CN101748201A - 环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌 - Google Patents

环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌 Download PDF

Info

Publication number
CN101748201A
CN101748201A CN200810209551A CN200810209551A CN101748201A CN 101748201 A CN101748201 A CN 101748201A CN 200810209551 A CN200810209551 A CN 200810209551A CN 200810209551 A CN200810209551 A CN 200810209551A CN 101748201 A CN101748201 A CN 101748201A
Authority
CN
China
Prior art keywords
listeria monocytogenes
loop
isothermal amplification
mediated isothermal
detects
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200810209551A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101748201B (zh
Inventor
李苏龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTRE OF HEILONGJIANG ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Original Assignee
INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTRE OF HEILONGJIANG ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTRE OF HEILONGJIANG ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC filed Critical INSPECTION AND QUARANTINE TECHNOLOGY CENTRE OF HEILONGJIANG ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC
Priority to CN2008102095513A priority Critical patent/CN101748201B/zh
Publication of CN101748201A publication Critical patent/CN101748201A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101748201B publication Critical patent/CN101748201B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，目前，微生物的传统检测方法除操作繁琐外，检验时间也较长，一般需要5-15天的培养鉴定时间，时间上不能满足快速检测的要求。本发明组成包括：预处理、检测过程、结果检测、结果判断，选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因(GenBank登陆号：AF532235)，设计2对引物，通过提供特异性的引物组，对单核细胞增生李斯特菌的核酸进行LAMP基因扩增，检测样品中是否存在特定基因片段，进而确定样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌。本发明应用于对食源性致病菌的检测。

Description

环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌
技术领域：
本发明涉及一种环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌。
背景技术：
目前，对食源性致病菌的检测主要有标准方法、生化仪器法(API，VETEK)、酶联荧光免疫检测法(VIDAS)、胶体金试纸法、PCR法、基因芯片法等。微生物的传统检测方法除操作繁琐外，检验时间也较长，一般需要5-15天的培养鉴定时间，时间上不能满足快速检测的要求。
随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感致病菌检测方法。免疫学方法简单快速，但灵敏性差，假阳性高；分子生物学技术简单快速，灵敏度高，但设备投入高，不易推广使用。
发明内容：
本发明的目的是提供一种检测方便、快捷的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因、检测过程、结果检测、结果判断，选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因(GenBank登陆号：AF532235)，设计2对引物：
内引物为：FIP：TTAGGCGCAGGTGTAGTTGC CTGCTGCAGAAACAAAAACTGAA
          BIP：GATCAAAATGCTACTACACACGCTG CCGTATTTTACGGATAAAGCCCA
外引物为：F3：ACACAAGAAGTGAAAAAAGAAAC
          B3：ACATAATGTCTTGAACAGAAACA
通过提供特异性的引物组，对单核细胞增生李斯特菌的核酸进行LAMP基因扩增，检测样品中是否存在特定基因片段，进而确定样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌。
环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、检测过程、结果检测、结果判断，所述的检测过程是将22.5μLLAMP反应液、0.5μLBst酶，DNA(单核细胞增生李斯特菌)加入到洁净的1.5mL离心管中，混合均匀，以2000r/min转速离心10sec，向一组反应管中分别加入22.5μL上述反应液，向PCR反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2μL，盖紧管盖并做好标记，置65℃恒温反应60min。
所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的预处理是将环介导恒温扩增LAMP反应液在使用前在室温融化振荡混匀后，以2000r/min转速离心10sec，其余室温融化后，以2000r/min转速离心10sec。
所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的结果检测是取出反应管，冷却至室温，以2000r/min转速离心10sec，观看是否有沉淀或分别加入1μL显色液，轻轻混匀，在黑色背景下观察颜色变化或电泳检测。
所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的结果判断在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为单核增生李斯特氏菌阳性；待检样品反应管液体呈橙色则可报告单核增生李斯特氏菌检验结果为阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所需LAMP反应管数的计算方法为：设LAMP反应管数为n，则n＝样品数+1(阳性对照)+1(阴性对照)+1。
这个技术方案有以下有益效果：
LAMP方法的特点：(1)扩增产物的检测方便、快捷。LAMP反应的副产物是白色焦磷酸镁沉淀，肉眼即可观察，是鉴定反应是否进行的最直接的参照。另外，LAMP扩增产物可以像PCR反应一样利用凝胶电泳并结合成像系统进行检测。(2)LAMP反应特异性强、灵敏度高。针对病原微生物特异性基因靶核酸序列设计的两对内外引物，可以严格地识别靶核酸序列上的6个独立区域，所以LAMP反应不会受到反应混合物中存在的非靶序列DNA存在的影响。(3)LAMP反应扩增效率高。此反应是在恒温条件下(60～65℃)进行，没有温度循环变化上的时间损失。(4)实验装置简单。LAMP反应由于不需要热变性的DNA作为模板，在恒温下就可进行，因此，不需要温度循环装置。在操作过程中，仅需要普通水浴锅或者其他可以得到稳定热源的设备就可以。由此可见，此方法设备投资少，便于检测和操作，具有广泛推广性，可以成为普通实验室的检测方法。
1.LAMP反应特异性强、灵敏度高。设计的两对内外引物，可以严格地识别靶核酸序列上的6个独立区域。检测单核细胞增生李斯特菌的灵敏度达到102cfu/mL。
2.本发明扩增产物的检测方便、快捷。LAMP反应的副产物是白色焦磷酸镁沉淀，肉眼即可观察，是鉴定反应是否进行的最直接的参照。另外，LAMP扩增产物可以通过荧光物质不开盖检测。也可以利用凝胶电泳进行检测。
3.本发明LAMP反应扩增效率高。此反应在恒温条件下65℃进行60min，即可出结果。
4设备要求不高。LAMP反应在恒温下就可进行，因此，不需要温度循环装置。在操作过程中，仅需要普通水浴锅或者其他可以得到稳定热源的设备就可以。由此可见，此方法设备投资少，便于检测和操作，具有广泛推广性，可以成为普通实验室的检测方法。
本发明的具体实施方式：
实施例1：
环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因、检测过程、结果检测、结果判断，选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因(GenBank登陆号：AF532235)，设计2对引物：
内引物为：FIP：TTAGGCGCAGGTGTAGTTGC CTGCTGCAGAAACAAAAACTGAA
          BIP：GATCAAAATGCTACTACACACGCTG CCGTATTTTACGGATAAAGCCCA
外引物为：F3：ACACAAGAAGTGAAAAAAGAAAC
          B3：ACATAATGTCTTGAACAGAAACA
通过提供特异性的引物组，对单核细胞增生李斯特菌的核酸进行LAMP基因扩增，检测样品中是否存在特定基因片段，进而确定样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌。
实施例2：
环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、检测过程、结果检测、结果判断，所述的检测过程是将22.5μLLAMP反应液、0.5μLBst酶，DNA(单核细胞增生李斯特菌)加入到洁净的1.5mL离心管中，混合均匀，以2000r/min转速离心10sec，向一组反应管中分别加入22.5μL上述反应液，向PCR反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2μL，盖紧管盖并做好标记，置65℃恒温反应60min。
实施例3：
所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的预处理是将环介导恒温扩增LAMP反应液在使用前在室温融化振荡混匀后，以2000r/min转速离心10sec，其余室温融化后，以2000r/min转速离心10sec。
实施例4：
所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的结果检测是取出反应管，冷却至室温，以2000r/min转速离心10sec，观看是否有沉淀或分别加入1μL显色液，轻轻混匀，在黑色背景下观察颜色变化或电泳检测。
实施例5：
所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的结果判断在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为单核增生李斯特氏菌阳性；待检样品反应管液体呈橙色则可报告单核增生李斯特氏菌检验结果为阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
实施例6：
所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所需LAMP反应管数的计算方法为：设LAMP反应管数为n，则n＝样品数+1(阳性对照)+1(阴性对照)+1。

Claims (9)

1.一种环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因、检测过程、结果检测、结果判断，其特征是：选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因(GenBank登陆号：AF532235)，设计2对引物：
内引物为：FIP：TTAGGCGCAGGTGTAGTTGC CTGCTGCAGAAACAAAAACTGAA
          BIP：GATCAAAATGCTACTACACACGCTG CCGTATTTTACGGATAAAGCCCA
外引物为：F3：ACACAAGAAGTGAAAAAAGAAAC
          B3：ACATAATGTCTTGAACAGAAACA
通过提供特异性的引物组，对单核细胞增生李斯特菌的核酸进行LAMP基因扩增，检测样品中是否存在特定基因片段，进而确定样品中是否存在单核细胞增生李斯特菌。
2.根据权利要求1所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其特征是：所述的检测过程是将22.5μLLAMP反应液、0.5μLBst酶，DNA(单核细胞增生李斯特菌)加入到洁净的1.5mL离心管中，混合均匀，以2000r/min转速离心10sec，向一组反应管中分别加入22.5μL上述反应液，向PCR反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2μL，盖紧管盖并做好标记，置65℃恒温反应60min。
3.根据权利要求1或2所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其特征是：所述的预处理是将环介导恒温扩增LAMP反应液在使用前在室温融化振荡混匀后，以2000r/min转速离心10sec，其余室温融化后，以2000r/min转速离心10sec。
4.根据权利要求1或2所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其特征是：所述的结果检测是取出反应管，冷却至室温，以2000r/min转速离心10sec，观看是否有沉淀或分别加入1μL显色液，轻轻混匀，在黑色背景下观察颜色变化或电泳检测。
5.根据权利要求3所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其特征是：所述的结果检测是取出反应管，冷却至室温，以2000r/min转速离心10sec，观看是否有沉淀或分别加入1μL显色液，轻轻混匀，在黑色背景下观察颜色变化或电泳检测。
6.根据权利要求1或2所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其特征是：所述的结果判断在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为单核增生李斯特氏菌阳性；待检样品反应管液体呈橙色则可报告单核增生李斯特氏菌检验结果为阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
7.根据权利要求3所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其特征是：所述的结果判断在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为单核增生李斯特氏菌阳性；待检样品反应管液体呈橙色则可报告单核增生李斯特氏菌检验结果为阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
8.根据权利要求4所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其特征是：所述的结果判断在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为单核增生李斯特氏菌阳性；待检样品反应管液体呈橙色则可报告单核增生李斯特氏菌检验结果为阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
9.根据权利要求2所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其特征是：所需LAMP反应管数的计算方法为：设LAMP反应管数为n，则n＝样品数+1(阳性对照)+1(阴性对照)+1。
CN2008102095513A 2008-11-28 2008-11-28 环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌 Expired - Fee Related CN101748201B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2008102095513A CN101748201B (zh) 2008-11-28 2008-11-28 环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2008102095513A CN101748201B (zh) 2008-11-28 2008-11-28 环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101748201A true CN101748201A (zh) 2010-06-23
CN101748201B CN101748201B (zh) 2012-06-27

Family

ID=42475813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008102095513A Expired - Fee Related CN101748201B (zh) 2008-11-28 2008-11-28 环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101748201B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102140505A (zh) * 2010-12-08 2011-08-03 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法及试剂盒
CN102520172A (zh) * 2011-12-12 2012-06-27 北京陆桥技术有限责任公司 单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用
CN102719535A (zh) * 2012-06-01 2012-10-10 南昌大学 快速检测食品中单核增生李斯特菌的方法
CN103725763A (zh) * 2012-10-12 2014-04-16 苏州四同医药科技有限公司 一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
CN106367492A (zh) * 2015-09-02 2017-02-01 上海旺旺食品集团有限公司 快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物及应用
CN106480209A (zh) * 2016-11-22 2017-03-08 无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司 一种食品中李斯特菌的检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101307351A (zh) * 2008-04-29 2008-11-19 广州华峰生物科技有限公司 基于环介导等温扩增技术的单核增生李斯特菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102140505A (zh) * 2010-12-08 2011-08-03 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 一种用环介导恒温扩增法检测诺维梭菌的方法及试剂盒
CN102520172A (zh) * 2011-12-12 2012-06-27 北京陆桥技术有限责任公司 单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用
CN102719535A (zh) * 2012-06-01 2012-10-10 南昌大学 快速检测食品中单核增生李斯特菌的方法
CN103725763A (zh) * 2012-10-12 2014-04-16 苏州四同医药科技有限公司 一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
CN106434884B (zh) * 2015-09-02 2020-02-21 上海产业技术研究院 快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物及试剂盒
CN106434884A (zh) * 2015-09-02 2017-02-22 上海产业技术研究院 快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物及试剂盒
CN106367492B (zh) * 2015-09-02 2020-02-07 上海旺旺食品集团有限公司 快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物及应用
CN106367492A (zh) * 2015-09-02 2017-02-01 上海旺旺食品集团有限公司 快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物及应用
CN110938678A (zh) * 2015-09-02 2020-03-31 上海旺旺食品集团有限公司 快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物组及试剂盒
CN110951837A (zh) * 2015-09-02 2020-04-03 上海旺旺食品集团有限公司 单核细胞增生李斯特菌核酸快速恒温检测方法及应用
CN111020010A (zh) * 2015-09-02 2020-04-17 上海产业技术研究院 单核细胞增生李斯特菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒
CN111041114A (zh) * 2015-09-02 2020-04-21 上海产业技术研究院 单核细胞增生李斯特菌核酸快速恒温检测方法及应用
CN110938678B (zh) * 2015-09-02 2022-08-26 上海旺旺食品集团有限公司 快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物组及试剂盒
CN110951837B (zh) * 2015-09-02 2022-08-26 上海旺旺食品集团有限公司 单核细胞增生李斯特菌核酸快速恒温检测方法及应用
CN111041114B (zh) * 2015-09-02 2023-03-28 上海产业技术研究院 单核细胞增生李斯特菌核酸快速恒温检测方法及应用
CN111020010B (zh) * 2015-09-02 2023-05-02 上海产业技术研究院 单核细胞增生李斯特菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒
CN106480209A (zh) * 2016-11-22 2017-03-08 无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司 一种食品中李斯特菌的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN101748201B (zh) 2012-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106434886B (zh) 快速恒温检测假结核耶尔森氏菌的方法、引物及应用
CN101748201B (zh) 环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌
CN103320434A (zh) 一种沙门氏菌lamp引物组和试剂盒及检测方法
CN107619884A (zh) 一种检测eb病毒的rca方法
CN106967816A (zh) 检测食品中副溶血弧菌的rpa特异性引物及试剂盒与应用
CN103436602B (zh) 双重分子信标-lamp法同时检测金黄色葡萄球菌基因和大肠杆菌基因的试剂盒及方法
CN102094090B (zh) 一种霍乱毒素毒力基因检测试剂盒及其检测方法
CN113667765A (zh) 一种利用CRISPR/Cas12a体系可视化检测金黄色葡萄球菌的方法
CN101008036A (zh) 基于环介导等温扩增技术的志贺氏菌基因快速诊断试剂盒
CN104846078A (zh) 可避免假阴性的空肠弯曲菌恒温荧光检测引物组、试剂盒及检测方法
CN104263838A (zh) 单增李斯特菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法
CN113999921B (zh) 快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒
CN111073986B (zh) 沙门氏菌的快速恒温检测方法、引物组及应用
CN101368203B (zh) 单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
CN104212885A (zh) 一种水产品中霍乱弧菌的lamp试剂盒
CN106434916A (zh) 一种阪崎肠杆菌的lamp引物组及试剂盒与使用方法
CN109355403A (zh) 一种psr检测耐甲氧西林金葡菌的引物、试剂盒与方法
CN107557453A (zh) 基于rpa技术检测猪源性成分的引物、探针、试剂盒及其应用
CN101824482A (zh) 一种霍乱弧菌o1群检测试剂盒及其检测方法
CN101182575B (zh) 运用环介导恒温扩增技术检测食源性假结核耶尔森氏菌的方法
CN102643924B (zh) 单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物组和试剂盒
CN102643923B (zh) 一种单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物组和试剂盒
CN108948229B (zh) 一种4-甲基伞形酮富集材料及其用途
CN102676672B (zh) 环介导等温扩增技术快速检测单增李斯特菌的引物组和试剂盒
CN102643922B (zh) 一种环介导等温扩增技术快速检测单增李斯特菌的引物组和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120627

Termination date: 20121128