CN104630333B - 澳洲坚果过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种澳洲坚果过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法。本发明方法基于环介导等温扩增技术，根据澳洲坚果的特异性靶基因序列AMP2设计6条特异性引物，在具有链置换活性的Bst 2.0 WarmStar DNA聚合酶作用下，在63～65℃对核酸扩增45～60min，扩增效率可以达到109～1010个拷贝数。该方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术及食品安全检测领域，涉及食品中过敏原成分的检测方法，具体涉及澳洲坚果的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
澳洲坚果（Macadamia ternifolia），又名夏威夷果、澳洲胡桃、昆士兰栗，为山龙眼科澳洲坚果属植物。澳洲坚果是常见的、广泛食用的树生坚果，是食品过敏原标识管理的重要种类。国际食品法典委员会制定的国际标准CODEX STAN 1-1985《预包装食品标签通则》明确规定了澳洲坚果及其产品必须在预包装食品标签上予以声明。在国际标准的基础上，世界各国纷纷颁布了各自的法规标准，对澳洲坚果这种过敏原成分的标识管理进行了详明的规定。欧盟委员会指令2007/68/EC和美国《食品过敏原标识和消费者保护法案》（TheFood Allergen Labeling and Consumer Protection Act, FALCPA）均明确规定澳洲坚果属于必须明确标识的食品过敏原。我国在各级食品标准中也作出了类似的规定，例如《 GB7718-2011预包装食品标签通则》、《 GB/T 23779-2009预包装食品中的致敏原成分》、《DB11/Z 521-2008奥运会食品安全 食品过敏原标识标注》、《 DBJ 440100/T 28-2009亚运会食品安全 食品过敏原标识标注》均对此有明确的规定。
食品过敏原标识管理的有效实施，依赖于完善的技术监控手段。其中，食品过敏原检测技术是必不可少的一个组成部分。食品过敏原的检测技术主要分为两类，一类是基于蛋白质的检测方法，一类是基于基因的检测方法。到目前为止，国内外都没有发布过澳洲坚果过敏原成分的标准检测方法，国外对澳洲坚果的检测通常采用基于蛋白质检测的免疫层析快速检测技术，国内对澳洲坚果尚未建立任何达到行业应用水平的通用方法。这种现状已经严重影响了澳洲坚果过敏原标识管理规定的科学有效实施。
现有的商业化澳洲坚果过敏原蛋白质免疫层析快速检测方法，技术上存在明显的局限性，并不能完全满足食品行业生产管理和监管部门技术监督的需要。这种方法的主要技术局限性表现为：现有研究结果表明食品过敏原中能够引起过敏反应的蛋白质组成复杂，澳洲坚果中存在的过敏原蛋白质组成尚未完全调查清楚，因此以过敏原蛋白质为检测目标物质建立的蛋白质检测技术得到的检测结果存在与实际致敏效应发生偏差的可能性；基于免疫学原理的蛋白质检测技术对检测样品提取物的背景干扰具有较高的要求，与此同时由于预包装食品种类、配料成分、加工工艺千差万别造成背景干扰非常复杂，极大局限了澳洲坚果过敏原蛋白质免疫检测方法的实际应用效果。此外，相对于核酸而言，澳洲坚果过敏原蛋白质容易在食品加工过程中发生变性，对基于免疫学原理的蛋白质检测技术造成不可忽略的性能下降。
相比之下，基于基因检测的方法以食品过敏原的特异性基因片段为检测对象，通过食品中是否存在过敏原所属物种的保守基因片段来判断是否含有某种特定的过敏原成分。由于核酸的稳定程度比蛋白质高，在食品加工过程中不易被破坏，因此这类技术可以更加稳定的检测出微量的过敏原成分。现有常用的基因检测方法为实时荧光PCR法，但是该方法需要使用大型的仪器设备、耗时长、对技术要求高、成本昂贵，并不适用于基层实验室的推广应用。
环介导恒温基因扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称恒温扩增法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要昂贵的特殊设备。与实时荧光PCR方法相比成本更为低廉、操作更为简便，更加适合基层实验室推广应用。
目前尚未有将LAMP法应用于快速检测澳洲坚果的试剂盒方法。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种澳洲坚果过敏原的恒温扩增检测方法。
本发明的另一个目的在于提供一种用于检测澳洲坚果过敏原的恒温扩增试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供一组用于检测澳洲坚果过敏原的特异性恒温扩增引物。
本发明所采取的技术方案是：
一种澳洲坚果过敏原的恒温扩增检测方法，包括以下步骤：
1）根据澳洲坚果过敏原基因AMP2设计特异性恒温扩增检测引物；
2）待检样品DNA在上述引物、Bst 2.0 Warmstar DNA 聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；
3）根据扩增结果判断待检样品中是否存在澳洲坚果过敏原成分。
作为优选的，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：
外引物1：GTGAGTCAGTGCGATAAGAG（SEQ ID No：1）；
外引物2： TCATATCTCCTCTCGCAGC（SEQ ID No：2）；
内引物1：TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC（SEQ ID No：3）；
内引物2：ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT（SEQ ID No：4）；
环引物1：ATCGCCTCTGGCATTGTT（SEQ ID No：5）；
环引物2：CCGACAACGTGATCCACA（SEQ ID No：6）。
步骤2）所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有外引物1和外引物2各2～10μM、内引物1和内引物2各20～60μM、环引物1和环引物2各5～20μM、Bst 2.0 WarmstarDNA聚合酶5～10 U、pH8.8的Tris-HCl 20 mM、KCl 8～12 mM、(NH4)2SO4 8～12 mM、0.08～0.12% Tween-20、dNTPs 1.5～1.7mM、MgSO4 0.6～1.0mM、甜菜碱0.7～0.9M，待检样品DNA2μL。
作为优选的，步骤2）所示恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有外引物1和外引物2各5μM、内引物1和内引物2各40μM、环引物1和环引物2各20μM、Bst 2.0 WarmstarDNA聚合酶8U、pH8.8的Tris-HCl 20 mM、KCl 10 mM、(NH4)2SO4 10 mM、0.1% Tween-20、dNTPs 1.6mM、MgSO4 0.8mM、甜菜碱0.8M，待检样品DNA 2μL。
步骤2）所述恒温扩增反应的程序为：63～65℃恒温反应45～60min。
步骤3）可采用曲线法或显色法判断扩增结果，曲线法：在反应体系中恒温加入1-20 μM SYTO-9使用荧光PCR仪或其它恒温荧光检测仪进行检测，根据扩增曲线判断结果，有“S”型扩增曲线的为阳性，无“S”型扩增曲线的为阴性；显色法：在反应体系中加入500-2000×GeneFinder，根据颜色判断结果，阳性为绿色，阴性为橙色。
一种用于检测澳洲坚果过敏原的恒温扩增试剂盒，其包括6条根据澳洲坚果过敏原基因AMP2设计特异性恒温扩增检测引物。
所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：
外引物1：GTGAGTCAGTGCGATAAGAG（SEQ ID No：1）；
外引物2： TCATATCTCCTCTCGCAGC（SEQ ID No：2）；
内引物1：TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC（SEQ ID No：3）；
内引物2：ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT（SEQ ID No：4）；
环引物1：ATCGCCTCTGGCATTGTT（SEQ ID No：5）；
环引物2：CCGACAACGTGATCCACA（SEQ ID No：6）。
所述试剂盒中还包括以下组分：Bst 2.0 Warmstar DNA聚合酶、pH8.8的Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween-20、dNTPs、MgSO4、甜菜碱、GeneFinder或SYTO-9、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为澳洲坚果标准品或含有澳洲坚果过敏原基因AMP2的重组质粒，所述阴性对照品为ddH2O。
一组用于检测澳洲坚果过敏原的特异性恒温扩增引物，其序列分别如下所示：
外引物1：GTGAGTCAGTGCGATAAGAG（SEQ ID No：1）；
外引物2： TCATATCTCCTCTCGCAGC（SEQ ID No：2）；
内引物1：TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC（SEQ ID No：3）；
内引物2：ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT（SEQ ID No：4）；
环引物1：ATCGCCTCTGGCATTGTT（SEQ ID No：5）；
环引物2：CCGACAACGTGATCCACA（SEQ ID No：6）。
本发明基于环介导等温扩增技术，根据澳洲坚果的特异性靶基因序列AMP2设计的6条引物能特异性识别靶基因序列上的8个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎－环DNA混合物。采用特异性引物及一种具有链置换活性的Bst 2.0 WarmStar DNA聚合酶，在63～65℃对核酸进行扩增反应，在45～60min的短时间内扩增效率可以达到109～1010个拷贝数。该方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果：
（1）快速高效：整个扩增只用45～60min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
（2）操作简便：不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部检测仪就能反应和检测，条件比较温和；
（3）高特异性：本发明根据过敏原的外源基因与内源基因结合处设计了6条特异性引物，应用上述6条引物，扩增靶序列的8个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
（4）高灵敏度：最低检测极限可达到10个拷贝；
（5）鉴定简便：加入500-2000×GeneFinder，根据颜色判断结果，阳性为绿色，阴性为橙色；在反应体系中恒温加入1-20 μM SYTO-9使用荧光PCR仪（如ABI7500）或其它恒温荧光检测仪(Genie Ⅱ)进行检测，根据扩增曲线判断结果，适合现场检测。
附图说明
图1为澳洲坚果过敏原特异性恒温扩增引物筛选图（其中A为第一套引物的扩增情况，B为第二套引物的扩增情况，C为第三套引物的扩增情况）；
图2为澳洲坚果最佳反应体系实验图；
图3为实施例3灵敏度实验结果（曲线法）；
图4为实施例3灵敏度实验结果（显色法，其中，1-2为100%阳性样品，3-4为10%阳性样品，5-6为5%阳性样品，7-8为1%阳性样品，9-10为0.5%阳性样品，11-12为0.1%阳性样品，13-14为0.05%阳性样品，15-16为阴性对照）；
图5为实施例4特异性实验结果（曲线法）；
图6为实施例4特异性实验结果（显色法，其中，1-2为阳性对照，3-4为阴性对照，5-6为1号样品，7-8为2号样品，9-10为3号样品，11-12为4号样品，13-14为5号样品，15-16为6号样品，17-18为7号样品，19-20为8号样品，21-22为9号样品，23-24为10号样品，25-26为11号样品，27-28为12号样品，29-30为13号样品，31-32为14号样品，33-34为15号样品，35-36为16号样品，37-38为17号样品）；
图7为实施例5实际样品检测结果（曲线法）；
图8为实施例5实际样品检测结果（显色法，其中，1-2为阳性对照，3-4为阴性对照，5-6为样品1，7-8为样品2，9-10为样品3，11-12为样品4，13-14为样品5，15-16为样品6，17-18为样品7）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
如无特殊说明，以下实施例中的“%”均指质量百分比。
实施例1 澳洲坚果过敏原特异性恒温扩增引物的设计与筛选
根据澳洲坚果特异基因序列AMP2设计3套恒温扩增引物，每套引物中包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2、环引物1和环引物2。引物筛选采用3套引物中的外引物和内引物进行恒温扩增反应，25μL反应体系如下：
外引物1和外引物2各5μM、内引物1和内引物2各40μM、Bst 2.0 Warmstar DNA聚合酶8U、pH8.8的Tris-HCl 20 mM、KCl 10 mM、(NH4)2SO4 10 mM、0.1% Tween-20、dNTPs1.6mM、MgSO4 0.8mM、甜菜碱0.8M，荧光染料SYTO-910μM、待检样品DNA 2μL，ddH2O补足至25μL。
反应步骤如下：
（1）模板DNA的制备：采用CTAB法提取纯化澳洲坚果标准品DNA；
（2）恒温基因扩增反应：上述25μL反应体系混合后置于荧光PCR仪中实时监控扩增反应，荧光PCR仪反应程序为：Holding Stage为 63℃ 30 s，1个循环；Cycling Stage 为63℃ 15 s，63℃ 45 s，90个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，荧光通道为FAM。设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；
（3）结果判定：根据扩增曲线判断结果，有“S”型扩增曲线的为阳性，无“S”型扩增曲线的为阴性。
检测结果见图1，本实施例中第一套引物70 min后出现扩增，第二套引物出峰时间约在35 min，第三套引物出峰时间约40 min。出峰较早的第二套引物为最优引物组。
第二套检测引物组包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，环引物1和环引物2，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物1：GTGAGTCAGTGCGATAAGAG（SEQ ID No：1）；
外引物2： TCATATCTCCTCTCGCAGC（SEQ ID No：2）；
内引物1：TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC（SEQ ID No：3）；
内引物2：ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT（SEQ ID No：4）。
环引物1：ATCGCCTCTGGCATTGTT（SEQ ID No：5）；
环引物2：CCGACAACGTGATCCACA（SEQ ID No：6）。
实施例2 澳洲坚果过敏原的恒温扩增反应体系的优化
采用上述特异性恒温扩增引物SEQ ID NO:1～6，以Mg2+浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度和反应温度4个条件为变量参数，对恒温扩增反应条件进行优化：
（1）Mg2+浓度优化：设置4个Mg2+浓度梯度依次为0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM；
（2）甜菜碱浓度优化：设置4个甜菜碱浓度梯度依次为0.6M、0.8M、1.0M、1.2M；
（3）dNTPs浓度优化：设置4个dNTPs浓度梯度依次为1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM；
（4）反应温度优化：设置4个反应温度梯度依次为63℃、64℃、65℃。
在反应进行时，采用反应曲线的出峰时间作为评价的指标，对上述参数进行比较。得出最优的恒温扩增反应体系如下：
25μL反应体系：外引物1和外引物2各5μM、内引物1和内引物2各40μM、环引物1和环引物2各20μM、Bst 2.0 Warmstar DNA聚合酶8U、pH8.8的Tris-HCl 20 mM、KCl 10 mM、(NH4)2SO4 10 mM、0.1% Tween-20、dNTPs 1.6mM、MgSO4 0.8mM、甜菜碱0.8M，荧光染料SYTO-9 10μM、待检样品DNA 2μL，ddH2O补足至25μL。
恒温扩增反应程序有曲线法和显色法两种：
曲线法：Holding Stage为 63℃ 30 s，1个循环；Cycling Stage 为63℃ 15 s，63℃ 45 s，45个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，荧光通道为FAM。根据扩增曲线判断结果，有“S”型扩增曲线的为阳性，无“S”型扩增曲线的为阴性。
显色法：将反应管置于63℃反应45min后，加入2μL 1000×GeneFinder荧光染料，根据颜色判断结果，阳性为绿色，阴性为橙色。
按上述优化后条件检测澳洲坚果，检出时间在12 min左右，检测时间可定为45min。
实施例3 灵敏度检测
将澳洲坚果标准品制备成质量浓度分别为100%，10%，5%，1%，0.5%，0.1%，0.05%的待检样品进行检测。
CTAB法提取纯化待检样品中的DNA，然后采用实施例2的方法进行检测。结果判断方法有两种，曲线法：有“S”型扩增曲线的为阳性，无“S”型扩增曲线的为阴性，见图3；显色法：若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性，见图4。
本实施例中，曲线法和显色法均可检出100%、10%、5%、1%、0.5%的澳洲坚果阳性样品，不能检出0.1%和0.05%的阳性样品，两种方法结果相一致。
实施例4 特异性实验
采用实施例2的方法对下面17种样品进行检测，采用CTAB法提取纯化待检样品DNA，设阳性对照（澳洲坚果标准品）和阴性对照（ddH2O）：
检测结果见图5和图6，本实施例中，只有样品1，即澳洲坚果出现扩增，其余样品均未出现扩增，曲线法和显色法的检测结果相一致。
实施例5 实际样品检测
采用实施例2的方法对以下7种样品进行检测，采用CTAB法提取纯化待检样品DNA，设阳性对照（澳洲坚果标准品）和阴性对照（ddH2O）。
检测结果见图7和图8。在本实施例中，只有样品1、2、3、4出现扩增，检测结果与实际样品情况相对应，表明本发明方法稳定可靠，适合于市售食品的检测。
<110> 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 澳洲坚果过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgagtcagt gcgataagag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcatatctcc tctcgcagc 19
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggcagtatt gttgctgacg tgatcctcag acggaatgc 39
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgacgctgc aaggaaatat gttgacattg ctcgtattgc t 41
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atcgcctctg gcattgtt 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgacaacgt gatccaca 18
Claims (8)
1.一种澳洲坚果过敏原的恒温扩增检测方法，包括以下步骤：
1)根据澳洲坚果过敏原基因AMP2设计特异性恒温扩增检测引物；
2)待检样品DNA在上述引物、Bst 2.0 Warmstar DNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；
3)根据扩增结果判断待检样品中是否存在澳洲坚果过敏原成分；
其特征在于，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：
外引物1：GTGAGTCAGTGCGATAAGAG(SEQ ID No：1)；
外引物2：TCATATCTCCTCTCGCAGC(SEQ ID No：2)；
内引物1：TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC(SEQ ID No：3)；
内引物2：ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT(SEQ ID No：4)；
环引物1：ATCGCCTCTGGCATTGTT(SEQ ID No：5)；
环引物2：CCGACAACGTGATCCACA(SEQ ID No：6)。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2)所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有外引物1和外引物2各2～10μM、内引物1和内引物2各20～60μM、环引物1和环引物2各5～20μM、Bst 2.0 Warmstar DNA聚合酶5～10U、pH8.8的Tris-HCl 20mM、KCl8～12mM、(NH4)2SO4 8～12mM、0.08～0.12％Tween-20、dNTPs 1.5～1.7mM、MgSO4 0.6～1.0mM、甜菜碱0.7～0.9M，待检样品DNA 2μL。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤2)所示恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有外引物1和外引物2各5μM、内引物1和内引物2各40μM、环引物1和环引物2各20μM、Bst 2.0 Warmstar DNA聚合酶8U、pH8.8的Tris-HCl 20mM、KCl 10mM、(NH4)2SO410mM、0.1％Tween-20、dNTPs 1.6mM、MgSO4 0.8mM、甜菜碱0.8M，待检样品DNA 2μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述恒温扩增反应的程序为：63～65℃恒温反应45～60min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)采用曲线法或显色法判断扩增结果，曲线法：在反应体系中恒温加入1-20μM SYTO-9使用荧光PCR仪或其它恒温荧光检测仪进行检测，根据扩增曲线判断结果，有“S”型扩增曲线的为阳性，无“S”型扩增曲线的为阴性；显色法：在反应体系中加入500-2000×GeneFinder，根据颜色判断结果，阳性为绿色，阴性为橙色。
6.一种用于检测澳洲坚果过敏原的恒温扩增试剂盒，其包括6条根据澳洲坚果过敏原基因AMP2设计特异性恒温扩增检测引物；
其特征在于，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：
外引物1：GTGAGTCAGTGCGATAAGAG(SEQ ID No：1)；
外引物2：TCATATCTCCTCTCGCAGC(SEQ ID No：2)；
内引物1：TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC(SEQ ID No：3)；
内引物2：ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT(SEQ ID No：4)；
环引物1：ATCGCCTCTGGCATTGTT(SEQ ID No：5)；
环引物2：CCGACAACGTGATCCACA(SEQ ID No：6)。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括以下组分：Bst2.0Warmstar DNA聚合酶、pH8.8的Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween-20、dNTPs、MgSO4、甜菜碱、GeneFinder或SYTO-9、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为澳洲坚果标准品或含有澳洲坚果过敏原基因AMP2的重组质粒，所述阴性对照品为ddH2O。
8.一组用于检测澳洲坚果过敏原的特异性恒温扩增引物，其序列分别如下所示：
外引物1：GTGAGTCAGTGCGATAAGAG(SEQ ID No：1)；
外引物2：TCATATCTCCTCTCGCAGC(SEQ ID No：2)；
内引物1：TGGCAGTATTGTTGCTGACGTGATCCTCAGACGGAATGC(SEQ ID No：3)；
内引物2：ACGACGCTGCAAGGAAATATGTTGACATTGCTCGTATTGCT(SEQ ID No：4)；
环引物1：ATCGCCTCTGGCATTGTT(SEQ ID No：5)；
环引物2：CCGACAACGTGATCCACA(SEQ ID No：6)。
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