CN101008036A - 基于环介导等温扩增技术的志贺氏菌基因快速诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

基于环介导等温扩增技术的志贺氏菌基因快速诊断试剂盒，涉及生物检测试剂领域。它是由一套引物、DNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色液、阳性对照液组成的试剂盒，所说的一套引物是由二对引物组成，其序列为：外引物1：ACATGAAGAGCAYGCCAACA，其中Y代表T或C，外引物2：TCCTCACAGCTCTCAGTGG，内引物1：CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA，内引物2：GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT，引物由内引物各2M，外引物各0.25M组成。使用本试剂盒不需要特殊试剂与设备，可快速检测样品中的志贺氏菌基因，且具有特异性高，灵敏度高、鉴定方法简便、检正率高等优点。

Description

基于环介导等温扩增技术的志贺氏菌基因快速诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及基于环介导等温扩增技术检测志贺氏菌的诊断试剂。

背景技术

目前对致病微生物有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和自动生化鉴定为主的国家标准(GB/T4789.7-2003)，到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的优越性，这些新技术突破了传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。

以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。但是目前还未见有应用环介导等温扩增技术检测EB病毒的方法和诊断试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增技术的志贺氏菌基因快速诊断试剂盒，可广泛应用于医疗卫生、食品等领域。

本发明所提供的基于环介导等温扩增技术的志贺氏菌基因快速诊断试剂盒是由由一套引物、DNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色液、阳性对照液组成的试剂盒，所说的一套引物是由二对引物组成，其序列为：

外引物1：ACATGAAGAGCAYGCCAACA，其中Y代表T或C

外引物2：TCCTCACAGCTCTCAGTGG

内引物1：CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA

内引物2：GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT

引物由内引物各2M，外引物各0.25M组成；

所说的反应液是由2mM dNTP，25mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(简称Tris-Cl)，12.5mM氯化钾，12.5mM硫酸铵，10mM硫酸镁，0.125％乙二醇辛基苯基醚(简称TritonX-100)，1M甜菜碱组成；

样品预处理液是由20mM pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(简称Tris-Cl)，2mM EDTA，1.2％乙二醇辛基苯基醚(简称TritonX-100)组成的溶液；

显色液是1000×SYBR Green I溶液；

阳性对照液为志贺氏菌基因组DNA。

本项目基于一种新的恒温核酸扩增法，即环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)。利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(65℃左右)条件下45至90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2-3天，完成鉴定报告需10至15天；利用本发明中的基因诊断试剂盒检测样品中的志贺氏菌的仅需2小时；并且，我们加入显色液，鉴定结果更为直观清晰，检正率高。

本发明可快速诊断样品中是否有志贺氏菌，其优越性可归纳：①只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备；②高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否；③快速、高效扩增：扩增在不到1小时即可完成，且产率高；④灵敏度高：扩增模板仅需10拷贝或更少；⑤鉴定简便：从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，加入显色液后，阳性结果显色为绿色，阴性结果为橙色，检正率高。

下面通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明的应用并不限于实施例

具体实施方式

实施例1、志贺氏菌基因快速诊断试剂盒的制备

(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物。

外引物1：

ACATGAAGAGCAYGCCAACA(Y代表T或C)

外引物2：

TCCTCACAGCTCTCAGTGG

内引物1：

CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA

内引物2：

GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT

内引物1和2各2M，外引物1和2各0.25M。

(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA polymerase(Large Fragment)。置于容器。

(3)配制反应液：配成含2mM dNTP，25mM Tris-Cl，12.5mM氯化钾，12.5mM硫酸铵，10mM硫酸镁，0.125％TritonX-100，1M甜菜碱的溶液。为了操作方便，可将上述(1)的内引物1和2各2M，外引物1和2各0.25M加入到反应液中。

(4)配制样品预处理液(20mM Tris-HCl[pH8.0]，2mM EDTA，1.2％TritonX-100)，置于容器。

(5)购置显色液(1000×SYBR Green I)，置于容器。

(6)提取阳性对照(志贺氏菌基因组DNA)，置于容器。

(7)将上述6个容器装成试剂盒，提供使用说明书，封装。

实施例2志贺氏菌基因快速诊断试剂盒的应用

反应操作：

样品前处理志贺氏菌基因组DNA提取过程：

1、取50μl过夜培养的增菌液于eppendorf管中，1000rpm离心2分钟，去上清液；

2、加入80μl样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；

3、沸水中煮10分钟后立即置于冰上冷却10分钟；

4、10000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA。

环介导等温扩增技术反应过程：

1.在200μl PCR管配制反应体系：反应液10μl，Bst DNA聚合酶0.5μl(8U)，模板DNA 2μl。

2.将配制好的PCR管于65℃反应1.5h

反应后处理

加入显色液，鉴定结果更为直观清晰。反应产物中加入1μl显色液，混匀，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。

                           序列表

<110>深圳市第二人民医院

<120>基于改进环介导等温扩增技术的志贺氏菌基因快速诊断试剂盒

<160>4

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>志贺氏菌(Shigellae spp.)

<220>

<221>misc_feature

<223>Y代表T或者C

<400>1

ACATGAAGAGCAYGCCAACA

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>志贺氏菌(Shigellae spp.)

<220>

<221>misc_feature

<400>2

TCCTCACAGCTCTCAGTGG

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>志贺氏菌(Shigellae spp.)

<220>

<221>misc_feature

<400>3

CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA

<210>4

<211>43

<212>DNA

<213>志贺氏菌(Shigellae spp.)

<220>

<221>misc_feature

<400>4

GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT

Claims (1)

1、一种志贺氏菌基因快速诊断试剂盒，其特征在于是由一套引物、DNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色液、阳性对照液组成的试剂盒，所说的一套引物是由二对引物组成，其序列为：

外引物1：ACATGAAGAGCAYGCCAACA，其中Y代表T或C

外引物2：TCCTCACAGCTCTCAGTGG

内引物1：CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA

内引物2：GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT

引物由内引物各2M，外引物各0.25M组成；

所说的反应液是由2mM dNTP，25mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，12.5mM氯化钾，12.5mM硫酸铵，10mM硫酸镁，0.125％乙二醇辛基苯基醚，1M甜菜碱组成；

样品预处理液是由20mM pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，2mM EDTA，1.2％乙二醇辛基苯基醚组成的溶液；

显色液是1000×SYBR Green I溶液；

阳性对照液为志贺氏菌基因组DNA。