CN101570795B

CN101570795B - 基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因诊断的引物及其在制备快速诊断试剂盒的应用

Info

Publication number: CN101570795B
Application number: CN2009101455179A
Authority: CN
Inventors: 曹以诚; 杜正平; 谭慧媚; 陈洵; 邓小玲; 柯昌文
Original assignee: GUANGZHOU HUAFENG BIOTECH CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU HUAFENG BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2008-05-30
Filing date: 2009-05-26
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2029-05-26
Also published as: CN101302553A; CN101570795A

Abstract

本发明提供一种基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒由两对引物、DNA聚合酶、反应液、裂解液1、裂解液2、稳定液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中。本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性。本发明的基因快速诊断试剂盒快速、高效、灵敏度高，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备。本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，更加明显可靠。

Description

基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因诊断的引物及其在制备快速诊断试剂盒的应用

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

目前对结核分歧杆菌有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和自动生化鉴定为主的国家标准(GB/T4789.7-2003)，到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法[食品安全检测与现代生物技术，化学工业出版社，2004年]。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。

以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测结核分歧杆菌的基因快速诊断试剂盒。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、使用方便、检测快速高效、灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒，该试剂盒是基于环介导等温扩增技术来检测结核分歧杆菌的。

本发明的另一个目的是提供上述结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒的检测方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

一、本发明的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、Bst DNA聚合酶、裂解液1、裂解液2、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中，其中：

所述两对引物为：

外引物F3：GGCTGGTCTCTGGCGTT，如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3：GGCCTATACAAGACCGAGCT，如SEQ ID NO：2所示；

内引物FIP：GCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGTAGGCAGCCT，如SEQ ID NO：3所示；

内引物BIP：GTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGGCAAGCCCT，如SEQ ID NO：4所示；

上述反应液每1L中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-Cl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol。优选的比例是：每1L中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl、12.5mmol氯化钾、12.5mmol硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.25mol。

上述裂解液1每1L中含有10～20mmol pH8.3的Tris-HCl、50～100mmol KCl、2.5～5mmol MgCl₂、5～10ml Triton X-100、5～10ml吐温-20和0.1～0.2g明胶。

上述裂解液2为蛋白酶K。

上述阳性对照为结核分歧杆菌基因组DNA。

上述显色液优选为SYBR Green I或EvaGreen。

上述稳定液优选为石蜡油。

二、本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液无菌分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

三、本发明基因快速诊断试剂盒的检测方法

1、样品处理：

将待测痰样液化后于离心管中离心，去上清，收集沉淀；在裂解液1中加入裂解液2，吹打混匀后，加入前述沉淀中，水浴裂解反应，反应结束后离心，上清即为样品模板DNA；

上述痰样液化所用的液化试剂为质量百分数4％NaOH溶液或胰酶，液化至样品中无痰丝即可；

上述水浴裂解反应中，水浴温度为55～60℃，裂解反应时间为60min～90min。

2、环介导等温扩增技术反应过程

在反应管中加入反应液38～40体积％、Bst DNA聚合酶0.9～1.8体积％、稳定液52～54.5体积％、样品模板DNA 4.5～9体积％，63～65℃恒温反应45～90min。所述体积百分比是指占四个组分总体积的体积百分比。

3、反应后处理

在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。

本发明所说的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)快速检测结核分歧杆菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63～65℃)条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～ 15天；采用本发明的基因快速诊断试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应液中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的基因快速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的基因快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的基因快速诊断试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。

附图说明

图1为样品LAMP检测结果；

1为阳性对照；2为阴性对照；3-22为20例结核病人血清样品；23-24为正常人血清样品。

图2为样品LAMP扩增产物电泳结果；

M为Marker；1为阳性对照；2为阴性对照；3-16和17-22为20例结核病人血清样品；23-24为正常人血清样品。

具体实施方式

实施例1试剂盒的制备

(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：

外引物F3：GGCTGGTCTCTGGCGTT，如SEQ ID NO：1所示；

外引物B3：GGCCTATACAAGACCGAGCT，如SEQ ID NO：2所示；

(2)购置DNA聚合酶：BstDNA聚合酶置于容器。

(3)配制反应液：反应液按每1L中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl、12.5mmol氯化钾、12.5mmol硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.25mol配制，置于容器。

(4)配制裂解液1：裂解液1按每1L中含有10mmol pH8.3的Tris-HCl、50mmol KCl、2.5mmol MgCl₂、5ml Triton X-100、5ml吐温-20和0.1g明胶配制。

(5)配制上述裂解液2：裂解液2按1ml含20mg蛋白酶K配制。

(6)购置稳定液：石蜡油，置于容器。

(7)购置显色液：SYBR Green I，置于容器。

(8)提取阳性对照：结核分歧杆菌基因组DNA，置于容器。

(9)将上述8个容器装成试剂盒，封装。

制备工艺简述如下：

3、将稳定液分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

实施例2试剂盒的制备

反应液按每1L中含有1.6mmol dNTP、20mmol Tris-Cl、10mmol氯化钾、10mmol硫酸铵、8mmol硫酸镁、1ml TritonX-100、0.8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6mol和外引物F3/B3各0.2mol配制，置于容器。

裂解液1按每1L中含有20mmol pH8.3的Tris-HCl、100mmolKCl、5mmol MgCl₂、10ml Triton X-100、10ml吐温-20和0.2g明胶配制。

显色液为EvaGreen。

其他同实施例1。

实施例3 结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒的应用

(1)实验目的

评价广州华峰生物科技有限公司研制的结核分枝杆菌LAMP基因快速检测试剂盒(实施例1)的灵敏度、特异性和准确度。了解临床样品的处理等对试剂盒检测结果的影响，为评价该产品的实用性提供依据。

(2)参比试剂的选择

选择东莞市传染病医院日常检测中使用的常规试剂，深圳市匹基生物工程有限公司生产的结核分枝杆菌荧光定量PCR检测试剂盒为对照。

考核的试剂为广州华峰生物科技有限公司研制的结核分枝杆菌LAMP基因快速检测试剂盒(实施例1)。

(3)研究对象的选择

选择医院方提供的已经过对照试剂确认为阳性的20份血清样品的DNA提取产物，及2份健康人血清样品的DNA提取产物；DNA提取由医院方完成，使用的是匹基生物工程有限公司的试剂盒方法提取。

(4)LAMP反应操作

LAMP反应操作按广州华峰生物科技有限公司研制的结核分枝杆菌LAMP基因快速检测试剂盒说明书进行，在金属浴中完成65℃保温1h，时间误差1～2min；由广州华峰生物科技有限公司技术员操作。

(5)对照实验

同时由医院方技术员对相同的样品进行对照实验：采用匹基生物工程有限公司的结核分枝杆菌荧光定量PCR方法检测，并最终依据卫生部发布的《传染性肺结核诊断标准及处理原则》要求对样品进行结核杆菌的分离培养及镜检等确认程序确认。

(6)结果：

荧光定量PCR检测结果为20例阳性且拷贝数均在10⁵以上(结果由医院方保留)；

使用LAMP方法检测结果见表1、图1和图2，同样20例均为阳性。图1中，若反应管与对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管显现橙色则为阴性。图2为图1的LAMP方法检测结果电泳图。此次实验结果表明设计的引物及组装的试剂盒(实施例1)可以检测到样品中的结核杆菌。

表1

基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法序列表.txt

SEQUENCE LISTING

<110>广州华峰生物科技有限公司

<120>基于环介导等温扩增技术的结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ggctggtctc tggcgtt 17

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ggcctataca agaccgagct 20

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gcctctacca gtactgcggc ttttgagcgt agtaggcagc ct 42

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

gttgaaccag tcgacccagc gttttaaccc ggcaagccct 40

Claims

1.一种结核分歧杆菌基因快速诊断的引物，其特征在于所述引物为两对引物，

上述两对引物为：

外引物F3：GGCTGGTCTCTGGCGTT；

外引物B3：GGCCTATACAAGACCGAGCT；

内引物FIP：GCCTCTACCAGTACTGCGGCTTTTGAGCGTAGTAGGCAGCCT；

内引物BIP：GTTGAACCAGTCGACCCAGCGTTTTAACCCGGCAAGCCCT。

2.如权利要求1所述的结核分歧杆菌基因快速诊断的引物在制备结核分歧杆菌基因快速诊断试剂盒中的应用。