CN108411033B - 一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的rt-lamp试剂盒和方法 - Google Patents

一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的rt-lamp试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体公开了一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的RT‑LAMP试剂盒和方法。所述试剂盒包含一组检测甘蔗线条花叶病毒的RT‑LAMP引物组，由一对外引物对F3、B3和一对内引物FIP、BIP组成；所述F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示。所述检测方法包括提取待测样品总核酸、利用上述试剂盒进行RT‑LAMP反应、荧光染色鉴定待测样品是否感染甘蔗线条花叶病毒等步骤。本发明试剂盒具有特异性强、灵敏度高的优点，能准确鉴定感染甘蔗线条花叶病毒的植株；检测方法操作简便，适合甘蔗线条花叶病毒的田间快速检测。

Description

一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP试剂盒和 方法
技术领域
本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体地，涉及一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP试剂盒和方法。
背景技术
甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV）是引起甘蔗花叶病的主要病原之一，在世界不少蔗区均有报道，严重威胁甘蔗产业的发展。SCSMV的症状主要表现为叶色失绿，出现黄绿相间不规则嵌纹、条斑或斑驳，大小不一，布满全叶。SCSMV可通过机械传播，也可通过染病植株的无性繁殖传播。因此，加强引种检疫，防止病毒随种苗远距离传播是防治甘蔗线条花叶病毒的主要方法。
目前，SCSMV的检测方法主要包括电子显微镜镜检、血清学方法和分子生物学技术，其中，RT-PCR技术是现在最常用的检测病毒的分子生物学检测方法。RT-PCR技术虽然能检测出甘蔗是否感染SCSMV，但该方法需要PCR仪、电泳仪及凝胶成像系统等昂贵的专业仪器及分子生物学专业实验人员操作，限制了该检测方法的推广应用。环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者Notomi等发明的一种新型体外等温扩增特异核酸判断的技术，随着LAMP技术的发展，已成功应用LAMP技术检测病毒、细菌、真菌以及寄生虫等病原。LAMP检测技术具有快速、高效、简便、特异性强和敏感性高等优点，肉眼即可判断其结果，从而简化了检测过程，缩短了检测时间，且不需要昂贵的检测设备。
目前虽已有将RT-LAMP技术应用于SCSMV的检测，但由于SCSMV早期症状不明显或与甘蔗花叶病毒、高梁花叶病毒症状相近，对于症状不明显的甘蔗小苗或甘蔗种茎一般难以准确诊断其是否感染或携带SCSMV。因此，探索能快速准确且特异性地检测甘蔗线条花叶病毒的技术，对甘蔗引种检疫、病害早期诊断及抗病品种快速筛选等十分重要。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一组检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP引物组，该引物组是针对SCSMV的多聚蛋白基因核苷酸保守序列及其与甘蔗花叶病毒、高梁花叶病毒相应区域核苷酸差异序列设计得到，特异性强，准确率高。
本发明的另一目的在于提供上述RT-LAMP引物组在制备甘蔗线条花叶病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一组检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP引物组，由一对外引物对F3、B3和一对内引物FIP、BIP组成；所述F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示。
所述RT-LAMP引物组是针对甘蔗线条花叶病毒的多聚蛋白基因（Polyproteingene）核苷酸保守序列及其与甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒的相应区域核苷酸的差异序列设计得到。因此在检测过程中不会检测出甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗黄叶病毒、甘蔗杆状病毒、甘蔗宿根矮化病菌和甘蔗黑穗病菌等甘蔗主要病害的病原菌，特异性强，准确率高。
本发明还请求保护上述RT-LAMP引物组在制备甘蔗线条花叶病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP试剂盒，包含上述检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP引物组。
优选地，所述外引物对和内引物对的终浓度比为1：8。更优选地，所述外引物对和内引物对的终浓度分别为0.2mM和1.6mM。
优选地，所述试剂盒还包括反应预混液、超纯水、阴性对照液、阳性对照液。所述阴性对照液为不含SCSMV的甘蔗叶片总核酸，所述阳性对照液为含SCSMV的甘蔗叶片总核酸。
优选地，所述试剂盒25μL反应体系为：反应预混液12.5μL，模板2.5μL，F3和B3终浓度0.2mmol/L，FIP和BIP终浓度1.6mmol/L，超纯水6μL。
优选地，所述试剂盒的反应条件为65℃反应1h，4℃保存。
本发明还请求保护一种甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：
S1.提取待测样品总核酸；
S2.采用上述试剂盒进行逆转录环介导等温扩增反应；
S3.将反应产物进行荧光染色，根据颜色来判断检测结果：若呈黄色则待测样品中含有甘蔗线条花叶病毒，若呈红色则待测样品中不含甘蔗线条花叶病毒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）特异性强：本发明所提供的引物组是针对甘蔗线条花叶病毒的多聚蛋白基因核苷酸保守序列及其与甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒的相应区域核苷酸的差异序列设计得到，因此在检测过程中不会检测出甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗黄叶病毒、甘蔗杆状病毒、甘蔗宿根矮化病菌等甘蔗主要病害的病原菌，特异性强，准确率高。
（2）灵敏度高：本发明所提供的甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法灵敏度较RT-PCR提高10倍，最低可检测出浓度为8.0×10-4ng/μL感病甘蔗叶片总RNA中的 SCSMV，可检测出无症状甘蔗苗是否携带甘蔗线条花叶病毒。
（3）减少假阳性：所有试剂均在反应前加入离心管中，避免扩增后开盖加反应液，产生气溶胶污染，大大减少假阳性的出现。
（4）操作便捷快速、结果直观：本发明仅需采用常规的CTAB法提取样品总核酸，不需要PCR仪等昂贵的专业仪器，仅需一台廉价的恒温仪器，大大降低实验成本，且易操作，无需考虑提取样品总RNA时易污染的问题；没有繁琐的操作步骤，大大缩短操作时间，可在1h内快速得到检测结果；检测结果可通过肉眼观察试剂颜色的变化直接判断，无需电泳检测及凝胶成像。本发明所提供的检测方法适用于甘蔗引种检疫、脱毒种苗质量检测及甘蔗线条花叶病田间早期检测等，可大范围推广应用。
附图说明
图1为实施例1中4组引物组的RT-LAMP检测结果和电泳图谱。
图2为实施例1中不同反应条件下SCSMV标准样品的检测结果。
图3为实施例2中试剂盒对不同样品的检测结果；其中，+：SCSMV阳性对照；-：SCSMV阴性对照；SCSMV：甘蔗线条花叶病毒；SCMV：甘蔗花叶病毒；SrMV：高粱花叶病毒；SCYLV：甘蔗黄叶病毒；RSD：宿根矮化病菌；SYD：甘蔗杆状病毒；H2O：超纯水。
图4为实施例2中试剂盒的灵敏度检测结果；其中，1：8.0ng/μL；2：8.0×10-1 ng/μL；3：8.0×10-2 ng/μL；4：8.0×10-3 ng/μL；5：8.0×10-4 ng/μL；6：8.0×10-5 ng/μL；7：8.0×10-6 ng/μL；8：8.0×10-7 ng/μL；P：SCSMV阳性对照；N：SCSMV阴性对照。注：1～8均为感病甘蔗叶片总RNA的浓度。
图5为实施例2中不同蔗区样品的检测结果。其中，P为阳性对照，N为阴性对照，1为采自广东广州的甘蔗样品，2为采自广西崇左的甘蔗样品，3为采自广西崇左的甘蔗样品，4为采自四川内江的甘蔗样品，5为采自四川内江的甘蔗样品，6采自广西崇左的甘蔗样品，7为采自广东广州的甘蔗样品。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP试剂盒，包含一组检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP引物组、RT-LAMP反应体系、阴性对照液和阳性对照液。
其中，所述检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP引物组，由一对外引物对F3、B3和一对内引物FIP、BIP组成；所述F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:4所示。所述外引物对和内引物对的终浓度分别为0.2mM和1.6mM。
所述RT-LAMP反应体系包括12.5μL反应预混液和6μL超纯水。所述阴性对照液为不含SCSMV的甘蔗叶片总核酸，所述阳性对照液为含SCSMV的甘蔗叶片总核酸。
所述试剂盒的反应条件为65℃反应1h，4℃保存。
所述试剂盒的制备过程如下：
1、RT-LAMP引物设计与筛选
针对甘蔗线条花叶病毒的多聚蛋白基因（SCSMV-1，SCSMV-10，KT257307，JF488064）核苷酸保守序列及其与甘蔗花叶病毒（SCMV-NS-YD1）、高粱花叶病毒（SrMV-NS-YD29）的相应区域核苷酸的差异序列，通过大量研究，设计4组引物组，如表1所示：
表1 4组引物组的核苷酸序列
Figure DEST_PATH_IMAGE001
采用上述4组引物组分别对样品A（含有SCSMV）、样品81（含3种甘蔗病毒SrMV，SCMV，SCSMV）、样品B（超纯水）进行扩增，反应条件均为65℃水浴1h，4℃保存。
结果表明，如图1所示，仅SCSMV-P2可产生阳性结果，因此选择SCSMV-P2的外引物对和内引物对作为本发明检测甘蔗线条花叶病毒的引物组，所述外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示。
2、RT-LAMP反应体系
表2 RT-LAMP反应体系组分
Figure 631314DEST_PATH_IMAGE002
3、反应条件优化
用上述RT-LAMP反应体系对SCSMV标准样品进行扩增，扩增反应时间分别设定为45min、60min、75min。结果如图2所示，60min、75min条件下，扩增产物均呈黄色（阳性），电泳后呈梯状条带（阳性）；而45min条件下，扩增产物呈红色（阴性）或不明显的黄色（难以判断结果），电泳后呈不明显梯状条带或无条带（难以判断结果）。因此，扩增时间选择60min、70min均可，但从节省时间角度考虑，选取60min的反应时间。
扩增反应水浴温度分别设定为63℃、65℃、68℃。结果如图2所示，在反应时间为60min下，上述设定的3种水浴温度的扩增产物均呈黄色（阳性），电泳后均呈明显的梯状条带（阳性），但从考虑提高反应灵敏度及节省能源的角度，选择中间值为宜，因此扩增反应温度优选65℃。
一种甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：
1、采用CTAB法提取待测样品总核酸，并对核酸质量进行检测；
2、采用上述试剂盒进行逆转录环介导等温扩增反应；
3、将反应产物进行荧光染色，根据颜色来判断检测结果：若呈黄色则为阳性反应，待测样品中含有甘蔗线条花叶病毒；若呈红色则为阴性反应，待测样品中不含甘蔗线条花叶病毒。
实施例2 试剂盒的性能测试
一、特异性检测
按照实施例1中的检测方法，采用实施例1试剂盒分别对SCSMV阳性对照、SCSMV阴性对照以及含有甘蔗线条花叶病毒、甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗黄叶病毒、宿根矮化病菌、甘蔗杆状病毒和超纯水的样品进行检测，反应条件均为65℃水浴1h，4℃保存。
结果如图3所示，只有含SCSMV阳性对照和甘蔗线条花叶病毒的两个样品检测结果为黄色（阳性反应），其余均为红色（阴性反应），表明本发明所提供的引物对SCSMV的特异性强，准确率高。
二、灵敏度检测
按照实施例1中的检测方法，采用实施例1试剂盒分别对SCSMV阳性对照、SCSMV阴性对照以及浓度为8.0ng/μL、8.0×10-1 ng/μL、8.0×10-2 ng/μL、8.0×10-3 ng/μL、8.0×10-4 ng/μL、8.0×10-5 ng/μL、8.0×10-6 ng/μL、8.0×10-7 ng/μL感病甘蔗叶片总RNA中的SCSMV的样品进行检测，反应条件均为65℃水浴1h，4℃保存。
结果如图4所示，仅SCSMV阳性对照和浓度为8.0ng/μL、8.0×10-1 ng/μL、8.0×10-2 ng/μL、8.0×10-3 ng/μL、8.0×10-4 ng/μL的样品检测结果为黄色（阳性反应），其余均为红色（阴性反应），表明本发明试剂盒的灵敏度为可检测出浓度为8.0×10-4 ng/μL感病甘蔗叶片总RNA中的 SCSMV。
三、甘蔗样品的检测
按照实施例1中的检测方法，采用实施例1试剂盒分别对采自广西、广东、四川等我国主要蔗区的样品进行了检测，反应条件均为65℃水浴1h，4℃保存。
结果表明，阳性对照P及采集于广西崇左的2、3、6号样品为黄色（阳性反应）；阴性对照N及采集于广东广州的1、7号样，采集于四川内江的4、5号样均为红色（阴性反应）。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP试剂盒和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus)
<400> 1
ccagcgacaa catcaagcat 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus)
<400> 2
cgcccaatcg ttgaactgt 19
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus)
<400> 3
ggcggaacgt acagggattt cacaacgagt caagctggta gt 42
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus)
<400> 4
cgctcaaaac agaagccaag gcggcggctg atgaagagat g 41

Claims (8)

1.一组检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于，由一对外引物对F3、B3和一对内引物FIP、BIP组成；所述F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～SEQID NO:4所示。
2.权利要求1所述RT-LAMP引物组在制备甘蔗线条花叶病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
3.一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述检测甘蔗线条花叶病毒的RT-LAMP引物组。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述外引物对和内引物对的终浓度比为1：8。
5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应预混液、超纯水、阴性对照液、阳性对照液。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述阴性对照液为不含SCSMV的甘蔗叶片总核酸，所述阳性对照液为含SCSMV的甘蔗叶片总核酸。
7.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为65℃反应1h，4℃保存。
8.一种甘蔗线条花叶病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取待测样品总核酸；
S2.采用权利要求3～7任一所述试剂盒进行逆转录环介导等温扩增反应；
S3.将反应产物进行荧光染色，根据颜色来判断检测结果：若呈黄色则待测样品中含有甘蔗线条花叶病毒，若呈红色则待测样品中不含甘蔗线条花叶病毒。
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