图1C所示。
实施例2肠炎沙门氏菌荧光RPA检测方法的灵敏度及特异性评价
1.5基因组灵敏度评价
将筛选出的RPA引物(F3/R2)和探针(P2)，肠炎沙门氏菌基因组DNA为模板，按照1.4.1的体系进行实时荧光RPA灵敏度评价，按TwistAmpTM exo Kit Quick Guide方法进行RPA的荧光扩增反应，设置基因组DNA浓度梯度24.2fg/μL、2.42fg/μL、1.21fg/μL、0.6fg/μL共4个梯度，通过5次重复实验评价灵敏度。结果如图2A所示，为5次重复实验中的1组代表实验的荧光信号-时间扩增曲线图。其反应阳性检出时间为5-10分钟；图2B显示，对基因组DNA的最低检测限为1.21fg/μL，灵敏度能达到15fg/反应。且实验重复性好，说明该检测方法具有高灵敏度、高稳定性。
1.6阳性质粒灵敏度评价
为了验证实时荧光RPA反应的灵敏度，我们将构建的阳性参考质粒pUC57-lygD按照10倍倍比稀释，使其浓度为400拷贝/μL、40拷贝/μL、4拷贝/μL、0.4拷贝/μL和0.08拷贝/μL，以稀释的阳性参考质粒pUC57-lygD为模板进行实时荧光RPA反应，并且用去离子水做阴性对照，以lygD-F3/R2为引物，以P2为探针，反应体系和方法如1.4.1所述。反应结果如图3A所示：为4次重复实验中的1组代表实验的荧光信号-时间扩增曲线图。其反应阳性检出时间为5-10分钟(图3A)。为了检验灵敏度的稳定性，我们将实验重复了4次，最低检测限可达到0.4拷贝/μL，灵敏度为5.2拷贝/反应(图3B)。
1.7实时荧光RPA特异性评价
为评价肠炎沙门氏菌实时荧光RPA检测技术特异性，以肠炎沙门氏菌基因DNA组作为阳性模板DNA，并设置基因组DNA模板浓度为2.42fg/μL，以15种非肠炎沙门氏菌混合基因组DNA为特异性检验模板DNA来检测实时荧光RPA的特异性。15种非肠炎沙门氏菌混合基因组DNA是由炭疽芽孢杆菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、鼻疽伯克霍尔德菌、牛布氏菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、羊布氏菌、大肠杆菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、表皮葡萄球菌的提纯基因组组成的高浓度(终浓度不小于10pg/μL)混合基因组DNA。以去离子水做阴性对照(NTC)，以lygD-F3/R2为引物，以P2为探针，按照1.4.1的体系和方法进行实时荧光RPA反应。
结果如图所示：通过3次重复实验，只有肠炎沙门氏菌DNA结果呈阳性，非肠炎沙门氏菌混合基因组DNA和NTC均未扩增，说明引物探针及方法的特异性良好(图4)。
实施例3本发明的检测方法在模拟样本中的应用
1.8模拟样本的制备及实时荧光RPA检测
1.8.1模拟样本的制备
血样本是临床和实验室诊断肠炎沙门氏菌的常见样本，为了验证实时荧光RPA检测方法的实用性，请其他研究人员分别在100μL人全血样本中加入100μL梯度稀释的肠炎沙门氏菌和相同体积的PBS缓冲液，分别得到含有103、102和101CFU/mL浓度的肠炎沙门氏菌的全血模拟临床样本和空白对照组样本(BC组)，共计10组盲测样本并对其进行随机编号(具体如下表2所示)。
1.8.2实时荧光RPA检测模拟样本
由检测人员对上述10组人全血模拟临床样本使用DNA Mini Ki t(QIAGEN)提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，以lygD-F3/R2为引物，以P2为探针，按照1.4.1的体系和方法进行实时荧光RPA，同时将上述模板DNA，以qPCR-F/R为引物，以qPCR-P为探针，使用荧光定量PCR检测技术进行检测，反应条件为95℃30s、然后95℃5s和57℃40s共运行40个循环,将两种检测结果进行比较。
结果如表2所示，在人全血模拟样本中可检测到的肠炎沙门氏菌为103CFU/mL(编号3、6、7)和102CFU/mL(编号5、8)，与荧光定量PCR的阳性检出结果完全一致且灵敏性相当，与人全血基因组无交叉反应(BC组无阳性信号)，结果正确率高达100％，说明本研究建立的肠炎沙门氏菌RPA检测技术具有较好的特异性。
表2模拟样本实时荧光RPA和qPCR的检测结果
注：“+”表示检测到荧光信号，“—”表示未检测到荧光信号。
本研究开发了一种快速、便携、灵敏度高、特异性好的核酸等温扩增方法来检测肠炎沙门氏菌，有望成为临床样本的快速诊断辅助工具。该技术方法前景广阔，上游也可与核酸免提取技术结合，下游与侧流层析试纸结合研发，使之能更好的应用于现场筛查。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (8)
1.用于检测肠炎沙门氏菌的组合物，其特征在于：所述组合物包括名称分别为lygD-F3和lygD-R2的引物对和名称为lygD-P2的探针，所述lygD-F3是核苷酸序列为SEQ ID No.4的单链DNA分子，所述lygD-R2是核苷酸序列为SEQ ID No.7的单链DNA分子；所述lygD-P2的结构为SEQ ID No.12-四氢呋喃残基-SEQ ID No.13，SEQ ID No.12的第31位核苷酸T标记荧光基团，SEQ ID No.13的第2位核苷酸T标记淬灭基团，3’端进行阻断修饰。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LC RED640、LC RED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种，所述SEQ ID No.13的3’端连接C3-spacer。
3.鉴定或辅助鉴定肠炎沙门氏菌的产品，其特征在于，所述产品包括下述任一种：
D1)含有权利要求1或2所述组合物的体外核酸扩增试剂；
D2)含有权利要求1或2所述组合物或D1)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；
D3)含有权利要求1或2所述组合物、D1)所述体外核酸扩增试剂或D2)所述试剂盒的检测产品。
4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，D1)中所述体外核酸扩增试剂还包括进行重组酶聚合酶扩增所需的其它试剂。
5.权利要求1或2所述的组合物在下述任一中的应用；
E1)在制备鉴定或辅助鉴定样本中是否含有肠炎沙门氏菌的产品中的应用；
E2)在制备检测样本中是否含有肠炎沙门氏菌的产品中的应用；
E3)在制备用于鉴别区分样本中肠炎沙门氏菌和其他病原菌的产品中的应用；
E4)在制备用于诊断或辅助诊断肠炎沙门氏菌引起的疾病的产品中的应用；
E5)在制备筛查肠炎沙门氏菌引起的疾病的产品中的应用。
6.权利要求3或4所述的产品在下述任一中的应用；
F1)在制备鉴定或辅助鉴定样本中是否含有肠炎沙门氏菌的产品中的应用；
F2)在制备检测样本中是否含有肠炎沙门氏菌的产品中的应用；
F3)在制备用于鉴别区分样本中肠炎沙门氏菌和其他病原菌的产品中的应用；
F4)在制备用于诊断或辅助诊断肠炎沙门氏菌引起的疾病的产品中的应用；
F5)在制备筛查肠炎沙门氏菌引起的疾病的产品中的应用。
7.以非治疗和非诊断为目的鉴定或辅助鉴定肠炎沙门氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1或2所述的组合物或权利要求3或4所述的产品对权利要求5或6中所述的样本进行重组酶聚合酶扩增，根据荧光信号确定样本中是否存在肠炎沙门氏菌。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增的反应条件为39℃，20min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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