CN101082580A - 环介导等温扩增技术的副溶血弧菌基因快速诊断试剂盒 - Google Patents
环介导等温扩增技术的副溶血弧菌基因快速诊断试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
环介导等温扩增技术的副溶血弧菌基因快速诊断试剂盒，涉及生物检测试剂领域。试剂盒由(1)二对引物；(2)DNA聚合酶；(3)反应液；(4)样品预处理液；(5)荧光染料；(6)阳性对照液组成，以上六种液体分别置于容器中，其中所说的(1)引物有四套。试剂盒的优点：不需要特殊试剂与设备；高特异性：阳性率可达大于99.9％假阳性率小于0.1％；灵敏度高；鉴定简便：通过肉眼观察鉴定；用途广：可广泛用于食品、药品、化妆品、及其它们的原辅料质量控制的安全快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及用于环介导等温扩增技术检测样品副溶血弧菌的基因分子诊断试剂。
背景技术
目前对致病副溶血弧菌的检测方法，主要是采用国家标准(GB/T4789.7-2003)，以病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和自动生化鉴定方法。另也有报道用特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法[食品安全检测与现代生物技术，化学工业出版社，2004年]。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对副溶血弧菌进行分离提纯，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。
等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增基因技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，简称LAMP技术)在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性(见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，AminoN，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic AcidsRes.2000 Jun 15；28(12)：E63.)。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检样品进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应；步骤四、分析判断反应产物结果。但是，在实际应用中，对于特异性引物的设计和其检测试剂盒的制备是非常复杂的，所以环介导等温扩增技术还未能推广于食品、药品、医疗卫生等领域，用于检测样品中的副溶血弧菌，也未见有用于该技术于检测副溶血弧菌的基因诊断试剂盒。
发明内容
本发明目的是提供一种基于环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplication of DNA，简称LAMP)，快速检测样品副溶血弧菌的基因诊断试剂盒，可广泛用于食品、药品、医疗卫生等领域。
本发明所提供的基因诊断试剂盒是基于环介导等温扩增技术的副溶血弧菌基因快速诊断试剂盒，是由(1)二对引物；(2)DNA聚合酶；(3)反应液；(4)样品预处理液；(5)荧光染料；(6)阳性对照液组成，以上六种液体分别置于容器中，其中所说的(1)引物有四套：
一、外引物1：CCGTCAGCGTTGTGAAGC
外引物2：ACCGTTGGAGAAGTGACCTA
内引物1：CGTTGCTCCAGATCGTGTGGTTTTTTCGAACGAGAACGCAGACATT
内引物2：AAGTGGTTGCACTCGGTGACATTTTTTAGGGAAGCGCCATTGTG
或二、外引物1：CGCTGACAATCGCTTCTCAT
外引物2：GGTTCTTCGCTTTGGCAATG
内引物1：AAGCTGTCACCGAGTGCAACCTTTTGAGCAACGACGCAGCAAT
内引物2：CGCATCACAATGGCGCTTCCTTTTAACCGTTGGAGAAGTGACCT
或三外引物1：ATCTGTCCCTTTTCCTGC
外引物2：CGCTGCCATTGTATAGTCTT
内引物1：TTACGGTTTGTCCAAAAGTCAGAGATTTTAGATATTGTTTGTTGTTCGAGAT
内引物2：ATGGTCAATCAGTATTCACAACGTTTTTATGTTCACAGTCATGTAGGATG
或四外引物1：GTCTCTGACTTTTGGACAAAC
外引物2：AACACAGCAGAATGACCG
内引物1 GTACCTGACGTTGTGAATACTGATTTTTTCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTAC
内引物2：TGACATCCTACATGACTGTGAACATTTTTCTTATAGCCAGACACCGC
(2)DNA聚合酶为Bst DNA polymerase(Large Fragment)；
(3)反应液为80μl 10mM dNTP，50μl 10×ThermoPol Buffer，20μl 150mMMgSO4组成；
(4)样品预处理液为20mM Tris-HCl[pH 8.0]，2mM EDTA，1.2％ TritonX-100；
(5)荧光染料，有多种，优选SYBR Green I；
(6)阳性对照液为沙门氏菌基因组DNA。
试剂盒的制备工艺简述如下：
本发明所说的环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermalampiication of DNA，简称LAMP)，快速检测样品副溶血弧菌的方法是利用BstDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(65℃左右)条件下45至90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2-3天，完成鉴定报告需10至15天；采用本发明中的基因诊断试剂盒检测仅需1小时。并且，本发明的反应液中添加了荧光染料，鉴定结果更为直观清晰。
本发明的有益效果是①.不需要特殊试剂与设备；②.高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否；阳性率可达大于99.9％假阳性率小于0.1％；③.快速、高效扩增：检测时间2小时左右④.灵敏度高：扩增模板仅需10拷贝或更少最低检测极限达到10CFU/ml；标本的检出率达到99％；⑤.鉴定简便：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定。加入荧光染料后，阳性结果显色为绿色，阴性结果为橙色，更加明显可靠；⑥.用途广：可广泛用于食品、药品、化妆品、及其它们的原辅料质量控制的安全快速检测。
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案和有益效果，但本发明的技术应用不限于实施例。
具体实施方式
实施例1、试剂盒的制备
(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：引物可有四套，其中采用的一套引物：
外引物1：CCGTCAGCGTTGTGAAGC
外引物2：ACCGTTGGAGAAGTGACCTA
内引物1：CGTTGCTCCAGATCGTGTGGTTTTTTCGAACGAGAACGCAGACATT
内引物2：AAGTGGTTGCACTCGGTGACATTTTTTAGGGAAGCGCCATTGTG
(2)将上述引物溶于双蒸水，置于引物容器；
(3)购置DNA聚合酶Bst DNA polymerase(Large Fragment)；
(4)配置反应液：80μl 10mM dNTP，50μl 10×ThermoPol Buffer，20μl 150mM MgSO4；
(5)配置样品预处理液：20mM Tris-HCl[pH 8.0]，2mM EDTA，1.2％ TritonX-100；
(6)购置荧光染料：SYBR Green I置于容器；
(7)提取副溶血弧菌标准菌株基因组DNA作为阳性对照液，置于容器；
(8)就将上述六个容器组装成试剂盒，提供使用说明书，封装。
制备工艺简述如下：
实施例2、本发明所提供的基因诊断试剂的应用：
被检样品：将少许食品或体液等被检样品置于增菌液中37℃培养。
一、对被检样品的预处理：按常规方法提取DNA基因：
1、取50μl过夜培养的增菌液于eppendorf管中，1000rpm离心2分钟，弃去上清；
2、加入80μl样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；
3、沸水中煮10分钟后立即冷却10分钟；
4、10000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA。
二、环介导等温扩增技术反应过程：
1.在200ul PCR管配制反应体系：引物混合物1.5μl，反应液5.75μl，Bstpolymerase Large Fragment 0.5μl(8U)，准备好的模板DNA 2μl，加水至11.5μl。
Claims (2)
1、一种环介导等温扩增技术的副溶血弧菌基因快速诊断试剂盒，其特征在于：由(1)二对引物；(2)DNA聚合酶；(3)反应液；(4)样品预处理液；(5)荧光染料；(6)阳性对照液组成，以上六种液体分别置于容器中，其中所说的(1)引物有四套：
一、外引物1：CCGTCAGCGTTGTGAAGC
外引物2：ACCGTTGGAGAAGTGACCTA
内引物1：CGTTGCTCCAGATCGTGTGGTTTTTTCGAACGAGAACGCAGACATT
内引物2：AAGTGGTTGCACTCGGTGACATTTTTTAGGGAAGCGCCATTGTG
或二、外引物1：CGCTGACAATCGCTTCTCAT
外引物2：GGTTCTTCGCTTTGGCAATG
内引物1：AAGCTGTCACCGAGTGCAACCTTTTGAGCAACGACGCAGCAAT
内引物2：CGCATCACAATGGCGCTTCCTTTTAACCGTTGGAGAAGTGACCT
或三外引物1：ATCTGTCCCTTTTCCTGC
外引物2：CGCTGCCATTGTATAGTCTT
内引物1：TTACGGTTTGTCCAAAAGTCAGAGATTTTAGATATTGTTTGTTGTTCGAGAT
内引物2：ATGGTCAATCAGTATTCACAACGTTTTTATGTTCACAGTCATGTAGGATG
或四外引物1：GTCTCTGACTTTTGGACAAAC
外引物2：AACACAGCAGAATGACCG
内引物1 GTACCTGACGTTGTGAATACTGATTTTTTCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTAC
内引物2：_ TGACATCCTACATGACTGTGAACATTTTTCTTATAGCCAGACACCGC
(2)DNA聚合酶为Bst DNA polymerase(Large Fragment)；
(3)反应液为80μl 10mM dNTP，50μl 10×ThermoPol Buffer，20μl 150mMMgSO4组成；
(4)样品预处理液为20mM Tris-HCl[pH8.0]，2mM EDTA，1.2％TritonX-100；
(6)阳性对照液为副溶血弧菌基因组DNA。
2、如权利要求1所说的一种基于环介导等温扩增技术的副溶血弧菌基因快速诊断试剂盒，其特征在于：荧光染料为SYBR Green I。
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