CN108588251A - 用于检测沙门氏菌的rpa引物、探针及检测方法 - Google Patents

用于检测沙门氏菌的rpa引物、探针及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于检测沙门氏菌的RPA引物、探针及检测方法。其引物序列如下：针对iroB基因：上游引物SEQ ID No.1:5’‑GGAATGTCATACTTAGCGGGTTTGACACGAGC‑3’；下游引物SEQ ID No.2:5’‑GGTGGTATTTGACGCTGGCGGTGCAAACCT‑3’。本发明将RPA技术与荧光检测相结合，可以快速准确的检测沙门氏菌。该方法可从常见致病菌中特异性检测到沙门氏菌，对沙门氏菌的快速检测提供了技术支持，同时可以免除昂贵仪器的投入，便于在基层推广使用。

Description

用于检测沙门氏菌的RPA引物、探针及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及用于检测沙门氏菌的引物、探针及检测方法。
背景技术
沙门氏菌是最常见的食源性致病菌之一，作为一种人畜共患病的病原菌，它每年会在全球广泛流行，导致病人出现肠胃炎和伤寒等症状，并给全世界带来巨大的经济损失。因此，开发沙门氏菌的快速检测方法对保障社会的食品安全及人民身体健康具有重要的意义。
目前沙门氏菌的检测方法传统培养方法、基于免疫学原理的方法以及基于分子生物学的方法。传统培养方法对实验设备的要求不高，但是检测周期较长，通常长达五天以上，并且该方法对检测人员的操作要求较高。而免疫学检测方法虽然灵敏度高，但是易受非特异反应干扰。基于分子生物学的方法虽然可以实现对目标菌的快速检测，但是它往往需要依赖昂贵的设备，例如荧光PCR法需要配套价格高达数十万元的荧光PCR仪。这些方法均不利于现场快速检测。
重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)是2006年由英国研究人员研发的一种新型的等温扩增技术，其原理是在恒温下，重组酶与寡核苷酸引物形成复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，解链模板DNA，引物与模板单链结合并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，同时单链DNA结合蛋白与另外一条模板单链结合。该方法的主要特点在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。目前RPA技术已经应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中，然而目前基于沙门氏菌iroB基因的引物和探针及检测方法并没有被应用于沙门氏菌的检测应用中。
目前多种沙门氏菌的基因被作为靶基因应用于沙门氏菌的检测中，但是大多数靶基因的特异性并不理想。iroB基因是一种特异性良好的沙门氏菌种特异性靶基因，针对该基因建立的PCR法可以特异检测出各血清型的沙门氏菌，并且该方法对其他肠道微生物的检测结果全都为阴性。因此基于沙门氏菌iroB基因的RPA引物和探针及RPA检测方法在对沙门氏菌的检测中将有着优良的特异性。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种用于检测沙门氏菌的RPA引物，其引物序列如下：针对iroB基因：
上游引物SEQ ID No.1:5’-GGAATGTCATACTTAGCGGGTTTGACACGAGC-3’
下游引物SEQ ID No.2:5’-GGTGGTATTTGACGCTGGCGGTGCAAACCT-3’。
优选的，采用上游引物、下游引物中的至少一种，或选自权利要求1所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。
本发明提供一种用于检测沙门氏菌的RPA探针，其序列如下：
针对iroB基因的探针：
SEQ ID No.3:5’-CGCTGAAGAATGAGAAGTTCCCCAAAATGTGGAAACATTAAATC-3’。
其长度为45-50bp，且在探针中间距5’端29bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团和淬灭基团取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。
优选的，所述荧光基因采用FAM，所述淬灭基团采用BHQ1。
优选的，用于检测沙门氏菌的RPA探针采用所述的探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。
同时，本发明还提供了一种用于RPA法检测沙门氏菌的试剂盒，包括所述的RPA引物和所述的RPA探针。
本发明还提供一种检测沙门氏菌的RPA方法，包括如下几个步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)根据权利要求1的序列组成合成RPA特异性引物，和根据序列组成合成RPA特异性探针；
(3)在RPA反应管中进行扩增反应，同时利用荧光收集器收集荧光。
优选的，RPA反应体系以50uL计为：
DNA模板 2uL
10umol/L上、下游引物 各2.1uL
10umol/L探针 0.6uL
1×反应缓冲液 29.5uL
280mmol/L Mg2+缓冲液 2.5uL
dd H2O 11.2uL
优选的，RPA反应条件为：37℃-42℃，反应时间为15-20分钟。
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
(1)本发明将RPA技术与荧光检测相结合，可以快速准确的检测沙门氏菌。
(2)该方法的灵敏度与Taq-man荧光PCR方法相差无几，可以从常见致病菌中特异性检测到沙门氏菌，对沙门氏菌的快速检测提供了技术支持，同时可以免除昂贵仪器的投入，便于在基层推广使用。
附图说明
图1为RPA方法的建立。其中曲线1为沙门氏菌ATCC14028；曲线2为空白对照。
图2为RPA方法对常见致病菌特异性验证实验。其中曲线1-12从上至下分别为沙门氏菌ATCC14028、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、圣堡罗沙门氏菌、波那雷恩沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、山夫顿堡沙门氏菌、阿伯丁沙门氏菌、阿德莱德沙门氏菌的扩增结果，曲线13为空白对照的扩增结果。
图3为RPA方法对常见致病菌特异性验证实验。其中曲线1为沙门氏菌ATCC14028，曲线2-16从上至下分别为大肠埃希氏菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、产气荚膜梭菌、马红球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌、福氏志贺氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌、粪链球菌及空白对照的扩增结果。
图4为RPA灵敏度实验。其中，曲线1：iroB基因拷贝数106/reaction，曲线2：iroB基因拷贝数105/reaction，曲线3：iroB基因拷贝数104/reaction，曲线4：iroB基因拷贝数103/reaction，曲线5：iroB基因拷贝数102/reaction，曲线6：空白对照。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：
实施例1
靶基因的选取与RPA引物探针的设计及筛选
利用生物信息学知识以及相关分析软件，对沙门氏菌常见的特异基因进行分析，诸如fimA,invA,iroB等，通过对沙门氏菌的这些基因与其他微生物进行比对分析，将iroB作为待选靶基因，并选择特异性较高的序列片段。根据RPA对引物和探针的设计要求，设计特异性引物及探针，之后再次将引物与探针的序列与沙门氏菌同源性高的物种进行比对，从中选择特异性高的引物及探针。之后通过对待选引物及探针进行试验比较分析，从中选择特异性高，扩增效率高的一个组合。筛选得到的引物及探针序列分别如所示(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)。其中探针需要被修饰，在探针中间距5’端29bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端也需要同过阻塞基团C3Spacer修饰。
上游引物SEQ ID No.1：5’-GGAATGTCATACTTAGCGGGTTTGACACGAGC-3’
下游引物SEQ ID No.2：5’-GGTGGTATTTGACGCTGGCGGTGCAAACCT-3’探针SEQ ID No.3:5-CGCTGAAGAATGAGAAGTTCCCCAAAA(FAM-dT)-(dSpacer)-(BHQ1-dT)GGAAACATTAAATC-C3spacer-3’
引物及探针交由上海生物工程有限公司合成。
实施例2
沙门氏菌RPA方法的建立
将沙门氏菌ATCC14028接种到营养肉汤中，放置在摇床上，按照每种细菌最适生长温度度培养过夜，吸取1mL培养菌液滴加到1.5mL离心管内，12000r/min离心2min，弃去上清液，加入500μL无菌生理盐水，充分悬浮混匀，12 000r/min离心1min，弃上清，重复添加无菌生理盐水，再离心，弃上清。添加50μL生理盐水，100℃水浴10-15min，待冷却室温12000r/min离心1min，上清液于-20℃保存备用。
以沙门氏菌ATCC14028的DNA作为模板，同时设置空白对照，利用实施例1中的RPA引物及探针进行RPA扩增，并利用荧光收集装置收集荧光，结果图1所示。
RPA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的RPA反应管中加入再水化缓冲液29.5uL、去离子水11.2uL、上下游引物各2.1uL、探针0.6uL、模板2uL、最后再加入醋酸镁溶液2.5uL。
RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在41℃条件下，扩增20min。
实施例3
对所建立的RPA方法进行特异性试验分析
本实施例中采用的标准菌株均有广州环凯微生物有限公司代为购买，具体信息如表1所示。
表1 用于RPA特异性分析的菌株
菌种 编号 菌种来源
沙门氏菌 ATCC14028 美国典型菌种保藏中心
甲型副伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50093 中国医学微生物菌种保藏管理中心
乙型副伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50094 中国医学微生物菌种保藏管理中心
丙型副伤寒沙门氏菌 CICC21512 中国工业微生物菌种保藏管理中心
伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50071 中国医学微生物菌种保藏管理中心
肠炎沙门氏菌 CMCC(B)50335 中国医学微生物菌种保藏管理中心
圣堡罗沙门氏菌 CICC21486 中国工业微生物菌种保藏管理中心
波那雷恩沙门氏菌 CICC21491 中国工业微生物菌种保藏管理中心
肯塔基沙门氏菌 CICC21488 中国工业微生物菌种保藏管理中心
山夫顿堡沙门氏菌 CICC21502 中国工业微生物菌种保藏管理中心
阿伯丁沙门氏菌 CICC21492 中国工业微生物菌种保藏管理中心
阿德莱德沙门氏菌 CICC21505 中国工业微生物菌种保藏管理中心
阴沟肠杆菌 ATCC13047 美国典型菌种保藏中心
大肠埃希氏菌O157 NTCC12900 中国典型培养物保藏中心
小肠结肠炎耶尔森菌 CMCC(B)52204 中国医学微生物菌种保藏管理中心
副溶血性弧菌 CICC21617 中国工业微生物菌种保藏管理中心
金黄色葡萄球菌 ATCC6538 美国典型菌种保藏中心
单核细胞增生李斯特菌 ATCC19115 美国典型菌种保藏中心
产气荚膜梭菌 ATCC13124 美国典型菌种保藏中心
马红球菌 ATCC6939 美国典型菌种保藏中心
枯草芽孢杆菌 ATCC9372 美国典型菌种保藏中心
铜绿假单胞菌 CMCC(B)10104 中国医学微生物菌种保藏管理中心
粘质沙雷菌 CICC10355 中国工业微生物菌种保藏管理中心
福氏志贺氏菌 CICC21534 中国工业微生物菌种保藏管理中心
弗氏柠檬酸杆菌 ATCC8090 美国典型菌种保藏中心
肺炎克雷伯氏菌 ATCC4352 美国典型菌种保藏中心
粪链球菌 ATCC19433 美国典型菌种保藏中心
以表1中菌株DNA作为RPA反应模板，利用实施例1中的RPA引物及探针进行RPA扩增。
RPA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的RPA反应管中加入再水化缓冲液29.5uL、去离子水11.2uL、上下游引物各2.1uL、探针0.6uL、模板2uL、最后再加入醋酸镁溶液2.5uL。
RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在41℃条件下，扩增20min。
扩增结果如图2和图3所示，从结果中可以知道，沙门氏菌ATCC14028和其他血清型沙门氏菌的扩增结果呈阳性，其他常见致病菌的检测结果与空白对照的扩增结果无差异，呈现阴性。该结果表明，本发明RPA引物、RPA探针以及RPA方法对沙门氏菌检测具有良好的特异性。
实施例4
利用RPA引物及探针检测沙门氏菌的灵敏度分析
以插入iroB基因的质粒为模板，利用实施例1中的RPA引物及探针进行扩增，其中不同反应中，iroB基因拷贝数分别为106/reaction，105/reaction，104/reaction，103/reaction，102/reaction。
RPA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的RPA反应管中加入再水化缓冲液29.5uL、去离子水11.2uL、上下游引物各2.1uL、探针0.6uL、模板2uL、最后再加入醋酸镁溶液2.5uL。
RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在41℃条件下，扩增20min。
灵敏度的实验结果如图4所示，有结果可知，本发明RPA法的检测下限可以达到103个iroB基因拷贝/reaction。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站，国家数字电子产品质量监督检验中心）
<120> 用于检测沙门氏菌的RPA引物、探针及检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
ggaatgtcat acttagcggg tttgacacga gc 32
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ggtggtattt gacgctggcg gtgcaaacct 30
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cgctgaagaa tgagaagttc cccaaaatgt ggaaacatta aatc 44

Claims (10)

1.一种用于检测沙门氏菌的RPA引物，其特征在于，其引物序列如下：针对iroB基因：
上游引物SEQ ID No.1: 5’-GGAATGTCATACTTAGCGGGTTTGACACGAGC-3’
下游引物SEQ ID No.2:5’-GGTGGTATTTGACGCTGGCGGTGCAAACCT-3’。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，采用上游引物、下游引物中的至少一种，或选自权利要求1所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
3.一种用于检测沙门氏菌的RPA探针，其特征在于，其序列如下：针对iroB基因的探针：SEQ ID No.3: 5’-CGCTGAAGAATGAGAAGTTCCCCAAAATGTGGAAACATTAAATC-3’；
其长度为45-50bp，且在探针中间距5’端29bp 的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团和淬灭基团取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。
4.如权利要求3所述的用于检测沙门氏菌的RPA探针，其特征在于，所述荧光基因采用FAM，所述淬灭基团采用BHQ1。
5.一种用于检测沙门氏菌的RPA探针，其特征在于，采用如权利要求3所述的探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
6.一种用于RPA法检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的RPA引物和权利要求3所述的RPA探针。
7.一种检测沙门氏菌的RPA方法，其特征在于，包括如下几个步骤：
（1）提取待测样品的DNA；
（2）根据如权利要求1所述的序列组成合成RPA特异性引物，与根据权利要求3的序列组成合成RPA特异性探针；
在RPA反应管中进行扩增反应，同时利用荧光收集器收集荧光。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，RPA反应体系以50uL计为：
DNA模板 2uL 10umol/L上、下游引物 各2.1uL 10umol/L 探针 0.6uL 1×反应缓冲液 29.5uL 280mmol/L Mg2+缓冲液 2.5uL dd H2O 11.2uL
。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，RPA反应条件为：37℃-42℃，反应时间为15-20分钟。
10.如权利要求7所述的方法在检测沙门氏菌中的应用。
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