CN107022632A - 一种沙门氏菌检测用引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种沙门氏菌检测用引物组、试剂盒及应用，其中，所述引物组包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP、环引物LoopF及环引物LoopB，其序列依次如SEQ ID NO:2~7所示，试剂盒包括引物组、DNA 聚合酶、DNA 聚合酶缓冲液、dNTP Mix、MgSO4、荧光染料及无菌去离子水，本发明解决现有技术中对沙门氏菌检测需要依赖大型仪器、灵敏度不高、耗时长、不能满足现场及基层快速检测需要的问题。

Description

一种沙门氏菌检测用引物组、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种沙门氏菌检测用引物组、试剂盒及应用。
背景技术
沙门氏菌是一种杆状革兰氏阴性菌，是环境中主要的人兽共患病原菌之一。大部分沙门氏菌血清型能引起肠胃炎等疾病，据统计，美国有大约100万人因沙门氏菌导致肠炎，其中约450例死亡。少数血清型能引起肠热症，如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌A型、B型及C型等。沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，可由肉、蛋、奶、蛋糕、肉制品等众多营养丰富的食品进行传播。
近年来，随着生物技术的快速发展，新技术新方法在食品微生物检验领域得到了广泛应用，沙门氏菌检测的检测方法也越来越多，但是这些方法大部分都是基于实验室大型仪器进行的，而且检测时间也较长。因此建立快速且灵敏的沙门氏菌的检测方法十分重要。因此开发一种对实验设备依赖程度低的，而且有利于在野外进行快速检测的可视化方法对于沙门氏菌的监控和检测具有现实意义。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种沙门氏菌检测用引物组、试剂盒及应用，旨在解决现有技术中对沙门氏菌检测需要依赖大型仪器、灵敏度不高、耗时长、不能满足现场及基层快速检测需要的问题。
本发明的技术方案如下：
一种沙门氏菌检测用引物组，其中，所述引物组以沙门氏菌invA基因为靶基因，基于环介导等温扩增技术设计，所述引物组包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP、环引物LoopF和环引物LoopB，各引物的核苷酸序列分别为：
上游外引物F3：5’- TGTGGAGCATATTCGTGG-3’；
下游外引物B3：5’-GCAATCAATAAATCATCCAACTT -3’；
上游内引物FIP：5’-
CCTCAACTTCAGCAGATACCATTACTATTTGCCATAAATTCGCCA -3’；
下游内引物BIP：
5’-TTCGCAAAGGGATCCGTCAGGAGATCCATCAAATTAGCGG-3’；
环引物LoopF：5’- GCTCGTAATTCGCCGCCAT -3’；
环引物LoopB：5’- CTCAGCCTTGACCCGGAAG -3’。
一种沙门氏菌检测试剂盒，其中，包括如上所述的引物组。
一种沙门氏菌检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括DNA 聚合酶、DNA 聚合酶缓冲液、dNTP Mix、MgSO4、荧光染料及无菌去离子水。
一种沙门氏菌检测试剂盒，其中，还包括：阳性对照液、阴性对照液、无菌矿物油。
一种沙门氏菌检测试剂盒，其中，上游外引物F3和下游外引物B3浓度均为 5 μM/L，上游内引物BIP和下游内引物FIP浓度均为40 μM/L，环引物LoopF 和环引物LoopB浓度均为10 μM/L。
一种沙门氏菌检测试剂盒，其中，所述 DNA聚合酶为 8000U/mL的Bst DNA 聚合酶，所述dNTP Mix浓度为10 mM/L，MgSO4浓度为100 mmol/ L，DNA 聚合酶缓冲液为10×BstDNA 聚合酶缓冲液。
一种沙门氏菌检测试剂盒，其中，所述荧光染料为10 μM/L的SYTO-9。
一种沙门氏菌检测试剂盒，其中，所述阳性对照液是用T载体构建的含有沙门氏菌invA基因的标准载体，所述阴性照液是不含沙门氏菌基因的无菌去离子水。
一种沙门氏菌检测试剂盒，其中，所述无菌矿物油为高温灭菌的石蜡油。
本发明还提供了所述的沙门氏菌检测用引物组或所述的沙门氏菌检测试剂盒在检测沙门氏菌中的应用。
有益效果：本发明提供了一种沙门氏菌检测用引物组、试剂盒及其应用，所述引物组以invA基因作为检测靶基因，所述试剂盒含有所述引物组，可根据检测引物组是否有扩增来快速判断样品中是否有沙门氏菌。本发明的沙门氏菌检测试剂盒，只需一个恒定温度就能进行扩增反应，不需要特殊试剂与设备，步骤简单、检测成本低，根据是否扩增即能判断沙门氏菌存在与否，而且在不到一个小时即可完成扩增，具有高度特异性、快速高效的特点，本解决了现有技术中对沙门氏菌检测需要依赖大型仪器、灵敏度不高、耗时长、不能满足现场及基层快速检测需要的问题。
附图说明
图1为本发明引物特异性检测图
其中，1~9分别表示阴性对照、铜绿假单胞菌、变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、单增李斯特菌及甲型沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。
图2为本发明引物灵敏度检测图。
具体实施方式
本发明提供一种沙门氏菌检测用引物组、试剂盒及应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下结合具体实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：引物组的设计
所述引物组以沙门氏菌invA基因为靶基因，基于环介导等温扩增技术设计，首先，将invA基因序列通过 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行分析，找出基因的保守区域。然后，将选择好的基因序列输入到The Primer Explorer Version 4在线软件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)中进行引物设计，为了确保引物的有效性，选择二聚体形成吉布自由能(ΔG)最低及杂交ΔG最高的引物。最后，使用OligoCalc 在线软件（http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html）进一步确定引物的热力学特性。
所述引物组包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP、环引物LoopF和环引物LoopB，各引物的核苷酸序列分别为：
上游外引物F3：5’- TGTGGAGCATATTCGTGG-3’（SEQ ID NO.2）；
下游外引物B3：5’-GCAATCAATAAATCATCCAACTT -3’（SEQ ID NO.3）；
上游内引物FIP：5’-
CCTCAACTTCAGCAGATACCATTACTATTTGCCATAAATTCGCCA -3’（SEQ ID NO.4）；
下游内引物BIP：
5’- TTCGCAAAGGGATCCGTCAGGAGATCCATCAAATTAGCGG -3’（SEQ ID NO.5）；
环引物LoopF：5’- GCTCGTAATTCGCCGCCAT -3’ （SEQ ID NO.6）；
环引物LoopB：5’- CTCAGCCTTGACCCGGAAG -3’ （SEQ ID NO.7）。
而invA 基因扩增序列区域为：
TTGTGGAGCATATTCGTGGGGCAATGGCGCGTTATATTTGCCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGCAAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGGATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGC（SEQ IDNO.1）。
实施例2：试剂盒的建立及应用
一种沙门氏菌检测试剂盒，包括前面所述的引物组、DNA 聚合酶、DNA 聚合酶缓冲液、dNTP Mix、MgSO4、荧光染料及无菌矿物油（例如高温灭菌的石蜡油）。
较佳地，所述沙门氏菌荧光LAMP检测试剂盒还包括：阳性对照液、阴性对照液。所述阳性对照液是用T载体构建含有沙门氏菌invA基因的标准载体，所述阴性照液是不含沙门氏菌基因的无菌去离子水。
所述T载体构建含有沙门氏菌invA基因的标准载体构建方法如下：首先，按常规方法培养沙门氏菌标准菌株，并提取沙门氏菌基因组DNA为模板。然后，用上游外引物F3（SEQID NO.2）和下游外引物B3（SEQ ID NO.3）对沙门氏菌基因组DNA进行普通PCR扩增，对得到的PCR产物进行纯化。其次，利用购买于生工生物工程（上海）股份有限公司的T-载体PCR产物克隆试剂盒，将PCR产物与 pUCm-T 载体进行连接。最后，经测序鉴定后得到阳性对照。
另外，上游外引物F3和下游外引物B3浓度均为 5 μM/L，上游内引物BIP和下游内引物FIP浓度均为40 μM/L，环引物LoopF 和环引物LoopB浓度均为10 μM/L，所述 DNA聚合酶为 8000U/mL的Bst DNA 聚合酶，所述dNTP Mix浓度为10 mM/L，MgSO4浓度为100 mmol/L，DNA 聚合酶缓冲液为10×Bst DNA 聚合酶缓冲液，所述荧光染料为10 μM/L的SYTO-9。
所述的沙门氏菌检测用引物组或所述的沙门氏菌检测试剂盒在检测沙门氏菌中的应用，其中，包括步骤：
S1、提取待测样本基因组DNA为模板；
S2、配制荧光LAMP 反应体系：加入引物组、DNA 聚合酶、DNA 聚合酶缓冲液、样本基因组DNA 模板及荧光染料，然后加入无菌去离子水，再加入无菌矿物油进行体系密封；
S3、反应：所述荧光LAMP 反应体系，在ZYD-S1、ESE Tube Scanner、Genie III、Deaou-308c、DA7600 等荧光定量PCR仪或ABI 7500、LightCycler480、CFX 96、Mx3005P等恒温荧光扩增仪中进行，反应温度为60-65℃条件下反应 、时间为30-60分钟；
S4、结果判读：
若出现“s”型扩增曲线且出峰时间<40min，则判断为阳性，含有沙门氏菌；
若出现“s”型扩增曲线且出峰时间>=40min，则判断为可疑样本，需进行复检；
若没有出现“s”型扩增曲线，则判为阴性，不含有沙门氏菌或含量低于检测限。
具体地，所述步骤S2中，外引物F3+B3的浓度、内引物FIP+BIP的浓度、环引物LoopF+LoopB的浓度比例为1：8：2，且上游外引物F3和下游外引物B3的终浓度均为 0.176~0.352μM/L，dNTP Mix的终浓度为1.144~1.584 mM/L，所述 DNA聚合酶的终浓度为 320U/mL，MgSO4浓度为5.28~7.04 mmol/ L， 10×Bst DNA 聚合酶缓冲液的终体积分数为11.5%。
在利用本发明的试剂盒进行实际应用时，以配制25μL反应体系为例，步骤S2具体包括：分别依次加入0.88~1.76μL的引物组（其中上游外引物F3和下游外引物B3浓度均为 5μM/L，上游内引物BIP和下游内引物FIP浓度均为40 μM/L，环引物LoopF 和环引物LoopB浓度均为10 μM/L）、2.86~3.96μL浓度为10 mM/L的dNTP Mix、2.53μL的10×Bst DNA 聚合酶缓冲液、1.32~1.76μL的100 mmol/ L MgSO4、0.88~1.32μL的10 μM/L SYTO-9，再加入去离子水补足至 22 μL，然后加入8000U/mL的Bst DNA 聚合酶1 μL，再加入待测样本基因组DNA2 μL，再加入15μL的无菌矿物油进行封装，即完成了荧光LAMP 反应体系的配制。然后置于实时荧光定量PCR仪或恒温荧光扩增仪中并在60-65℃条件下反应 30-60 分钟，即可判定检测结果。
其中，沙门氏菌荧光LAMP初始反应体系（25µL）如表1所示：
表1沙门氏菌荧光LAMP初始反应体系初始反应体系和反应条件
较佳地，所述步骤S2还包括，利用阳性对照液（即T载体构建的含有沙门氏菌invA基因的标准载体）代替样本基因组DNA 模板配制阳性对照组荧光LAMP 反应体系，并利用阴性对照液（即不含沙门氏菌基因的无菌去离子水）代替样本基因组DNA 模板配制阴性对照组荧光LAMP 反应体系，以对检测结果进行对照，增加结果可信度。
实施例3：特异性测试
首先，按常规的细菌培养方法，分别培养铜绿假单胞菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、鲍曼不动杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌及肠炎沙门氏菌和甲型沙门氏菌。
其次，用生工生物工程（上海）股份有限公司的磁珠法细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取上述细菌的基因组DNA为模板。
然后，按照前述方法分别配置LAMP扩增体系。具体方法如下：取9个PCR管，分别依次加入1μL的引物组（其中上游外引物F3和下游外引物B3浓度均为 5 μM/L，上游内引物BIP和下游内引物FIP浓度均为40 μM/L，环引物LoopF 和环引物LoopB浓度均为10 μM/L）、3μL浓度为10 mM/L的dNTP Mix、2.53μL的10×Bst DNA 聚合酶缓冲液、1.5μL的100 mmol/ LMgSO4、1μL的10 μM/L SYTO-9，再加入去离子水补足至 22 μL，然后加入8000U/mL的BstDNA 聚合酶1 μL，在9个PCR管中分别加入上述基因组DNA 模板2 μL，以2 μL无菌水为对照。最后，分别加入15 μL石蜡油进行体系密封，再置于Deaou-308c恒温扩增仪中，于63℃反应60分钟。结果如图1所示。图1表明，本发明所提供的引物组对肠炎沙门氏菌和甲型沙门氏菌这2种沙门氏菌基因组DNA的扩增为阳性, 而对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、鲍曼不动杆菌、变形杆菌及金黄色葡萄球菌基因组扩增均为阴性，这表明该引物组和试剂盒及检测方法对沙门氏菌有良好的特异性。
实施例4：灵敏度测试
首先，按常规的细菌培养方法，培养甲型沙门氏菌。
其次，用生工生物工程（上海）股份有限公司的磁珠法细菌基因组DNA抽提试剂盒提取上述细菌的基因组DNA为模板，并依次梯度稀释到1.85 ng/μL、0.185 ng/μL、18.5 pg/μL、1.85 pg/μL及185 fg/μL。
然后，按照前述方法配置分别配置LAMP扩增体系，具体方法如下：取6个PCR管，分别依次加入1μL的引物组（其中上游外引物F3和下游外引物B3浓度均为 5 μM/L，上游内引物BIP和下游内引物FIP浓度均为40 μM/L，环引物LoopF 和环引物LoopB浓度均为10 μM/L）、3μL浓度为10 mM/L的dNTP Mix、2.53μL的10×Bst DNA 聚合酶缓冲液、1.5μL的100mmol/ L MgSO4、1μL的10 μM/L SYTO-9，再加入去离子水补足至 22 μL，然后加入8000U/mL的Bst DNA 聚合酶1 μL，在9个PCR管中分别加入上述梯度稀释的甲型沙门氏菌基因组DNA模板2 μL，以2 μL无菌水为对照，最后分别加入15 μL石蜡油进行体系密封，并置于Deaou-308c恒温扩增仪中，于63℃反应60分钟。实验结果如图2所示，结果表明本发明所提供的引物、试剂盒及检测方法成功检测到3.7 pg 的甲型沙门氏菌基因组DNA，表明该引物、试剂盒及检测方法具非常高的检测灵敏度。
综上所述，本发明提供了一种沙门氏菌实时荧光LAMP检测的引物组、试剂盒及其应用，所述引物组以invA基因作为检测靶基因，所述试剂盒含有所述引物组，可根据检测引物组是否有扩增来快速判断样品中是否有沙门氏菌。本发明具有检测快速、灵敏度高、特异性高、步骤简单作等特点，解决了现有技术中对沙门氏菌检测需要依赖大型仪器、灵敏度不高、耗时长、不能满足现场及基层快速检测需要的问题。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
SEQ ID NO 1：
TTGTGGAGCATATTCGTGGGGCAATGGCGCGTTATATTTGCCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGCAAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGGATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGC
SEQ ID NO 2：
TGTGGAGCATATTCGTGG
SEQ ID NO 3：
GCAATCAATAAATCATCCAACTT
SEQ ID NO 4：
CCTCAACTTCAGCAGATACCATTACTATTTGCCATAAATTCGCCA
SEQ ID NO 5：
TTCGCAAAGGGATCCGTCAGGAGATCCATCAAATTAGCGG
SEQ ID NO 6：
GCTCGTAATTCGCCGCCAT
SEQ ID NO 7：
CTCAGCCTTGACCCGGAAG

Claims (10)

1.一种沙门氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组以沙门氏菌invA基因为靶基因，基于环介导等温扩增技术设计，所述引物组包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP、环引物LoopF和环引物LoopB，各引物的核苷酸序列分别为：
上游外引物F3：5’- TGTGGAGCATATTCGTGG-3’；
下游外引物B3：5’-GCAATCAATAAATCATCCAACTT -3’；
上游内引物FIP：5’-
CCTCAACTTCAGCAGATACCATTACTATTTGCCATAAATTCGCCA -3’；
下游内引物BIP：
5’-TTCGCAAAGGGATCCGTCAGGAGATCCATCAAATTAGCGG-3’；
环引物LoopF：5’- GCTCGTAATTCGCCGCCAT -3’；
环引物LoopB：5’- CTCAGCCTTGACCCGGAAG -3’。
2.一种沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA 聚合酶、DNA 聚合酶缓冲液、dNTP Mix、MgSO4、荧光染料及无菌去离子水。
4.根据权利要求2所述的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，还包括：阳性对照液、阴性对照液、无菌矿物油。
5.根据权利要求3所述的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，上游外引物F3和下游外引物B3浓度均为 5 μM/L，上游内引物BIP和下游内引物FIP浓度均为40 μM/L，环引物LoopF和环引物LoopB浓度均为10 μM/L。
6.根据权利要求3所述的沙门氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述 DNA聚合酶为8000U/mL的Bst DNA 聚合酶，所述dNTP Mix浓度为10 mM/L，MgSO4浓度为100 mmol/ L，DNA聚合酶缓冲液为10×Bst DNA 聚合酶缓冲液。
7.根据权利要求3所述的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为10 μM/L的SYTO-9。
8.根据权利要求3所述的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液是用T载体构建的含有沙门氏菌invA基因的标准载体，所述阴性照液是不含沙门氏菌基因的无菌去离子水。
9.根据权利要求4所述的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述无菌矿物油为高温灭菌的石蜡油。
10.一种沙门氏菌检测试剂盒的应用，其特征在于，利用权利要求2~9 中任一所述的沙门氏菌检测试剂盒进行沙门氏菌检测。
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