CN105238878B - 甘蔗线条花叶病毒rt-lamp引物组、检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甘蔗线条花叶病毒RT‑LAMP引物组、检测方法及其应用，本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据甘蔗线条花叶病毒的CP基因序列设计了相应的RT‑LAMP检测引物组，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，并由此发明了用于检测甘蔗线条花叶病毒的RT‑LAMP检测方法及试剂盒。本发明甘蔗线条花叶病毒的RT‑LAMP检测方法及试剂盒可快速、准确、简便地进行病害鉴定，进而采取适当的防治措施，减少病害带来的损失。

Description

甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP引物组、检测方法及其应用
技术领域
本发明属于甘蔗线条花叶病毒检测技术领域，尤其涉及一种甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP引物组、检测方法及其应用。
背景技术
甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)禾本科病毒属(Poacevirus)，是引起甘蔗产生花叶症状的一种新病原。目前世界上仅在印度、斯里兰卡、泰国、越南和印度尼西亚、法国以及中国有报道。在我国，对SCSMV的研究相对较少。2010年，许东林等在我国引自巴基斯坦的甘蔗种质中检测到该病毒并对其全序列进行了测定分析，是国内有关该病毒的首次报道。贺振等自2009年起对云南省甘蔗花叶病病原进行采样鉴定，鉴定结果发现SCSMV已成为云南省甘蔗产区引起甘蔗花叶病的主要病原之一，部分地区阳性检出率高达59％。秦碧霞等对广西甘蔗花叶病病原鉴定后发现，SCSMV在广西也有发生。
目前，针对甘蔗线条花叶病毒的检测主要有电镜观察法、分子生物学方法、血清学方法，这些方法通常需要配备昂贵的仪器(PCR仪、电镜等)，且较为费时。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种先进的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温(65℃左右)条件下保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色的方法在数分钟内即可观察结果。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。
LAMP作为一种崭新的DNA扩增技术，具有简便、快速、特异性强等优点，已广泛应用于人类或动植物的各种病毒、细菌等引起的疾病或病害的快速检测和快速诊断。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简便、快速、特异性强的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP引物组、检测方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测引物组，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，其分别具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的序列。
本发明还提供一种甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法，是利用RT-LAMP检测引物组，在63℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60min，扩增完成后80℃再反应5min，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧光染色，鉴定植株样品是否感染甘蔗线条花叶病毒；所述的RT-LAMP检测引物组包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，其分别具有SEQ IDNo.1至SEQ ID No.4所示的序列。
作为优选，所述的外侧引物对、内侧引物对的浓度比为1:4。
作为优选，所述的外侧引物对、内侧引物对的浓度分别为0.2μM和0.8μM。
此外，本发明还提供一种甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括A试液、B试液和C试液。
作为优选，所述的A试液为LAMP反应体系，其中含有RT-LAMP buffer、 MMLV-Bst混合液、RNase Inhibitor、RNase-Free Water和RT-LAMP检测引物组。
作为优选，所述的A试液中含RT-LAMP buffer 4μL、MMLV-Bst混合液1.5μL、RNase-Free Water 11.5μL、RNase Inhibitor 1μL、RT-LAMP检测引物组5μL，其中F3和B3引物各0.5μL，终浓度均为0.2μM；FIP和BIP引物各2μL，终浓度均为0.8μM；所述的引物F3、B3、FIP和BIP分别具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的序列。
作为优选，所述的B试液含甘蔗线条花叶病毒RNA；所述的C试液为RNase freeWater。
作为优选，所述的B试液作为阳性对照；所述的C试液作为阴性对照。
所述的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP引物组、检测方法或试剂盒在感病甘蔗及其它作物上检测甘蔗线条花叶病毒的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明独创性地采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据甘蔗线条花叶病毒CP基因序列设计了相应的RT-LAMP检测引物组，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，并由此发明了用于检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP检测方法及试剂盒。
2.使用本发明的甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP检测方法及试剂盒，仅需通过对甘蔗等疑似感病植株样品进行RNA提取并进行环介导等温扩增，即可快速检测出是否感染甘蔗线条花叶病毒，方便基层快速、准确、简便地进行病害诊治，进而采取适当的防治措施，减少病害带来的损失。
附图说明
图1为不同反应温度条件下RT-LAMP扩增结果的电泳图；
其中：M-DL2000标准分子量；1-阴性对照；2-60℃；3-61℃；4-62℃； 5-63℃；6-64℃；7-65℃。
图2为RT-LAMP灵敏性实验电泳图；
其中：M-DL2000标准分子量；1-阴性对照；2-167.9ng/μL；3-167.9×10-1ng/μL；4-167.9×10-2ng/μL；5-167.9×10-3ng/μL；6-167.9×10-4ng/μL；7-167.9×10-5ng/μL；8-167.9×10-6ng/μL；9-167.9×10-7ng/μL；10-167.9×10-8ng/μL。
图3为RT-PCR灵敏性实验电泳图；
其中：M-DL2000标准分子量；1-阴性对照；2-167.9ng/μL；3-167.9×10-1ng/μL；4-167.9×10-2ng/μL；5-167.9×10-3ng/μL；6-167.9×10-4ng/μL；7-167.9×10-5ng/μL；8-167.9×10-6ng/μL；9-167.9×10-7ng/μL；10-167.9×10-8ng/μL。
图4为RT-LAMP检测甘蔗样品电泳图；
其中：M-DL2000标准分子量；1-阴性对照；2-阳性对照；3-7为采集的甘蔗样品。
图5为SYBGreen荧光染料检测RT-LAMP扩增产物结果图；
其中：1-阴性对照；2-阳性对照；3-7为采集的甘蔗样品。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP引物设计
根据NCBI上已报道的甘蔗线条花叶病毒CP基因序列(JX467699，JN163911)，结合对甘蔗线条花叶病毒的测序结果，利用VECTOR NTI alignX进行比对分析，选取基因序列保守区域9125-9315nt，利用在线引物设计软件Primer Explorer V4设计引物，最后选取以下RT-LAMP检测引物组：
外侧引物对F3和B3：
上游引物F3：AAGTGGACGAAAGCTGTGTT(见序列表SEQ ID No.1)；
下游引物B3：TTCCCGCTACGAACCGAG(见序列表SEQ ID No.2)。
内侧引物对FIP和BIP：
上游引物FIP：
GGCCCCATTTCGAACTCCACTTGGATGGAGCTGATGGGACA(见序列表SEQ ID No.3)；
下游引物BIP：
AACGCCAAACCTGGTATTCGCGCTGAACCCACTTGTACGCC(见序列表SEQ ID No.4)。
实施例2：甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP反应体系的建立
通过设置不同终浓度的外侧(F3/B3)、内侧(FIP/BIP)引物配比，确定组合为0.2uM:0.8uM，温度(60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，结果参见图1)，优化获得最佳的反应参数，从而建立甘蔗线条花叶病毒的检测体系，优化的反应体系(25μL)见表1。
表1 优化的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP反应体系
RT-LAMP buffer 4μL
F3引物(终浓度0.2μM) 0.5μL
B3引物(终浓度0.2μM) 0.5μL
FIP引物(终浓度0.8μM) 2μL
BIP引物(终浓度0.8μM) 2μL
模板RNA 2μL
MMLV-Bst混合液 1.5μL
RNase Inhibitor 1μL
ddH<sub>2</sub>O 11.5μL
总体积 25μL
按表1组成混匀反应物，在63℃下恒温反应60min，80℃反应5min终止RT-LAMP反应。取2μL扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶(加入1.2‰的gel-red荧光染料)在0.5x TAE电泳缓冲液和120V电压条件下电泳30-40min，电泳完成后将凝胶放置于荧光成像系统下观察，阳性扩增产物有阶梯状扩增条带，阴性对照无扩增条带。或者取10μL扩增产物加入0.5mLSYBGreen荧光染料(北京索莱宝生物科技有限公司)，混匀后观察，阳性扩增产物有黄色荧光产生，无扩增及阴性对照将保持染料本身颜色(红色)。
其中，模板RNA参照TRNzol Reagent(天根生化科技有限公司)方法进行甘蔗植物样品总RNA的提取。实施例2的样品均来自甘蔗感病植株。
实施例3：RT-PCR与RT-LAMP灵敏性实验
为了确定RT-PCR和RT-LAMP两种方法检测甘蔗线条花叶病毒的灵敏性，将提取的甘蔗总RNA经分光光度计(NanoDrop 1000)(Thermo Scientific,USA)测定浓度(167.9ng/μL)，后用RNAase Free水进行10倍比稀释，分别取RNA倍比稀释液2μL作为RT-LAMP反应的模板，参照实施例2的反应体系进行反应。反应完成后，取2μL扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶(加入1.2‰的gel-red荧光染料)在0.5x TAE电泳缓冲液和120V电压条件下电泳60min，电泳完成后将凝胶放置于荧光成像系统下观察(结果见图2)。
同时，以RT-LAMP反应的总RNA的倍比稀释液作为RT-PCR的模板，以B3/F3引物作为RT-PCR的反应引物，参照PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit(宝生物工程(大连)有限公司)使用说明对样品进行RT-PCR扩增，反应完成后，同样取2μL扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶(加入1.2‰的gel-red荧光染料)在0.5x TAE电泳缓冲液和120V电压条件下电泳30-40min，电泳完成 后将凝胶放置于荧光成像系统下观察(结果见图3)。
结果显示，RT-LAMP方法可以检测到浓度为167.9×10-5ng/μL感病甘蔗叶片总RNA中的SCSMV，而RT-PCR仅能检测到浓度为167.9×10-3ng/μL感病甘蔗叶片总RNA中的SCSMV，检测灵敏度RT-LAMP是RT-PCR的100倍。
实施例4：RT-LAMP检测甘蔗样品
采集甘蔗样品，提取总RNA后进行RT-LAMP检测，反应完成后，取2μL扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶(加入1.2‰的gel-red荧光染料)在0.5x TAE电泳缓冲液和120V电压条件下电泳30-40min，电泳完成后将凝胶放置于荧光成像系统下观察(结果见图4)。另取10μLLAMP产物加入0.5μL SYBGreen荧光染料(北京索莱宝生物科技有限公司)混匀，放置5min后观察，结果显示阳性的扩增产物显示黄色荧光，如样品2、3、4、6；无扩增或阴性对照保持染料本身颜色(红色)，如样品1、5、7(详见图5)。
实施例5：甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒
根据以上研究结果，组装检测试剂盒，以方便扩大使用。
甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括A试液、B试液和C试液。
其中，A试液为LAMP反应体系，含有RT-LAMP buffer(NEB(北京)有限公司产品)、MMLV-Bst混合液(Thermo Fisher Scientific与NEB(北京)有限公司产品，实验室自行混配)、RNase Inhibitor(宝生物工程(大连)有限公司产品)、RNase-Free Water、RT-LAMP检测引物组；每剂A试液含RT-LAMP buffer 4μL、MMLV-Bst混合液1.5μL、RNase-Free Water11.5μL、RNase Inhibitor 1μL、RT-LAMP检测引物组5μL，其中F3和B3引物各0.5μL，终浓度均为0.2μM；FIP和BIP引物各2μL，终浓度均为0.8μM；引物F3、B3、FIP和BIP分别具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.4的碱基序列；
B试液含甘蔗线条花叶病毒RNA，作为阳性对照；
C试液为RNase free Water，作为阴性对照。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
。

Claims (8)

1.甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测引物组，其特征在于：包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，其分别是为SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的序列。
2.一种甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于：利用RT-LAMP检测引物组，在63℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60min，扩增完成后80℃再反应5min，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧光染色，鉴定植株样品是否感染甘蔗线条花叶病毒；所述的RT-LAMP检测引物组包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，其分别是为SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的序列。
3.根据权利要求2所述的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于：所述的外侧引物对、内侧引物对的浓度比为1:4。
4.根据权利要求2或3所述的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于：所述的外侧引物对、内侧引物对的浓度分别为0.2μM和0.8μM。
5.一种甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：包括A试液、B试液和C试液；所述的A试液为LAMP反应体系，其中含有RT-LAMP buffer、MMLV-Bst混合液、RNaseInhibitor、RNase-Free Water和RT-LAMP检测引物组；所述的B试液含甘蔗线条花叶病毒RNA；所述的C试液为RNase free Water；所述的RT-LAMP检测引物组，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，其分别是为SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的序列。
6.根据权利要求5所述的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的A试液中含RT-LAMP buffer 4μL、MMLV-Bst混合液1.5μL、RNase-Free Water 11.5μL、RNaseInhibitor 1μL、RT-LAMP检测引物组5μL，其中F3和B3引物各0.5μL，终浓度均为0.2μM；FIP和BIP引物各2μL，终浓度均为0.8μM；所述的引物F3、B3、FIP和BIP分别是为SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的序列。
7.根据权利要求5或6所述的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的B试液作为阳性对照；所述的C试液作为阴性对照。
8.根据权利要求1所述的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测引物组、权利要求2所述的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法或权利要求5所述的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒在感病甘蔗上检测甘蔗线条花叶病毒的应用。
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