CN101246126A

CN101246126A - 沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法

Info

Publication number: CN101246126A
Application number: CNA2007100309477A
Authority: CN
Inventors: 顿博影; 李琳; 石磊; 王丽; 耿予欢
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2007-10-19
Filing date: 2007-10-19
Publication date: 2008-08-20

Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法，试剂盒包括引物混合液、Bst DNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色剂、阳性对照及阴性对照，其中引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。利用该试剂盒通过提取沙门氏菌基因组DNA、恒温基因扩增反应、判断反应产物结果实现对沙门氏菌高特异性、快速、高灵敏度、简便的检测。

Description

沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测试剂与方法，具体涉及一种沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法。

背景技术

沙门氏菌是食源性致病菌中一个主要的属，在各类细菌性食物中毒事件中，沙门氏菌造成的食物中毒位居前列。它主要是通过食品，特别是动物性食品，比如，蛋、奶以及肉制品等进行传播，引起人类肠胃疾病。沙门氏菌日益威胁着人类的健康，因此，需要建立一种安全可靠、简便快速的检测方法来保证食品的安全。常规的沙门氏菌检测方法包括细菌的增殖培养、生化鉴定和血清学鉴定，一般需要4～6天的时间才能完成，不仅费时而且费力，已经不能满足食品生产的控制要求。

近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测沙门氏菌，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(4～8小时)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实地检测的需要。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR检测方法。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1小时左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。

DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，，LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic Acids Res.2000 Jun 15；28(12)：E63.。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是：1.其特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；2.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法。

为达到本发明的目的，采用以下技术方案：

本发明的一种沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其试剂包括：

——引物混合液：四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4；

——BstDNA聚合酶：浓度为8U/μl；

——反应液：10mM dNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mM MgSO₄＝8∶5∶2；

——样品预处理液：20mMTris-HCl(pH 8.0)，2mMEDTA，1.2％TritonX-100；

——显色剂：荧光染料1×SYBR Green I；

——阳性对照为猪霍乱沙门氏菌基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。

用上述试剂盒检测沙门氏菌的方法包括以下步骤：

(1)待检沙门氏菌基因组DNA提取过程：取过夜培养的增菌液于离心管中，1000rpm离心2分钟，去上清；加入样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；沸水中煮10分钟后立即置于冰上冷却10分钟；10000-12000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA；其中增菌液与样品预处理液的用量比为5∶8；

(2)恒温基因扩增反应：在200ulPCR管配制反应混合液：引物混合物1.5μl，反应液5.5μl，BstDNA聚合酶0.5μl，待检沙门氏菌基因组DNA2μl，加水至11.5μl；设置阳性对照反应时，用猪霍乱沙门氏菌基因组DNA替代待检沙门氏菌基因组DNA，设置阴性对照反应时，用不含模板的反应混合液替代待检沙门氏菌基因组DNA；将配制好的PCR管于65℃反应1.5小时；

(3)分析判断反应产物结果：在(2)中得到产物中加入2.5μl荧光染料SYBR Green I，混匀，静置5min；若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。

本发明的一种沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法有以下有益效果：

1、高特异性：本发明根据沙门氏菌invA基因保守区设计了四条特异性引物：引物序列如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；

应用上述四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达大于99％，假阳性率小于1％；

2、快速、高效扩增：扩增在不到1小时即可完成，且产率高；

3、灵敏度高：最低检测极限达到10CFU/ml，标本的检出率达到99％；

4、鉴定简便：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。

具体实施方式

按下列配方制备沙门氏菌等温基因扩增快速检测试剂盒：

——Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl；

——反应液：80μl10mM dNTP，50μl 10×ThermoPol反应缓冲液，20μl 150mM MgSO₄。

——样品预处理液：20mMTris-HCl(pH 8.0)，2mMEDTA，1.2％TritonX-100。

——显色剂：荧光染料1×SYBR Green I。

——阳性对照为猪霍乱沙门氏菌基因组DNA，，阴性对照为不含模板的反应混合液。

用上述试剂盒按以下方法对沙门氏菌进行检测：

1、沙门氏菌基因组DNA简易提取过程：

(1)取50μl过夜培养的增菌液于离心管中，1000rpm离心2分钟，去上清；

(2)加入80μl样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；

(3)沸水中煮10分钟后立即置于冰上冷却10分钟；

(4)10000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA。

2、环介导恒温扩增(LAMP)反应：

(1)在200ulPCR管配制反应混合液：引物混合物1.5μl，反应液5.75μl，Bst DNA聚合酶0.5μl，模板DNA2μl，加水至11.5μl；设置阳性对照反应时，用猪霍乱沙门氏菌基因组DNA替代待检沙门氏菌基因组DNA，设置阴性对照反应时，用不含模板的反应混合液替代待检沙门氏菌基因组DNA；

(2)将含有配制好反应混合液的PCR管于65℃反应1.5小时。

3、分析判断反应产物结果：

在反应产物中加入2.5μl荧光染料(SYBR Green I)，混匀，静置5min。若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。

引物序列表：

SEQUENCE LISTING

<110>华南理工大学

博影，顿

琳，李

磊，石

<120>沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法

<130>Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino

N，Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic

Acids Res.2000 Jun 15；28(12)：E63.

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>Salmonella

<400>1

cgcaccagct actcgaaag 19

SEQUENCE LISTING

<110>华南理工大学

博影，顿

琳，李

磊，石

<120>沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法

<130>Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino

N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic

Acids Res.2000 Jun 15；28(12)：E63.

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Salmonella

<400>1

cggcgaagaa cgtaatgtct 20

SEQUENCE LISTING

<110>华南理工大学

博影，顿

琳，李

磊，石

<120>沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法

<130>Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T， Watanabe K，Amino

N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic

Acids Res.2000 Jun 15；28(12)：E63.

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>Salmonella

<400>1

ccaccagtag ccgtcaatgg tggcgaccga ttgggaatgg 40

SEQUENCE LISTING

<110>华南理工大学

博影，顿

琳，李

磊，石

<120>沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法

<130>Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino

N，Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic

Acids Res.2000 Jun 15；28(12)：E63.

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>41

<212>DNA

<213>Salmonella

<400>1

acaccaacac gtcgcaaaac gtgcgttctc gttcgccaaat 41

Claims

1、一种沙门氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括：

——Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl；

——反应液：10mMdNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mMMgSO₄＝8∶5∶2；

——样品预处理液：20mMTris-HCl(pH8.0)，2mMEDTA，1.2％TritonX-100；

——显色剂：荧光染料1×SYBR Green I；

2、一种用权利要求1所述的试剂盒检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)待检沙门氏菌基因组DNA提取过程：取过夜培养的增菌液于离心管中，1000rpm离心2分钟，去上清；加入样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；沸水中煮10分钟后立即置于冰上冷却10分钟；10000-12000rpm离心2分钟，上清即可作为待检沙门氏菌基因组DNA；其中增菌液与样品预处理液的用量比为5∶8；

(2)恒温基因扩增反应：在200ulPCR管配制反应混合液：引物混合物1.5μl，反应液5.5μl，Bst DNA聚合酶0.5μl，(1)中得到的待检沙门氏菌基因组DNA 2μl，加水至11.5μl；设置阳性对照反应时，用猪霍乱沙门氏菌标准菌株基因组DNA替代待检沙门氏菌基因组DNA，设置阴性对照反应时，用不含模板的反应混合液替代待检沙门氏菌基因组DNA；将含有配制好的反应混合液的PCR管于65℃反应1.5小时；

(3)分析判断反应产物结果：在(2)中得到产物中加入2.5μl显色剂，混匀，静置5min；若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。